Name: inducing polyp bail-out in coral colonies to obtain individualized micropropagates for laboratory experimental use
Uploaded: 2022-04-28T14:00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use at JoVE.com

アダム・バルノとフランシスカ・ガルシアがサンゴポリープの実験とモニタリングを支援してくれたことに感謝します。また、KAUST沿岸・海洋資源コアラボの水族館のメンテナンスとインフラに関するご支援にも感謝いたします。この研究は、KAUST助成金番号BAS/1/1095-01-01によって資金提供されました。

本研究では、スキューバがハンマーとチゼルを用いて潜水することにより、アル・ファハル礁(22.305118 N; 38.964568 E)からポシロポラ・ベルコササンゴ種に属するコロニーを採取した。コロニーの属は形態学的に同定され、その種は紅海からのポシロポラを含む以前に発表された研究に基づいてP. verrucosaとして分類され、遺伝的観点から、この地域に存在する種はP. verrucosa39,40であることを示している。アルファハル礁は保護された環境地域の一部ではなく、サンゴの収集に特別な許可は必要ありませんでした。コロニーは300Lの水槽に1ヶ月間保管された後、断片化され、ポリープが「救済」されました。水槽は、2つの水槽ヒーター、3つのポンプ、および2つの光源(材料表を参照)で26°Cに保たれ、12時間の光サイクルを維持した。水槽の温度は、2つのヒーターのそれぞれを温度調節器に接続することによって維持された。発光は午前6時に開始し、午後6時に終了するようにプログラムされ、230μmolの光子m−2s−1で午後12時にピークに達する放射照度曲線を生じた。
1.水分蒸発後の高塩分濃度によるポリープ救済
注:この方法は、Shapiroら25から適応されました。 Pocillopora verrucosaとは異なる種を使用する場合、切断する断片のサイズを決定する前に、ポリープのサイズを考慮する必要があります。
<ol><li>斜めの切断ペンチを使用して、サンゴのコロニーから小さな破片(長さ1cm未満)を切断します( 材料表を参照)。 注:使用しているサンゴの種類に応じて切削工具を適応させてください。斜めのペンチは、細い枝を持つサンゴを切るのに便利です。現在の研究では、各治療ごとに1つの断片を切断したが、断片の数およびサイズは、所望のポリープの数に応じて変化し得る。切断された断片のサイズは蒸発後の水の深さを超えてはならないので、サンゴはプロセスが完了した後も完全に水中にとどまります。</li>
	<li>切り取った破片を、サンゴのコロニーが順応した12mLの海水で満たされた小さなペトリ皿に入れます。これは、人工海水( 材料表を参照)または断片化前にサンゴコロニーが挿入されたのと同じ塩分濃度でろ過された海水であり得る。 注:破片を水で完全に覆うことが重要です。シャーレに12mLを入れても切断断片を覆うのに十分でない場合は、それに応じて容器と容量を最適化します。本研究では、利用された水を紅海から採取し、その塩分濃度はマルチパラメータメーターで測定した40PSUであった( 材料表参照)。</li>
	<li>プレートを周囲温度で約24時間開いたままにして、水が蒸発し、塩分濃度が徐々に増加するようにします。ポリープ間で組織の消化が観察可能な場合は、ステップ1.4に進みます。 注:インキュベーション時間が経過した後、水の塩分濃度は最初よりも約40%高くなければならず、ポリープは骨格から剥離する準備ができている必要があります。</li>
	<li>1 mLのトランスファーピペットを使用して、サンゴ組織の近くに穏やかな流れを作り出します。流れは、すでに骨格から周囲の組織を消化したポリープの完全な剥離をゆっくりと助けます。 注: ピペットで水流を作成すると、個別のポリープまたはポリープのグループがフレークとしてスケルトンから取り外される必要があります。代わりに白濁した物質が剥がれると、それは組織の死または崩壊を示し、それはサンゴがあまりにも長い間、またはあまりにもストレスの多い状態(この場合は高い塩分濃度)でインキュベートされたことを意味します。より強い流れがポリープに物理的な損傷を与える可能性があるため、ポリープを取り外すために穏やかな水の流れを作ることは非常に重要です。</li>
	<li>ピペットを使用して、シャーレ内の水を等沸水(ステップ1.2と同じ水を使用)とゆっくりと交換します。10分間の50%の水交換は、ポリープをストレスの多い塩分濃度の状態に戻すのに十分です。 注:紅海のポシロポリッド種 ポシロポラ・ベルコサ のサンゴコロニーが使用されたため、このユニークな環境からのサンゴがどの特定の条件下で救済されるかを決定するためのテストが行われました。他のほとんどのサンゴ礁環境と比較して、紅海の高い塩分濃度を強調することが重要です。</li>
</ol>2. 高塩分濃度海水供給によるポリープ救済
注:この方法はChuangら27から適応された。
<ol><li>塩分濃度プローブで測定し、塩分濃度が85%増加するまで海水にNaClを加えて塩分濃度の高い海水を3L用意する。 注:現在の研究では、紅海からの40 PSU海水から74 PSUの高塩分濃度海水が調製されました。</li>
	<li>手順1.1で説明したようにサンゴの小さな破片を切断します。</li>
	<li>切断した破片を、蠕動ポンプに接続された3Lの等沸性海水(この場合、サンゴのストレスの多い塩分濃度のない海水、ステップ1.2で使用したものと同じ)で満たされた10L容器に入れます( 材料表を参照)。 注:サンゴの健康をよりよく維持するために、温度コントローラ、エアポンプ、およびライトを追加して、コロニーが以前に暴露されたのと同じ水槽の状態をシミュレートすることができます。本作業におけるインキュベーションの間、サンゴ断片を26°Cの容器に保持し、毎日12時間の光サイクル下で保持した。水の動きと温度の均質化は、エアポンプによって維持されました。</li>
	<li>工程2.1で調製した高塩分濃度海水を、蠕動ポンプで126mL/hの速度で24時間、サンゴの破片を入れた容器に充填します。塩分濃度を約40%増加させて合計3Lの水を加えます。 注:塩分濃度の高い水は、意図した塩分濃度に達するまで海水にNaClを加えるだけで生成できます。</li>
	<li>ピペットで穏やかな水流を作り、ポリープを骨格から解放します(ステップ1.4)。</li>
	<li>ポリープが入っている水をゆっくりと等沸水に交換する(ステップ1.5)。次に、手順 4 または手順 5 に進みます。</li>
</ol>3. カルシウムフリー海水インキュベーションによるポリープ救済
注:この方法は、Pang et al.24から適応されました。
<ol><li>脱イオン水1LにNaCl26.29g、KCl0.872g、MgSO42g、MgCl21.94g、Na2SO43.42g、NaHCO30.286g(材料表参照)を加えて、カルシウムフリー人工海水(CaFSW)溶液を調製する。 注:このソリューションは、40 PSUの塩分濃度に適合したサンゴにより適しているように、以前のプロトコルから調整されました。他の塩分濃度条件に適応したサンゴの場合、同じ割合の塩を使用しますが、溶質の総質量を調整して、使用中のサンゴにより適した塩分濃度を得ます。</li>
	<li>手順 1.1 で説明したようにサンゴの小さな断片を切断します。</li>
	<li>サンゴの破片を以前に調製したCaFSWで満たされたペトリ皿に沈め(ステップ3.1)、80rpmの回転速度で3時間軌道インキュベーターでインキュベートします。 注:繰り返しますが、フラグメントを完全に水で覆うことが重要です。シャーレで断片を覆うのに十分でない場合は、実験の必要性に応じて容器と容量を最適化します。</li>
	<li>断片を、20%ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)と40 PSU人工海水で調製した100 mg/mLのアンピシリン溶液( 材料表を参照)で満たされたペトリ皿または6ウェルプレートに移します。断片を26°Cおよび80rpmでインキュベートし、ポリープと個々のポリープとの間の組織消化が観察可能になるまで毎日培地を交換し、骨格から剥離し始める。 注:ほとんどの場合、組織消化はこの培地でのインキュベーションから20時間以内に完了し、交換は必要ありません。</li>
	<li>ピペットを用いて初期回収のためにポリープを滅菌海水に移す。1時間のインキュベーション後、ステップ4またはステップ5に進みます。</li>
</ol>4. ペトリ皿のポリープ維持
<ol><li>ポリープが非ストレス性塩分濃度でろ過された海水に戻されたら、実体顕微鏡下で毛様体の流れによって引き起こされる組織の完全性と動きを観察して、生存可能なポリープを選択します。</li>
	<li>選択したポリープをガラスまたはプラスチックのペトリ皿に入れ、ポリープが皿から浮かび上がらないようにプランクトンネット(200μmメッシュサイズ、 材料表を参照)でペトリ皿を覆います。 メモ: メッシュネットのサイズは、ポリープのサイズによって異なります。ネットはポリープよりも小さく、水の交換と光の浸透を可能にする毛穴を持たなければならないことに注意することが重要です。</li>
	<li>使用するサンゴ種に適した条件で水槽内にペトリ皿を置きます。 注:本研究では、条件は26°Cで40 PSUろ過海水と12時間の光サイクルでした。</li>
	<li>少なくとも週に1回はペトリ皿を開けて水を新しくし、皿をきれいにします。このステップは、有毒化合物を局所的に放出することによってサンゴポリープと競合または損傷する可能性のある藻類の過剰増殖を排除するために重要です。</li>
</ol>5. インキュベーター内のポリープメンテナンス
<ol><li>ステップ4.1で説明したように、生存可能なポリープを選択します。</li>
	<li>移送ピペットを用いて、50mLの等沸性海水で満たされた75cm2表面細胞フラスコにポリープを置く。 注:今回の作業では、紅海から採取したろ過海水をポリープのメンテナンスに使用しました。ステップ1.2で使用した水と同じ特性の水を使用できます。</li>
	<li>フラスコを閉じ、インキュベーターに移動します。インキュベーターを26°C、40rpmで12時間の光サイクルに設定します。4日ごとに水量の50%を交換し、壁に藻類やバイオフィルムがいっぱいになったら、内容物をきれいなフラスコに移します。 注:画像は、代表的な結果のためにHDカメラ( 材料表を参照)を備えた完全アポクロマチックズームシステムでキャプチャされました。</li>
</ol>

著者らには開示するものは何もありません。

救済プロセスに提出された後のポリープ生存率とプロセスが完了するために必要な時間は、以前に報告された研究25、33、41によって異なり、これはおそらく各研究で適用された異なる実験的アプローチによって説明される。例えば、異なるサンゴ種、または同じ種のサンゴでさえ、異なる環境条件(例えば、紅海からのサンゴ)に順応しており、塩分濃度レベルに対する異なる閾値を提示する。救済方法の選択と実験室/水槽の状態も結果に重要な役割を果たします。いくつかのケースでは、実験室条件下でのサンゴのマイクロ増殖の維持は、アゾキサンジェレート3 3,41および褐虫藻2 5サンゴにおける生存の数ヶ月に達することによって、サンゴ細胞培養の生存時間を超えている。ポリープ救済プロセスが完了するまでの時間は、数時間2 5,2 7,30から、救済を引き起こす責任があるストレッサーに曝露されたインキュベーションの週3 5まで、さまざまな研究でも変化している。ポリープ救済を研究する際に考慮すべきもう1つの変数は、ポリープの放出を引き起こした急性ストレスにさらされた後のポリープの回復です。救済後のポリープがサンゴの生物学を研究するためのモデルとして使用できるほど良好な状態にあるかどうかはまだ議論の余地があります。コエノサークの分解後のそれらの組織の回復は、これらのマイクロプロパゲートを使用する場合の懸念事項である。しかし、現在を含む多くの研究におけるポリープは、救済の数週間後に無傷の口腔 - 腹部分極および触手を有する組織および外部形態の内部に褐虫藻細胞を提示することができた25、27、32、36。以前の研究では、急性ストレスから解放された後、高度に生理食塩水または加熱された海水にさらされたサンゴポリープが、アポトーシス、タンパク質分解、細胞分裂などのプロセスに関連する遺伝子の発現を救済前に見つかったレベルと同様のレベルに回復することができた32,36、さらには組織治癒に関連する遺伝子の発現を増加させることさえできた36。
方法間の生存率の違いに関しては、同じ技術が使用されても、今回は異なる実験間で異なる可能性があり、使用される断片の健康および救済プロセス後のポリープの適切な維持に関連し得ることを強調することが重要です。カルシウムを含まない海水インキュベーションによる救済の場合、ポリープの生存期間は1日に制限された。したがって、この方法は研究された種の長期生存にはあまり適していない、または紅海からの P. verrucosa サンゴのための技術のより良い適応がなされなければならないと結論付けることができる。報告された結果は、ポリープが高塩分濃度水の滴下を受けたときに、塩分の漸進的な増加に基づく方法でより長い生存時間が得られたことを示した。この方法は、蒸発法よりも塩分濃度のより制御された増加をもたらすことができると同時に、生物にとって潜在的に有毒であるサンゴの代謝廃棄物を含む海水中に見られる他の物質の濃度の増加に責任を負わない。これらすべての理由から、この方法は、健康なポリープ27を維持するためのより安全な代替手段として提案されている。この方法は、ポリープの健康にとってより安全で、より長生きするポリープを産生することができると仮説されているが、この現在の出版物で裏付けられた事実は、それを確認するために追加の調査が必要である。両方の高塩分濃度誘発救済実験は、塩分濃度が24時間で59 PSUに達した後、ポリープの完全な剥離を実証した。塩分濃度が救済が完了したレベルを超えて増加すると、ポリープにさらなるストレスが引き起こされ、急性ストレス治療から生き残り、回復する可能性が減少します。したがって、このような塩分濃度レベルでポリープをより長く維持することは推奨されない。カルシウムを含まない海水への曝露によって救済誘導法を行う場合、カルシウムを含まない人工海水中での3時間のインキュベーションから完全な剥離が得られたため、この培地へのさらなる曝露も推奨されない。
実験室/インビトロ調査における サンゴポリープの研究により適した方法に対処するために、この研究は、救済プロセスが完了するまでに24時間近くかかった3つの手順にのみ焦点を当て、強皮性サンゴからのサンゴポリープの長期維持を含む研究で使用されました。この時間よりもかなり長くかかると報告された他の方法は従事していなかった。基質へのポリープの沈降は、異なる環境に移すことができるか、使い捨てピペットを使用して分析のために容易に収集することができるポリープの生産に焦点を当てたこの研究では試みられなかった。結果は、サンゴ種 P. verrucosa のポリープが、基質への付着がなくても、最大8週間、関連する褐虫藻細胞、健康な視覚状態、および保存された肉眼的外部解剖学的構造とともに、生存し続けたことを実証した。これらの結果は、この研究で実証された技術のいくつかを使用して、単一のサンゴの断片からより多くの生物学的複製を生成できることを示しています。このような生物学的複製は、制御された環境(シャーレや細胞フラスコなど)に保持し、1ヶ月間の実験のために実験室条件で維持し、いくつかの目的に使用することができる。
ポリープ救済42,43の最初の付随的な記述以来、ポリープ放出を誘導し、そのようなポリープを生きたまま維持するためのより標準化された方法を見つけるために、新しいプロトコルが確立され、将来の研究用途に使用することができる。これらには、サンゴホロビオント生理学44および宿主-マイクロバイオーム相互作用45に関連するさまざまな側面、サンゴの漂白5,25に関与する分子メカニズム、およびサンゴホロビオントの健康、回復力、および保護12,13,46,47の調査が含まれる。.さらに、放出されたサンゴポリープは、研究の領域外の用途に使用でき、基質に付着して成長することができるプロパグルの作成に有用であることが示唆されており、救済のための標準化されたプロトコルが普及すれば、修復目的で使用できる複数のサンゴ個体を作成する可能性があります28.全体として、方法論を標準化するために、救済ポリープを用いたより詳細な実験を行うべきであるが、ポリープ救済は、いくつかの目的のためにサンゴ研究のツールとして適用することができる再現可能なアプローチであることが示されている。

スクレラクチニアンまたは造礁サンゴは、炭酸塩骨格を形成し、サンゴ礁を作り出し、深い水域から浅瀬の環境まで見つけることができる構造的に複雑な生態系を作り出すことができるクニダリアンです1。熱帯サンゴ礁は高い生物多様性をホストし、沿岸保護や漁業維持などの不可欠な生態系サービスを提供しています2。ほとんどの浅瀬造礁サンゴは、サンゴが骨格を構築するために必要なエネルギーを提供するSymbiodiniaceae科の藻類との相互主義的な関係に依存しています。サンゴと藻類の共生は環境ストレスによって壊れ、サンゴの白化を引き起こします3,4,5,6。最近の気温異常は、世界中で主要なサンゴの白化イベントを引き起こし、サンゴの大量死亡率とサンゴ礁の恒久的な劣化7,8,9,10,11につながっています。この現象は、アポトーシス、オートファジー、エキソサイトーシスなどの熱ストレス後の細胞機構による共生生物の追放に基づいているため、サンゴの漂白は生態系規模の結果をもたらす細胞プロセスとして記述することができ、5,6,12、これはサンゴの細胞または組織の体外培養物を有することがこの現象を詳しく研究するために適用可能であることを意味する。
サンゴ礁の重要性と、特に過去20年間に直面してきた主要な脅威2のために、サンゴは世界中の保護と修復の目的のための研究の焦点となっています13。しかし、サンゴを研究するための信頼性が高く、再現性があり、環境への影響を最小限に抑えるアプローチと実験システムの開発は、この分野における大きな闘争です。
マイクロプロパゲーションは、制御された血管14、15においてその生物学的物質を培養することによる生物の遺伝子型のインビトロ増殖として定義される。細胞、組織、臓器の培養は、ここ数十年にわたって植物や動物の生物学にとって極めて重要でした。これにより、実験室での生物の大量繁殖、さまざまな治療法(医薬品や医薬品など)の迅速な評価、細胞機能の直接研究が可能になります14,15,16,17。一般に、in vitroモデルは、よりよく制御された物理的および化学的条件下での異なる生物の研究を補完し、深化させるために有用であった。インビトロ培養技術の利点のために、異なる動物細胞および組織培養技術が開発され、最適化され、そして多くの研究分野で重要なツールとして使用され、そこでは複数の細胞株が多数の用途のために研究されそして商品化されてきた16、17、18。
1882年の最初の動物組織培養以来、細胞および組織培養の知識において多くの進歩がなされてきた17、例えば、天然および合成培地の使用、確立された細胞株の発明、および多数の細胞型をより良い方法で培養するための3D培地の開発など16,17、18,19。しかしながら、細胞生物学の分野は、主にモデル生物の選択されたグループに焦点を当ててきたが、多くの分類群は、細胞、組織、または器官の十分に確立された体外培養をまだ有していない20。例えば、サンゴの研究では、不死化細胞株は研究に広く使用されておらず、サンゴ細胞の研究を初代細胞培養物の使用に制限しています。これらの培養物の生存率は数週間21に制限されており、2021年の初めまで13日以上にわたってすべてのサンゴ組織からの個々の細胞の生存を記録した研究はありません22。出版される持続可能なサンゴ細胞株の最初の報告は、6ヶ月まで生きたAcropora tenuis細胞に関するものであり、将来の研究のためのこれらの細胞の有用性は調査されていない23。
サンゴ細胞培養の培養における限界を克服し、サンゴの組織組織全体を保存する実験室培養を維持するために、単離されたポリープの使用がサンゴ生物学研究のモデルとして最近提案されている24,25。ポリープはサンゴの解剖学的単位であり、それらの各々は、口腔円盤の中心に位置する口を有し、その腹部領域26におけるコエノサークによって他のポリープと接続されている。生きたポリープの分離は、急性ストレスがポリープ間のコエノサークの消化を引き起こし、コロニーの骨格から剥離することができるポリープ救済のプロセスによって自然に起こる25,27,28。この現象は、オクトサンゴ29、30、31、黒サンゴ32、および強皮サンゴ25、27、28、32、33を含む様々な分類群で起こることが報告されており、水中のカルシウム不足24、34、酸度の増加35などの複数の環境ストレス要因と関連している。高浸透圧条件25、27、32、36、高温36、37、飢餓33、空気暴露25、30、および殺虫剤汚染28、38。ポリープ救済は、例えば、世界中に広く分布し、サンゴ研究のモデルとして一般的に使用されているポシロポリッドサンゴ19で報告されています。このグループに属する種、例えばポシロポラ・ダミコルニスおよびスタイロフォラ・ピスティラタは、5mm断片25から約30〜40個のマイクロプロパゲートを生成している。この数字は、サンゴの小さな部分から多くの遺伝的に同一の個体を生成する可能性を作り出すので、サンゴの微小繁殖のための方法としてポリープ救済を使用する利点を強調しています。研究のための単離ポリープの使用はまた、フラスコやペトリ皿などの制御された実験室環境で培養される可能性に関して、細胞培養と同じ利点を有する。さらに、生きたポリープを維持するためのマイクロ流体プラットフォームは、これらのマイクロ増殖物が、制御された水流、表面、および温度24,25で、比較的安価で再現しやすい環境に保持できることを実証しました。これらのマイクロフルイディクスプラットフォームは、顕微鏡下で生きたサンゴ構造を直接視覚化するためにも使用できます24,25。
本稿では、個々のサンゴポリープをコロニーから単離するために開発された技術を要約して実証し、長期培養のために実験室条件下でそれらを維持する方法を示す。議論された方法には、蒸発および高塩分濃度海水のポンピングによる高浸透圧条件によるポリープ救済およびカルシウムを含まない海水中でのインキュベーションが含まれる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5560 Conductivity/Temperature Probe</td>
			<td>YSI</td>
			<td>5560</td>
			<td>Conductivity probe used with the ProQuatro Multiparameter meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ace 5 in. Alloy Steel Diagonal Pliers</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td>2004083</td>
			<td>Used to cut coral fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td>Used in DMEM medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Used for incubating coral fragments in the calcium-free polyp bail-out method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, Polystyrene</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>Petri dish used for bail-out by evaporstion and for keeping polyps inside an aquarium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 Watt</td>
			<td>Schego</td>
			<td>548</td>
			<td>Heaters used in aquarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite Version 4.2</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software used for image capture in demonstrative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica IC80 HD</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>12730216</td>
			<td>Camera used to take demonstrative results pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MDG33</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10 450 123</td>
			<td>Stereoscope stand used to take demonstrative results pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Z6 APO</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Macroscope used to take demonstrative results pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex I/P Easy-Load Pump Head for Precision Tubing, White PPS Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-77602-10</td>
			<td>Peristaltic pump head.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Modular Drives with Benchtop Controller</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-07557-00</td>
			<td>Peristaltic pump drive used for pumping high salinity seawater. Can be substituted for any peristaltic pump capable of mainaining water flow as described in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 16; 25 ft</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-96410-16</td>
			<td>Tubing for peristaltic pump.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex 33 mm PVDF 0.22 &#181;m Sterile RUO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>Used to filter artificial sea water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>Flask usually used for cell culture used for polyp culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker, Advanced 5000, VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-2916</td>
			<td>Shaker used inside incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percival Incubator - I-22VL</td>
			<td>Percival</td>
			<td>NA</td>
			<td>Incubator used for maintaing corals kept in cell flasks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plankton net 200 &#181;m mesh size</td>
			<td>KC Denmark</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for covering petri dishes containing coral polyps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProQuatro Multiparameter Meter</td>
			<td>YSI</td>
			<td>606950</td>
			<td>Used for measuring salinity thoughout the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RADION XR15 G5 PRO</td>
			<td>Ecotech</td>
			<td>NA</td>
			<td>Lights used in aquarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Sea Salt 
			Premium grade, moderate Alkalinity</td>
			<td>Red Sea</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to prepare 40 PSU artifical sea water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfate Anhydrous</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>7757-82-6</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRD 112 thermostat</td>
			<td>Schego</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermostat used in aquarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbelle Nanostream 6025</td>
			<td>Tunze</td>
			<td>6025 000</td>
			<td>Pumps used in aquarium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing polyp bail-out in coral colonies to obtain individualized micropropagates for laboratory experimental use

サンゴは、ポリープと呼ばれるモジュラーユニットによって形成された植民地時代の動物です。サンゴポリープは生理学的に組織によって結合され、接続されています。ポリープ救済の現象は、急性ストレスによって誘発されるプロセスであり、サンゴポリープがコロニーの残りの部分に接続している組織を消化し、最終的に骨格から剥離して別々の個体として生き続ける。サンゴの生物学者は何年もの間、ポリープ救済のプロセスを認めてきましたが、このプロセスによって生成されたマイクロプロパゲートは、サンゴ生物学研究のモデルシステムとして認識されています。ポリープ救済の使用は、単一のサンゴの断片から多数のクローン単位を作り出すことができる。もう1つの利点は、単一のポリープまたはポリープのパッチを顕微鏡下で容易に視覚化し、ペトリ皿、フラスコ、マイクロ流体チップなどの高度に標準化された低コスト環境で維持できることです。本プロトコルは、サンゴの微小繁殖を誘導することができる再現可能な方法と、単一のポリープを長期的に生き続けるための異なるアプローチを実証する。この方法論は、救済後最大8週間、サンゴ種ポ シロポラ・ベルコサ のポリープを首尾よく栽培することができ、個々のサンゴポリープをサンゴ研究に使用する実用性を示した。

ポリープ救済は、以下の3つの異なる方法に従って種P. verrucosaの単一コロニーに属するサンゴ断片において誘導された(図1)。水蒸発後の高い塩分濃度によって誘発された救済は、最初に40 PSUで水で満たされた周囲温度でペトリ皿にサンゴの破片を24時間インキュベートした後に完了し、プロセスが終了すると59 PSUの最終塩分濃度に達しました(図2A-C、I)。塩水供給による救済は、最初に40 PSUで水中でインキュベーションした24時間後にも到達し、12時間後に52 PSUの塩分濃度に達し、24時間後にプロセス終了時に59 PSUの塩分濃度に達しました(図2D-F、I)。両方の実験において、塩分濃度の増加は、ポリープによる組織消化の誘導の原因であった。12時間後、塩分濃度の高い状態は、コエノサークの漸進的な薄化と併せてポリープの収縮を引き起こし、最終的に24時間後にポリープの最終的な剥離を引き起こした。カルシウムを含まない海水中でのインキュベーションによる救済誘導は、CaFSW中での3時間のインキュベーションの後に完了し、続いて20%DMEM培地中での20時間のインキュベーション後に完了した(図2G-H)。組織は、個別化されたサンゴポリープ(図3A-C)および「組織ボール」が生成されるまで、ピペットで押しのけた後、3つの方法すべてにおいて骨格から剥離した。
剥離後、3つの方法すべてからポリープを回収し、ネットまたは細胞フラスコで覆われたペトリ皿に割り当てられる前に海水中で回収させた。蒸発および給水方法から得られたポリープは、水槽内のシャーレで維持され、それぞれ6週間および8週間生存した(図3Dおよび図3F)。これらのマイクロ増殖は、ポリープの通常の解剖学的構造を保持し、触手、基底円盤、および口1を提示する。カルシウムを含まない海水中でのインキュベーションによって得られたポリープは、寿命が短く、1日まで生存し、その後組織が解離した。インキュベーター内の細胞培養フラスコに保管された海水蒸発法から得られたポリープは、組織の解離なしに最大3週間生存した(図3F)。いずれの場合も、ポリープは基質に付着できなかったが、視覚的に健康で色を維持しており、褐虫藻細胞は依然として組織内で見えていた1。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig01v2.jpg"> 図1:ポリープ救済誘導のための3つの異なる試験方法論の概略表現(左)に続いて、実験室条件下で獲得ポリープを維持するための2つの方法の図(右)を図示する。(B)高塩分濃度海水供給によるポリープ救済の方法論の表現。(C)カルシウムフリー海水インキュベーションによるポリープ救済の方法論の表現。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig02.jpg"> 図2:サンゴ種P. verrucosaの断片を用いた3つの異なる方法論によって誘導されたポリープ救済プロセスの画像。 (A-C)インキュベーション後0時間、12時間、および24時間のサンゴ断片を、それぞれ、水蒸発法を用いてシャーレ中で行った。(D-F)インキュベーション後0時間、12時間、24時間でサンゴ片を、それぞれ塩分濃度の高い海水供給法を用いた。(G,H)前後にカルシウムフリー海水インキュベーション法に曝露されたサンゴ断片は、それぞれ。カルシウムを含まない人工海水中でのインキュベーションは3時間、20%DMEMでは21時間であった(I)水分蒸発および高塩分濃度海水供給救済誘導法の間の経時的な海水のPSU中の塩分濃度値のグラフ化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig03.jpg"> 図3:3つの実証された救済誘導手順から得られたP. verrucosa ポリープの画像。 (A-C)蒸発、塩水供給、およびカルシウムフリー海水法から得られたポリープの画像は、それぞれ骨格から剥離した直後にキャプチャされた。(d)ペトリ皿で6週間生存した後の蒸発法から得られたサンゴポリープの画像。(e)シャーレ中で8週間生存した後の塩水供給法から得られたサンゴポリープの画像。(f)細胞培養フラスコ中で3週間生存した後の蒸発法から得られたサンゴポリープの画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use

ポリープ救済は、急性ストレスによって誘発されるプロセスであり、サンゴポリープがコロニーに接続している組織を消化し、そこから剥離して個体として生きる。本プロトコルは、ハイパー生理食塩水またはカルシウムフリー海水処理を用いた救済によってサンゴのマイクロプロパゲーションを誘導する方法を記載している。

サンゴのコロニーでポリープ救済を誘導して、実験室での実験的使用のための個別化されたマイクロ増殖物を得る

Corals are colonial animals formed by modular units called polyps. Coral polyps are physiologically linked and connected by tissue. The phenomenon of ...

サンゴのマイクロプロパゲーションはまだ初期段階にあります。ポリープ救済のためのプロトコルを最適化することは、科学者が実験室環境でサンゴを研究するためのモデルとしてポリープを使用できるようにするために、このギャップを埋めるための鍵です。ポリープ救済は、小さなサンゴの破片から複数の伝播を作成することを可能にします。ポリープは、例えば、サンゴの微視的なプロセスの観察を容易にするさまざまな実験に使用することができます。サンゴ礁が脅かされています。私たちの目標は、この複製可能なモデルを使用して、サンゴを白化やその他の環境上の脅威から効率的かつ非侵襲的な方法で保護するための戦略を開発することです。この方法は、サンゴの生理学、宿主のマイクロバイオーム相互作用、および漂白に関与するメカニズムの調査に役立つ可能性があります。このような知見は、例えば、サンゴプロバイオティクスの最適化に貢献することができる。適切な塩分濃度の海水を使用することが鍵です。塩分濃度はサンゴの自然環境のレベルから始まり、ストレスが過度に有害でないようにゆっくりと増加しなければなりません。正しい瞬間にポリープを収集し、最も無傷のポリープを選択することは、彼らの生存にとって非常に重要です。視覚的なデモンストレーションは、これらの手がかりを理解するために不可欠です。まず、斜めの切断ペンチを使用してサンゴのコロニーから小さな破片を切断し、サンゴのコロニーが順応した12ミリリットルの海水で満たされた小さなペトリ皿に入れます。プレートを周囲温度で約24時間開いたままにして、水が蒸発し、塩分濃度が徐々に増加するようにします。ポリープ間で組織の消化が観察可能な場合は、1ミリリットルの移送ピペットを使用して、サンゴ組織に近い穏やかな流れを作り出します。この流れは、骨格から周囲の組織をすでに消化したポリープの剥離をゆっくりと完了させ、ピペットでペトリ皿の水を等沸点水でゆっくりと交換します。塩分濃度の高い海水を調製するには、通常の海水を取り、海水に塩化ナトリウムを加えて塩分濃度が85%上昇するまで3リットルの高塩分濃度海水を調製する 前述のようにサンゴの小さな断片を切断した後、蠕動ポンプに接続された3リットルの等沸性海水を入れた10リットルの容器に入れます。この容器に、予め用意した塩分濃度の高い海水3リットルを1時間126ミリリットルの割合で24時間充填し、塩分濃度を約40%上昇させるピペットを用いて、ポリープを骨格から放出する穏やかな水の流れを作ります。容器内の水を等沸性の海水とゆっくりと交換します。脱イオン水1リットルに塩化ナトリウム26.29グラム、塩化カリウム0.872グラム、硫酸マグネシウム2.16グラム、塩化マグネシウム11.94グラム、硫酸ナトリウム3.42グラム、炭酸水素ナトリウム0.26グラムを加えてカルシウムフリー海水を調製し、このカルシウムフリー海水でシャーレを満たします。小さなサンゴの破片を切った後、ペトリ皿のカルシウムを含まない海水に浸します。皿を回転数80rpmの回転数で3時間オービタルインキュベーターに入れ、その後、40実用的な塩分単位の人工海水で調製され、アンピシリン1リットルあたり100ミリグラムを含む20%DMEMで満たされたペトリ皿に断片を移す。断片を摂氏26度および80rpmでインキュベートする。ポリープと個々のポリープの間で組織消化が観察可能になるまで毎日培地を交換し、その後、ポリープを滅菌海水に移し、1時間インキュベートする。ポリープが非ストレス性塩分濃度でろ過された海水に戻されたら、実体顕微鏡下で毛様体の流れによって引き起こされる組織の完全性と動きを観察して、生存可能なポリープを選択します。選択したポリープをシャーレに入れ、ポリープがディッシュから浮かび上がらないように、200マイクロメートルメッシュサイズのプランクトンネットでペトリ皿を覆います。使用するサンゴ種に適した条件で水槽の中にペトリ皿を置きます。藻類の過増殖を防ぐために、少なくとも週に1回はペトリ皿を開けて水を新しくし、皿をきれいにしてください。前述のようにポリープを選択した後、トランスファーピペットを用いて、50ミリリットルの等沸性海水で満たされた75平方センチメートルの表面セルフラスコに入れ、フラスコを閉じ、12時間の光サイクル、摂氏26度および40rpmに設定したインキュベーターに入れる。フラスコが藻類またはバイオフィルムで満たされた場合は、内容物を清潔なフラスコに移します。この研究では、ポリープ救済は3つの異なる方法によって誘導された。水分蒸発法は、インキュベーションの24時間以内に完全な救済をもたらし、塩分濃度は24時間後に40から59の実用的な塩分単位に増加した。塩水供給法はまた、24時間のインキュベーション後にポリープ救済をもたらした。ここで、塩分濃度は、12時間のインキュベーション後に40から52の実用的な塩分濃度単位に増加し、24時間後に59の実用的な塩分濃度単位に増加した。カルシウムを含まない海水中でのインキュベーションによる救済誘導は、その中のポリープの3時間のインキュベーション、続いて20%DMEM培地での20時間のインキュベーションの後に完了し、3つの方法すべてにおいて、個別化されたサンゴポリープを生成することができた。蒸発法で発生したサンゴポリープは6週間生存できるのに対し、塩分濃度の高い海水供給法で発生したサンゴポリープは水槽内のシャーレで8週間生存できます。インキュベーター内の細胞培養フラスコに保管された海水蒸発法から得られたポリープは、組織の完全な解離なしに最大3週間生存した。ポリープを骨格から切り離すときは、優しくすることが重要です。完全に剥離していない場合、水を強くピペッティングして強制的に剥離させると、損傷を引き起こし、生存率が低下します。これらの方法を用いて、ポリープの沈降を誘導することができる。ポリープの決済は、その石灰化と成長プロセスに関する質問に答えることができます。ポリープ救済誘導の開発後、研究者はサンゴ骨格の初期形成を研究し、ポリープスケールのサンゴの白化を直接視覚化することができました。

Research

JoVE Journal

Biology

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