Name: inducing polyp bail-out in coral colonies to obtain individualized micropropagates for laboratory experimental use
Uploaded: 2022-04-28T14:00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use at JoVE.com

Мы благодарим Адама Барно и Франциску Гарсию за их поддержку в экспериментах и мониторинге коралловых полипов. Мы также благодарим KAUST Coastal & Marine Resources Core Lab за помощь в обслуживании аквариумов и инфраструктуре. Исследование финансировалось за счет гранта KAUST No BAS/1/1095-01-01.

Для настоящего исследования колония, принадлежащая к видам кораллов Pocillopora verrucosa, была собрана с рифа Аль-Фахаль (22.305118 N; 38.964568 E) SCUBA путем погружения с использованием молотка и зубила. Род колонии был идентифицирован морфологически, а его вид был классифицирован как P. verrucosa на основе ранее опубликованных работ, в том числе Pocillopora из Красного моря, что указывает на то, что с генетической точки зрения вид, присутствующий в этой области, является P. verrucosa39,40. Риф Аль-Фахал не является частью охраняемой экологической зоны, и для сбора кораллов не требовалось никаких специальных разрешений. Колония содержалась в аквариуме объемом 300 л в течение месяца, прежде чем была фрагментирована и ее полипы «спасены». Аквариум поддерживался при температуре 26 °C с двумя аквариумными обогревателями, тремя насосами и двумя источниками света (см. Таблицу материалов), поддерживая 12-часовой световой цикл. Температуру аквариума поддерживали путем подключения каждого из двух нагревателей к регулятору температуры. Световое излучение было запрограммировано на начало в 6 утра и окончание в 6 часов вечера, создавая кривую излучения, которая достигала максимума в 12 часов дня с фотонами 230 мкмоль м−2с−1.
1. Выдерживание полипа высокой соленостью после испарения воды
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был адаптирован из Shapiro et al.25. При использовании других видов, чем Pocillopora verrucosa, размер полипов следует учитывать перед определением размера разрезаемого фрагмента.
<ol><li>Вырезайте небольшие фрагменты (менее 1 см в длину) из колонии кораллов с помощью диагональных плоскогубцев (см. Таблицу материалов). ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптируйте режущие инструменты в соответствии с используемыми видами кораллов. Плоскогубцы полезны для резки кораллов тонкими ветвями. В текущем исследовании один фрагмент был вырезан для каждого лечения, но количество и размер фрагментов могут варьироваться в зависимости от количества желаемых полипов. Размер разрезанных осколков не должен превышать глубину воды после испарения, поэтому кораллы остаются полностью внутри воды после завершения процесса.</li>
	<li>Поместите разрезанные фрагменты в небольшие чашки Петри, наполненные 12 мл морской воды, к которой приспособилась коралловая колония. Это может быть искусственная морская вода (см. Таблицу материалов) или отфильтрованная морская вода с той же соленостью, в которую коралловая колония была вставлена до фрагментации. ПРИМЕЧАНИЕ: Важно полностью покрыть фрагмент водой. Если 12 мл в чашке Петри недостаточно для покрытия разрезанного фрагмента, оптимизируйте контейнер и объем соответственно. В настоящем исследовании используемая вода была собрана из Красного моря, и ее соленость составляла 40 ПСУ, измеренная многопараметровым метром (см. Таблицу материалов).</li>
	<li>Оставьте пластину открытой в течение ~ 24 ч при температуре окружающей среды, чтобы вода могла испариться и ее соленость могла постепенно увеличиваться. Когда между полипами наблюдается переваривание тканей, перейдите к шагу 1.4. ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как время инкубации прошло, соленость воды должна быть примерно на 40% выше, чем в начале, и полипы должны быть готовы к отделению от скелета.</li>
	<li>Используя передаточную пипетку объемом 1 мл, создайте мягкий поток рядом с коралловой тканью. Поток будет медленно помогать полному отсоединению полипов, которые уже переварили ткани вокруг себя от скелета. ПРИМЕЧАНИЕ: Когда поток воды создается с пипеткой, отдельные полипы или группы полипов должны отрываться от скелета в виде хлопьев. Если вместо этого отрывается мутное вещество, это указывает на гибель или распад тканей, что означает, что кораллы инкубировались слишком долго или находились в слишком стрессовом состоянии (в данном случае высокая соленость). Очень важно сделать мягкий поток воды, чтобы отделить полипы, так как более сильный поток может привести к их физическому повреждению.</li>
	<li>Медленно замените воду в чашке Петри изосмотической водой (используйте ту же воду, что и на шаге 1.2.) с помощью пипетки. 50% водообмена в течение 10 минут достаточно, чтобы акклиматизировать полипы обратно к нестрессовому состоянию солености. ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку использовались коралловые колонии поциллопоридных видов Pocillopora verrucosa из Красного моря, были проведены тесты, чтобы определить, при каких конкретных условиях кораллы из этой уникальной среды спасутся. Важно подчеркнуть высокую соленость Красного моря по сравнению с большинством других рифовых сред.</li>
</ol>2. Спасение полипа высокой соленостью морской воды
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был адаптирован из Chuang et al.27.
<ol><li>Приготовьте 3 л морской воды с высокой соленостью, добавив NaCl в морскую воду до тех пор, пока соленость не увеличится на 85%, измеренная зондом солености. ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем исследовании была получена морская вода с высокой соленостью 74 PSU из морской воды 40 PSU из Красного моря.</li>
	<li>Вырежьте небольшие фрагменты кораллов, как описано в Шаге 1.1.</li>
	<li>Поместите разрезанные фрагменты в контейнер объемом 10 л, заполненный 3 л изосмотической морской воды (в данном случае морской воды с нестрессовой соленостью для кораллов, такой же, как используется на этапе 1.2), подключенный к перистальтическому насосу (см. Таблицу материалов). ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшего поддержания здоровья кораллов могут быть добавлены регуляторы температуры, воздушные насосы и освещение для имитации тех же условий аквариума, которым колония подвергалась ранее. Во время инкубации в настоящей работе фрагменты кораллов хранились в контейнерах при 26 °C, в течение 12-часового суточного светового цикла. Движение воды и гомогенизация температуры поддерживались воздушными насосами.</li>
	<li>Наполните контейнер, содержащий фрагменты кораллов, морской водой с высокой соленостью, приготовленной на этапе 2.1 с помощью перистальтического насоса в течение 24 ч со скоростью 126 мл/ч. Добавьте в общей сложности 3 л воды при увеличении солености примерно на 40%. ПРИМЕЧАНИЕ: Вода с высокой соленостью может быть получена путем простого добавления NaCl в морскую воду до достижения намеченной солености.</li>
	<li>Создайте мягкий поток воды с пипеткой, чтобы освободить полипы от скелета (Шаг 1.4.).</li>
	<li>Медленно обменивайте воду, в которой содержатся полипы, на изосмотическую воду (Шаг 1.5.). Затем перейдите к шагу 4 или шагу 5.</li>
</ol>3. Извлечение полипа путем инкубации морской воды без кальция
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был адаптирован из Pang et al.24.
<ol><li>Готовят раствор искусственной морской воды без кальция (CaFSW), добавляя 26,29 г NaCl, 0,872 г KCl, 2,16 г MgSO4, 11,94 г MgCl2, 3,42 гNa2SO4 и 0,286 г NaHCO3 (см. Таблицу материалов) к 1 л деионизированной воды. ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение было скорректировано с предыдущих протоколов, чтобы лучше подходить для кораллов, адаптированных к солености 40 PSU. Для кораллов, адаптированных к другим условиям солености, используйте ту же пропорцию солей, но отрегулируйте общую массу растворенных веществ, чтобы получить соленость, которая лучше подходит для используемых кораллов.</li>
	<li>Вырежьте небольшие фрагменты кораллов, как описано в Шаге 1.1.</li>
	<li>Погрузите фрагменты кораллов в чашки Петри, заполненные ранее приготовленным CaFSW (шаг 3.1.), и инкубируйте их в орбитальных инкубаторах со скоростью вращения 80 об/мин в течение 3 ч. ПРИМЕЧАНИЕ: Опять же, важно полностью покрыть фрагмент водой. Если чашки Петри недостаточно для покрытия фрагмента, оптимизируйте контейнер и объем в соответствии с экспериментальной потребностью.</li>
	<li>Переложите фрагменты в чашки Петри или 6-луночные пластины, заполненные 20% модифицированной средой Dulbecco 's Modified Eagle Media (DMEM) и 100 мг/мл раствора ампициллина (см. Таблицу материалов), приготовленной из искусственной морской воды 40 PSU. Инкубируйте фрагменты при 26 °C и 80 об/мин, обмениваясь средой каждый день, пока не будет наблюдаться переваривание тканей между полипами и отдельные полипы не начнут отделяться от скелета. ПРИМЕЧАНИЕ: В большинстве случаев переваривание тканей завершается в течение 20 ч после инкубации в этой среде, и обмены не требуются.</li>
	<li>Переложите полипы в стерилизованную морскую воду для первоначального восстановления с помощью пипетки. После 1 ч инкубации перейдите к Этапу 4 или Шагу 5.</li>
</ol>4. Уход за полипами в чашках Петри
<ol><li>Как только полипы будут возвращены в отфильтрованную морскую воду с ненапрягающей соленостью, выберите жизнеспособные полипы, наблюдая за целостностью и движением тканей, вызванным цилиарным потоком под стереомикроскопом.</li>
	<li>Поместите выбранные полипы в стеклянную или пластиковую чашку Петри и накройте чашку Петри планктонной сеткой (размер ячеек 200 мкм, см. Таблица материалов), чтобы полипы не отплывали от чашки. ПРИМЕЧАНИЕ: Размер сетчатой сетки может варьироваться в зависимости от размера полипов. Важно отметить, что сетки должны иметь поры, которые меньше полипов и допускают водообмен и проникновение света.</li>
	<li>Поместите чашку Петри в аквариум с соответствующими условиями для используемых видов кораллов. ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании условия были 40 PSU, отфильтрованная морской водой при 26 °C и 12-часовой световой цикл.</li>
	<li>Открывайте чашки Петри не реже одного раза в неделю, чтобы обновить воду и очистить посуду. Этот шаг важен для устранения чрезмерного роста водорослей, который может конкурировать или повреждать коралловые полипы, локально высвобождая токсичные соединения.</li>
</ol>5. Содержание полипов в инкубаторах
<ol><li>Выберите жизнеспособные полипы, как описано в шаге 4.1.</li>
	<li>Поместите полипы в колбы поверхностных клеток размером 75см2 , заполненные 50 мл изосмотической морской воды с помощью переносных пипеток. ПРИМЕЧАНИЕ: В текущей работе фильтрованная морская вода, собранная из Красного моря, использовалась для поддержания полипа. Можно использовать воду с теми же характеристиками, что и на этапе 1.2.</li>
	<li>Закройте колбы и переместите их в инкубаторы. Установите в инкубаторах 12-часовые световые циклы при 26 °C и 40 об/мин. Обменивайте 50% объема воды каждые 4 дня и переносите содержимое в чистые колбы, когда / если они наполняются водорослями или биопленкой на стенах. ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения были получены с помощью полностью апохроматической системы зума, оснащенной HD-камерой (см. Таблицу материалов) для репрезентативных результатов.</li>
</ol>

Авторам нечего раскрывать.

Выживаемость полипов после того, как они были подвергнуты процессам спасения, и время, необходимое для завершения процесса, варьируются среди ранее сообщенных исследований 25,33,41, что, возможно, объясняется различными экспериментальными подходами, применяемыми в каждом исследовании. Например, различные виды кораллов или даже кораллы одного и того же вида, но акклиматизированные к различным условиям окружающей среды (например, кораллы из Красного моря), имеют разные пороговые значения для уровней солености. Выбранный метод спасения и лабораторные / аквариумные условия также играют важную роль в результатах. В некоторых случаях поддержание микрораспространения кораллов в лабораторных условиях превзошло время выживания культур коралловых клеток, достигнув месяцев выживания у азооксантеллата3 3,41 и зооксантеллата25 кораллов. Время завершения процесса спасения полипа также варьировалось в различных исследованиях, варьируясь от нескольких часов2 5,2 7,30 донедель 35 инкубации, подвергшейся воздействию стрессора, ответственного за спасение. Другой переменной, которую следует учитывать при изучении спасения полипа, является восстановление полипов после воздействия острого стресса, который вызвал их высвобождение. До сих пор спорно, находятся ли полипы после спасения в достаточно хорошем состоянии, чтобы их можно было использовать в качестве моделей для изучения биологии кораллов. Восстановление их тканей после деградации ценозарка вызывает беспокойство при использовании этих микропропагатов. Тем не менее, полипы во многих исследованиях, включая настоящие, смогли представить клетки зооксантелл внутри своих тканей и внешних морфологий с интактной орально-аборальной поляризацией и щупальцами через несколько недель после спасения 25,27,32,36. Предыдущие исследования также показали, что после освобождения от острого стресса высвобождаемые коралловые полипы, подвергшиеся воздействию сильно соленой или нагретой морской воды, смогли восстановить экспрессию генов, связанных с такими процессами, как апоптоз, протеолиз и деление клеток до уровней, аналогичных тем, которые были обнаружены до спасения32,36, и даже увеличить экспрессию генов, связанных с заживлениемтканей 36.
Что касается разницы в выживаемости между методами, важно подчеркнуть, что это время может варьироваться между различными экспериментами, даже если используются одни и те же методы, и это может быть связано со здоровьем используемых фрагментов и правильным поддержанием полипов после процесса спасения. В случае спасения через инкубацию морской воды без кальция выживаемость полипа была ограничена 1 днем. Таким образом, можно сделать вывод, что метод не очень хорошо подходит для длительного выживания исследуемого вида, либо должна быть произведена лучшая адаптация методики для кораллов P. verrucosa из Красного моря. Представленные результаты показали, что более длительное время выживания было получено с помощью методов, основанных на постепенном увеличении солености, когда полипы подвергались капанию воды с высокой соленостью. Этот метод может обеспечить более контролируемое увеличение солености, чем метод испарения, в то же время не отвечая за увеличение концентрации других веществ, обнаруженных в морской воде, включая метаболические отходы кораллов, которые потенциально токсичны для организма. По всем этим причинам этот метод был предложен в качестве более безопасной альтернативы для поддержания здоровых полипов27. Хотя предполагается, что этот метод более безопасен для здоровья полипов и способен производить полипы, которые живут дольше, факт, который был подтвержден в этой текущей публикации, для его подтверждения необходимы дополнительные обследования. Оба эксперимента с высокой соленостью, вызванные спасением, продемонстрировали полное отделение полипов после того, как соленость достигла 59 ПГУ за 24 часа. Если соленость увеличивается выше уровня, на котором спасение завершено, дальнейший стресс будет вызван полипами, уменьшая их шансы на выживание и восстановление после лечения острого стресса. Поэтому не рекомендуется дольше поддерживать полипы при таких уровнях солености. При выполнении метода индукции спасения путем воздействия морской воды без кальция была получена полная отслойка от 3-часовой инкубации в искусственной морской воде без кальция, что означает, что дальнейшее воздействие этой среды также не рекомендуется.
Чтобы рассмотреть методы, которые были более адекватными для изучения коралловых полипов в лабораторных / экстракорпоральных исследованиях, это исследование было сосредоточено только на трех процедурах, которые заняли около 24 часов для завершения процесса спасения и использовались в исследованиях, которые включали долгосрочное поддержание коралловых полипов из склерактиновых кораллов. Другие методы, которые, как сообщается, занимают значительно больше времени, чем в это время, не были задействованы. Поселение полипов в подложку не было предпринято в этом исследовании, которое было сосредоточено на производстве полипов, которые могут быть перенесены в различные среды или легко собраны для анализа с использованием одноразовых пипеток. Результаты показывают, что полипы кораллового вида P. verrucosa поддерживались живыми с ассоциированными клетками зооксантелл, здоровым визуальным статусом и сохраненной грубой внешней анатомической структурой в течение 8 недель, даже без прикрепления к субстрату. Эти результаты показывают, что больше биологических реплик может быть получено из отдельных фрагментов кораллов с использованием некоторых методов, продемонстрированных в этом исследовании. Такие биологические реплики могут храниться в контролируемых средах (таких как чашки Петри и клеточные колбы) и поддерживаться в лабораторных условиях для месячных экспериментов и использоваться для нескольких целей.
Со времени первых случайных описаний спасения полипа 42,43 были созданы новые протоколы для поиска более стандартизированных методов индуцирования высвобождения полипа и поддержания таких полипов живыми, которые могут быть использованы для будущих исследовательских приложений. К ним относятся исследование различных аспектов, связанных с физиологией кораллового холобиона44 и взаимодействиями хозяина и микробиома45, молекулярных механизмов, участвующих в обесцвечивании кораллов 5,25, и здоровья, устойчивости и защиты кораллового холобиона 12,13,46,47 . Кроме того, выпущенные коралловые полипы могут быть использованы для приложений за пределами сферы исследований и были предложены для создания пропагул, которые могут прикрепляться к субстрату и расти, потенциально создавая несколько коралловых особей, которые могут быть использованы в целях восстановления, как только стандартизированные протоколы для спасения станут широко распространенными28 . В целом, хотя для стандартизации методологии следует проводить более углубленные эксперименты с использованием спасенных полипов, было показано, что спасение полипа является воспроизводимым подходом, который может быть применен в качестве инструмента в исследованиях кораллов для нескольких целей.

Склерактинские или рифообразующие кораллы являются книдариями, способными образовывать карбонатные скелеты, создавая рифы и структурно сложные экосистемы, которые можно найти от глубокой до мелководной среды1. Тропические коралловые рифы обладают высоким биоразнообразием и обеспечивают основные экосистемные услуги, такие как защита прибрежных районов и поддержание рыболовства2. Большинство мелководных рифообразующих кораллов полагаются на взаимные отношения с водорослями семейства Symbiodiniaceae, которые обеспечивают энергию, необходимую кораллам для построения своих скелетов. Симбиоз между кораллами и водорослями может быть нарушен экологическим стрессом, вызывая обесцвечивание кораллов 3,4,5,6. Недавние температурные аномалии вызвали крупные события обесцвечивания кораллов во всем мире, что привело к массовой гибели кораллов и постоянной деградации рифов 7,8,9,10,11. Поскольку это явление основано на изгнании симбионтов клеточными механизмами, связанными с посттемпературным стрессом, такими как апоптоз, аутофагия и экзоцитоз, обесцвечивание кораллов можно описать как клеточный процесс, который имеет последствия экосистемного масштаба 5,6,12, что означает, что наличие культур коралловых клеток или тканей in vitro было бы применимо для тщательного изучения этого явления.
Из-за важности коралловых рифов и основных угроз, с которыми они сталкиваются, особенно в последние два десятилетия2, кораллы стали центром исследований в целях защиты и восстановления во всем мире13. Тем не менее, разработка подходов и экспериментальных систем, которые являются надежными, воспроизводимыми и предлагают минимальное воздействие на окружающую среду для изучения кораллов, является серьезной борьбой в этой области.
Микроразмножение определяется как пролиферация генотипа организма in vitro путем культивирования его биологического материала в контролируемых сосудах14,15. Культивирование клеток, тканей и органов имеет решающее значение для биологии растений и животных в последние десятилетия. Это позволяет массово воспроизводить организмы в лабораториях, быстро оценивать различные методы лечения (такие как лекарства и фармацевтические препараты) и непосредственно изучать функцию клеток 14,15,16,17. В целом, модели in vitro были полезны для дополнения и углубления исследований различных организмов в лучше контролируемых физических и химических условиях. Благодаря преимуществам методов культивирования in vitro, различные технологии культивирования клеток и тканей животных были разработаны, оптимизированы и использованы в качестве важных инструментов во многих областях исследований, где несколько клеточных линий были изучены и коммерциализированы для многочисленных применений 16,17,18.
Многие достижения в знаниях о клеточной и тканевой культуре были сделаны с момента первой культуры тканей животных в 1882году 17, такие как использование природных и синтетических сред, изобретение установленных клеточных линий и разработка 3D-сред для лучшего культивирования множества типов клеток16,17, 18,19. Тем не менее, область клеточной биологии в основном сосредоточена на избранной группе модельных организмов, в то время как многие таксоны все еще не имеют хорошо зарекомендовавших себя культур in vitro клеток, тканей или органов20. Например, в исследованиях кораллов ни одна увековеченная клеточная линия не была широко использована для исследований, ограничивая исследования коралловых клеток использованием первичных клеточных культур. Эти культуры имеют жизнеспособность, ограниченную несколькими неделями21, без исследований, регистрирующих выживаемость отдельных клеток из всех коралловых тканей в течение более 13 дней до начала 2021года 22. Первый отчет об устойчивых коралловых клеточных линиях, который будет опубликован, был с клетками Acropora tenuis, которые жили до 6 месяцев, и полезность этих клеток для будущих исследований еще предстоит изучить23.
Чтобы преодолеть ограничения в культивировании культур коралловых клеток и поддерживать лабораторную культуру, которая сохраняет общую организацию тканей кораллов, использование изолированных полипов недавно было предложено в качестве модели для исследований в области биологии кораллов24,25. Полипы являются анатомическими единицами кораллов, и каждый из них имеет рот, расположенный в центре их ротового диска и соединенный с другими полипами ценозарком в его аборальной области26. Разделение живых полипов происходит естественным образом путем процесса спасения полипа, при котором острый стресс вызывает переваривание ценозарка между полипами, который затем может отделиться от скелета колонии 25,27,28. Сообщалось, что это явление встречается у различных таксонов, включая октокоралов 29,30,31, черных кораллов 32 и склерактиновых кораллов 25,27,28,32,33, и было связано с многочисленными экологическими стрессорами, такими как недостаток кальция в воде 24,34, повышенная кислотность35, гиперосмотические состояния 25,27,32,36, высокие температуры 36,37, голодание33, воздействие воздуха25,30 и инсектицидное загрязнение28,38. Спасение полипа было, например, зарегистрировано в поциллопоридных кораллах19, которые широко распространены по всему миру и обычно используются в качестве моделей в исследованиях кораллов. Виды, принадлежащие к этой группе, такие как Pocillopora damicornis и Styllophora pistillata, произвели примерно 30-40 микропропагатов из 5-миллиметрового фрагмента25. Это число подчеркивает преимущество использования выручивания полипа в качестве метода микроразмножения кораллов, поскольку оно создает возможность генерации многих генетически идентичных особей из небольшого кусочка коралла. Использование изолированных полипов для исследований также имеет те же преимущества, что и клеточные культуры в отношении возможности культивирования в контролируемых лабораторных средах, таких как колбы и чашки Петри. Кроме того, микрофлюидные платформы для поддержания живых полипов продемонстрировали, что эти микрораспропагаты могут храниться в относительно дешевых и легко воспроизводимых средах с контролируемым потоком воды, поверхностью и температурой 24,25. Эти микрофлюидные платформы также могут быть использованы для визуализации живых коралловых структур под микроскопом непосредственно24,25.
В настоящей статье мы обобщаем и демонстрируем методы, которые были разработаны для выделения отдельных коралловых полипов из их колоний, показывая, как поддерживать их в лабораторных условиях для долгосрочной культуры. Обсуждаемые методы включают спасение полипа в гиперосмотических условиях путем испарения и перекачки морской воды с высокой соленостью и инкубации в морской воде без кальция.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5560 Conductivity/Temperature Probe</td>
			<td>YSI</td>
			<td>5560</td>
			<td>Conductivity probe used with the ProQuatro Multiparameter meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ace 5 in. Alloy Steel Diagonal Pliers</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td>2004083</td>
			<td>Used to cut coral fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td>Used in DMEM medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>Used for incubating coral fragments in the calcium-free polyp bail-out method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, Polystyrene</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>Petri dish used for bail-out by evaporstion and for keeping polyps inside an aquarium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 Watt</td>
			<td>Schego</td>
			<td>548</td>
			<td>Heaters used in aquarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite Version 4.2</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software used for image capture in demonstrative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica IC80 HD</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>12730216</td>
			<td>Camera used to take demonstrative results pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MDG33</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10 450 123</td>
			<td>Stereoscope stand used to take demonstrative results pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Z6 APO</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Macroscope used to take demonstrative results pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex I/P Easy-Load Pump Head for Precision Tubing, White PPS Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-77602-10</td>
			<td>Peristaltic pump head.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Modular Drives with Benchtop Controller</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-07557-00</td>
			<td>Peristaltic pump drive used for pumping high salinity seawater. Can be substituted for any peristaltic pump capable of mainaining water flow as described in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 16; 25 ft</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-96410-16</td>
			<td>Tubing for peristaltic pump.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex 33 mm PVDF 0.22 &#181;m Sterile RUO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>Used to filter artificial sea water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td>Flask usually used for cell culture used for polyp culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker, Advanced 5000, VWR</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-2916</td>
			<td>Shaker used inside incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percival Incubator - I-22VL</td>
			<td>Percival</td>
			<td>NA</td>
			<td>Incubator used for maintaing corals kept in cell flasks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plankton net 200 &#181;m mesh size</td>
			<td>KC Denmark</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for covering petri dishes containing coral polyps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProQuatro Multiparameter Meter</td>
			<td>YSI</td>
			<td>606950</td>
			<td>Used for measuring salinity thoughout the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RADION XR15 G5 PRO</td>
			<td>Ecotech</td>
			<td>NA</td>
			<td>Lights used in aquarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Sea Salt 
			Premium grade, moderate Alkalinity</td>
			<td>Red Sea</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to prepare 40 PSU artifical sea water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfate Anhydrous</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>7757-82-6</td>
			<td>Used for preparing calcium-free artificial seawater.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRD 112 thermostat</td>
			<td>Schego</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermostat used in aquarium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbelle Nanostream 6025</td>
			<td>Tunze</td>
			<td>6025 000</td>
			<td>Pumps used in aquarium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing polyp bail-out in coral colonies to obtain individualized micropropagates for laboratory experimental use

Кораллы — это колониальные животные, образованные модульными единицами, называемыми полипами. Коралловые полипы физиологически связаны и соединены тканью. Феномен спасения полипа — это процесс, вызванный острым стрессом, при котором коралловые полипы переваривают ткань, соединяющую их с остальной частью колонии, и в конечном итоге отделяются от скелета, чтобы продолжать жить как отдельные особи. Коралловые биологи признавали процесс спасения полипа в течение многих лет, но только недавно микрораспространения, генерируемые этим процессом, были признаны модельной системой для исследований биологии кораллов. Использование спасения полипа может создать большое количество клональных единиц из одного фрагмента коралла. Еще одно преимущество заключается в том, что отдельные полипы или участки полипов могут быть легко визуализированы под микроскопом и поддерживаться в высоко стандартизированных недорогих средах, таких как чашки Петри, колбы и микрофлюидные чипы. Настоящий протокол демонстрирует воспроизводимые методы, способные индуцировать микроразмножение кораллов, и различные подходы к поддержанию жизни одиночных полипов в долгосрочной перспективе. Эта методология была способна успешно культивировать полипы коралловых видов Pocillopora verrucosa в течение 8 недель после спасения, демонстрируя практичность использования отдельных коралловых полипов для исследования кораллов.

Спасение полипа было индуцировано в фрагментах кораллов, принадлежащих к одной колонии вида P. verrucosa, тремя различными методами (рисунок 1). Спасение, вызванное высокой соленостью после испарения воды, было завершено после 24 ч инкубации фрагментов кораллов в чашках Петри при температуре окружающей среды, заполненных водой, первоначально при 40 ПС, которая затем достигла конечной солености 59 ПГУ после завершения процесса (рисунок 2A-C, I). Спасение с помощью подачи соленой воды также было достигнуто после 24 ч инкубации в воде первоначально при 40 блоках питания, которые достигли солености 52 блока питания через 12 ч и 59 блоков питания в конце процесса, через 24 ч (рисунок 2D-F,I). В обоих экспериментах увеличение солености было ответственно за индукцию переваривания тканей полипами. Через 12 ч состояние высокой солености вызывало сокращение полипов в сочетании с постепенным истончением ценозарка, в конечном итоге вызывая окончательное отслоение полипов через 24 ч. Индукция спасения путем инкубации в морской воде без кальция была завершена после 3-часовой инкубации в CaFSW с последующей 20-часовой инкубацией в 20% среде DMEM (рисунок 2G-H). Ткань отделялась от скелета во всех трех методах после отталкивания его пипеткой до тех пор, пока не были сгенерированы индивидуализированные коралловые полипы (рисунок 3A-C) и «тканевые шарики».
После отсоединения полипы всех трех методов собирали и позволяли восстанавливаться в морской воде, прежде чем распределять в чашки Петри, покрытые сетями или клеточными колбами. Полипы, полученные методами испарения и водоснабжения, поддерживались в чашках Петри внутри аквариумов и выживали в течение 6 недель и 8 недель соответственно (рисунок 3D и рисунок 3F). Эти микропропагаты сохранили обычную анатомию полипов, представляющих щупальца, базальные диски и устья1. Полипы, полученные путем инкубации в безкальцевой морской воде, имели короткую продолжительность жизни, выживая до 1 дня, после чего их ткани диссоциировали. Полипы, полученные методом испарения морской воды, хранящиеся в колбах клеточных культур внутри инкубаторов, выживали до 3 недель без диссоциации тканей (рисунок 3F). Во всех случаях, несмотря на то, что полипы не могли прикрепляться к субстрату, они были визуально здоровы и сохраняли свой цвет, причем клетки зооксантелл все еще были видны внутри их тканей1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig01v2.jpg"> Рисунок 1: Схематическое представление трех различных проверенных методологий индукции выручивания полипа (слева) с последующей иллюстрацией двух методов поддержания приобретенных полипов в лабораторных условиях (справа). (A) Представление методологии спасения полипа путем испарения воды. (B) Представление методологии спасения полипа путем подачи морской воды с высокой соленостью. С) Представление методологии спасения полипа путем инкубации морской воды без кальция. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig01largev2.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig02.jpg"> Рисунок 2: Изображения процесса спасения полипа, индуцированного тремя различными методологиями с использованием фрагментов кораллового вида P. verrucosa. (А-С) Фрагмент коралла через 0 ч, 12 ч и 24 ч после инкубации, соответственно, в чашке Петри с использованием метода испарения воды. (Д-Ф) Фрагмент коралла через 0 ч, 12 ч и 24 ч после инкубации, соответственно, с использованием метода подачи морской воды с высокой соленостью. (Г,Ч) Фрагменты кораллов подвергаются воздействию метода инкубации морской воды без кальция до и после, соответственно. Инкубации в искусственной морской воде без кальция проводились в течение 3 ч и в 20% DMEM в течение 21 ч. (I) Графическое представление значений солености в ПГУ морской воды с течением времени во время испарения воды и методов индукции спасения морской воды с высокой соленостью. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig03.jpg"> Рисунок 3: Изображения полипов P. verrucosa, полученные из трех продемонстрированных процедур индукции спасения. (A-C) Изображения полипов, полученные из методов испарения, подачи соленой воды и морской воды без кальция, соответственно, были получены сразу после того, как они были отделены от скелета. (D) Изображение кораллового полипа, полученное методом испарения после выживания в течение 6 недель в чашке Петри. (E) Изображение кораллового полипа, полученное методом подачи соленой воды после выживания в течение 8 недель в чашке Петри. (F) Изображение кораллового полипа, полученное методом испарения после выживания в течение 3 недель в колбе для клеточной культуры. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use at JoVE.com

Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use

Спасение полипа — это процесс, вызванный острым стрессом, при котором коралловые полипы переваривают ткань, соединяющую их с их колонией, и отделяются от нее, чтобы жить как индивидуумы. В настоящем протоколе описывается, как вызвать микроразмножение кораллов путем спасения с использованием гиперсолевых или безкальцевых обработок морской воды.

Индуцирование спасения полипа в коралловых колониях для получения индивидуализированных микропропагатов для лабораторного экспериментального использования

Corals are colonial animals formed by modular units called polyps. Coral polyps are physiologically linked and connected by tissue. The phenomenon of ...

Микроразмножение кораллов все еще находится в зачаточном состоянии. Оптимизация протоколов для спасения полипов является ключом к заполнению этого пробела, позволяя ученым использовать полипы в качестве моделей для изучения кораллов в лабораторных условиях. Спасение полипа позволяет создавать множественные размножения из небольших фрагментов кораллов.Полипы могут быть использованы в различных экспериментах, облегчающих наблюдение микроскопических процессов в кораллах, например. Коралловые рифы находятся под угрозой. Наша цель состоит в том, чтобы использовать эту воспроизводимую модель для разработки стратегий защиты кораллов от обесцвечивания и других экологических угроз эффективным и неинвазивным способом.Этот метод может помочь в исследовании физиологии кораллов, взаимодействий микробиома хозяина и механизмов, участвующих в обесцвечивании. Такие результаты могут способствовать оптимизации коралловых пробиотиков, например. Использование морской воды с адекватной соленостью является ключевым.Соленость должна начинаться на уровне естественной среды коралла и увеличиваться медленно, чтобы стресс не был чрезмерно вредным. Сбор полипов в нужный момент и выбор тех, которые наиболее неповреждены, имеет решающее значение для их выживания. Визуальная демонстрация может иметь жизненно важное значение для понимания этих сигналов.Сначала используйте диагональные плоскогубцы, чтобы вырезать небольшие фрагменты из коралловой колонии, затем поместите их в небольшие чашки Петри, заполненные 12 миллилитрами морской воды, к которой акклиматизировалась коралловая колония. Оставьте пластину открытой примерно на 24 часа при температуре окружающей среды, чтобы вода испарилась и ее соленость постепенно увеличивалась. Когда между полипами наблюдается переваривание тканей, используйте 1-миллилитровую переносную пипетку, чтобы создать мягкий поток рядом с коралловой тканью.Поток медленно поможет завершить отслоение полипов, которые уже переварили ткань вокруг них от скелета, затем с помощью пипетки медленно обменять воду в чашке Петри с изосмотической водой. Чтобы приготовить морскую воду с высокой соленостью, возьмите обычную морскую воду и добавьте хлорид натрия в морскую воду, чтобы подготовить три литра морской воды с высокой соленостью, пока соленость не увеличится на 85% После разрезания небольших фрагментов кораллов, как было продемонстрировано ранее, поместите их в 10-литровый контейнер с тремя литрами изосмотической морской воды, подключенной к перистальтическому насосу. Наполните этот контейнер тремя литрами предварительно приготовленной морской воды с высокой соленостью в течение 24 часов со скоростью 126 миллилитров в час, чтобы увеличить соленость примерно на 40% Используя пипетку, создайте мягкий поток воды для освобождения полипов из скелета.Медленно обменивайте воду в емкости с изосмотической морской водой. Добавьте 26,29 грамма хлорида натрия, 0,872 грамма хлорида калия, 2,16 грамма сульфата магния, 11,94 грамма хлорида магния, 3,42 грамма сульфата натрия и 0,26 грамма бикарбоната натрия в один литр деионизированной воды для приготовления морской воды без кальция, а затем наполните чашки Петри этой морской водой без кальция. После разрезания небольших фрагментов кораллов погрузите их в безкальциевую морскую воду в чашки Петри.Поместите чашки в орбитальный инкубатор на три часа со скоростью вращения 80 об/мин, затем перенесите фрагменты в чашки Петри, наполненные 20%-ным DMEM, приготовленные искусственной морской водой из 40 практических единиц солености и содержащие 100 миллиграммов на литр ампициллина. Инкубируйте фрагменты при 26 градусах Цельсия и 80 об/мин. Обменивайтесь средами каждый день до тех пор, пока не будет наблюдаться переваривание тканей между полипами, и отдельные полипы не начнут отделяться от скелета, затем переносят полипы в стерилизованную морскую воду и инкубируют в течение одного часа.Как только полипы будут возвращены в отфильтрованную морскую воду с ненапрягающей соленостью, выберите жизнеспособные полипы, наблюдая за целостностью тканей и движением, вызванным цилиарным потоком под стереомикроскопом. Поместите выбранные полипы в чашку Петри и накройте чашку Петри планктонной сеткой размером сетки 200 микрометров, чтобы полипы не отплывали от чашки. Поместите чашку Петри в аквариум с соответствующими условиями для используемых видов кораллов.Чтобы предотвратить разрастание водорослей, открывайте чашку Петри не реже одного раза в неделю, чтобы обновить воду и очистить посуду. После выбора полипов, как показано ранее, с помощью трансферной пипетки поместите их в колбу поверхностной ячейки площадью 75 квадратных сантиметров, заполненную 50 миллилитрами изосмотической морской воды, затем закройте колбу и поместите их в инкубатор, установленный при 12-часовых световых циклах, 26 градусах Цельсия и 40 оборотах в минуту. Если колба наполнится водорослями или биопленками, перенесите содержимое в чистую колбу.В этом исследовании спасение полипа было вызвано тремя различными методами. Метод испарения воды привел к полному спасению в течение 24 часов после инкубации, а соленость увеличилась с 40 до 59 единиц практической солености через 24 часа. Метод подачи соленой воды также привел к спасению полипа после 24 часов инкубации.Здесь соленость увеличилась с 40 до 52 единиц практической солености после 12 часов инкубации, а затем до 59 единиц практической солености через 24 часа. Индукция спасения через инкубацию в морской воде без кальция была завершена после трех часов инкубации полипов в ней, за которой последовали 20 часов инкубации в среде 20% DMEM. Коралловые полипы, образующиеся методом испарения, могут выживать в течение шести недель, тогда как полипы, полученные методом подачи морской воды с высокой соленостью, могут выживать в течение восьми недель в чашках Петри внутри аквариумов.Полипы, полученные методом испарения морской воды, хранящиеся в колбах клеточных культур внутри инкубаторов, выживали до трех недель без полной диссоциации их тканей. При отсоединении полипов от скелета важно быть щадящим. Если они не полностью отделены, принудительное отслоение путем сильного пипетирования воды приведет к повреждению и снижению выживаемости.С помощью этих методов можно индуцировать расселение полипов. Поселение полипов может ответить на вопросы о процессах его кальцификации и роста. После разработки индукции спасения полипа исследователи смогли изучить первоначальное формирование кораллового скелета и непосредственно визуализировать обесцвечивание кораллов в масштабе полипов.

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Корковая Нейрогенез: Переход от Достижения в лаборатории для клеточной терапии

Experimental Approaches to Tissue Engineering

Экспериментальные подходы к тканевой инженерии

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Использование Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) для разработки средств диагностики

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

Автоматизированная гидрофобные взаимодействия хроматографии на колонке выбора для использования в очистки белков

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

Применение ретиноевой кислотой получить остеоцитов культур из первичных мыши остеобластов

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

С открытым исходным кодом Анализ Одночастичного для супер-разрешение микроскопии с VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Протокол для лабораторных жилья из бирюзы Пецилиевые рыбы (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Экспериментальный протокол для использования дрозофилы как система беспозвоночных модель для токсичности тестирования в лаборатории

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Inducing Apical Periodontitis in Mice

Индуцирование априкового пародонтита у мышей

The mechanisms involved in local induced inflammation can be studied using several available animal models. One of these is the induction of apical ...

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Fabrication of Amyloid-ÃƒÅ½Ã‚Â²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Изготовление амилоидных микробусов для использования в моделировании болезни Альцгеймера

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...