Name: examining the effect of pesticides on caenorhabditis elegans neurons
Uploaded: 2022-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

Arbejdet beskrevet i dette manuskript blev udført for en mellemklasse i neurovidenskab. Midler til reagenser og forsyninger blev leveret af biologiafdelingen på Vassar College. Mikroskoperne og det digitale billeddannelsessystem blev også leveret af biologiafdelingen på Vassar College. Forfatteren takker alle de mange studerende, der tog dette kursus.

Al brug af hvirvelløse dyr var i overensstemmelse med institutionens retningslinjer for dyrepleje og brug.
1. Fremstilling af pesticidbelagte Petri-plader
<ol><li>Forbered agar Petriskåle (6 cm diameter fungerer bedst) ved hjælp af standardprocedurer6. BEMÆRK: Disse kan laves måneder i forvejen og opbevares i køleskabet indtil brug. Bring pladerne til stuetemperatur (RT) på bordpladen. I de fleste tilfælde skal elevgrupperne forsynes med en...

<ol>
	<li>Duzguner, V., Erdogan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+exposure+to+imidacloprid+induces+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+liver+&amp;+central+nervous+system+of+rats.">Chronic exposure to imidacloprid induces inflammation and oxidative stress in the liver &amp; central nervous system of rats.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 104 (1), 58-64 (2012).</li><li>Catae, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+a+sublethal+concentration+of+imidacloprid+and+the+side+effects+on+target+and+nontarget+organs+of+Apis+mellifera+(Hymenoptera,+Apidae).">Exposure to a sublethal concentration of imidacloprid and the side effects on target and nontarget organs of Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae).</a> Ecotoxicology. 27 (2), 109-121 (2018).</li><li>Bradford, B. R., Whidden, E., Gervasio, E. D., Checchi, P. M., Raley-Susman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonicotinoid-containing+insecticide+disruption+of+growth,+locomotion,+and+fertility+in+Caenorhabditis+elegans.">Neonicotinoid-containing insecticide disruption of growth, locomotion, and fertility in Caenorhabditis elegans.</a> PLOS One. 15 (9), 0238637 (2020).</li><li>Jospin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+acetylcholine+receptor+regulates+the+balance+of+muscle+excitation+and+inhibition+in+Caenorhabditis+elegans.">A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 7 (12), 1000265 (2009).</li><li>Susman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Discovery-Based Learning in the Life Sciences. , (2015).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Brody, H. A., Chou, E., Gray, J. M., Pokyrwka, N. J., Raley-Susman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mancozeb-induced+behavioral+deficits+precede+structural+neural+degeneration.">Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration.</a> NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).</li><li>Chen, P., Martinez-Finley, E. J., Bornhorst, J., Chakraborty, S., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal-induced+neurodegeneration+in+C.+elegans.">Metal-induced neurodegeneration in C. elegans.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 5, (2013).</li><li>Hart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior.">Behavior.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Harlow, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nematode+Caenorhabditis+elegans+as+a+tool+to+predict+chemical+activity+on+mammalian+development+and+identify+mechanisms+influencing+toxicological+outcome.">The nematode Caenorhabditis elegans as a tool to predict chemical activity on mammalian development and identify mechanisms influencing toxicological outcome.</a> Scientific Reports. 6 (1), 22965 (2016).</li></ol>

De protokoller, der er beskrevet i dette manuskript, fungerer med succes alene eller som en del af et fler ugers uafhængigt studentergruppeprojekt. Protokollerne er også modtagelige for enkeltstående, en uges sonderende oplevelser. Nematodestammerne er billige og nemme at vedligeholde i forskningslaboratoriet. Studerende kan let lære at plukke orme med en ormplukning eller hvordan man flytter dem ved at skylle plader med vand og lade dem slå sig ned ved tyngdekraften. Eksperimenterne kan udføres i løbet af en enke...

Caenorhabditis elegans er en fremragende modelorganisme til laboratoriekursusuddannelse i biologiske videnskabskurser for introduktions- og mellemniveaustuderende. Denne laboratorieprocedure kan bruges som en del af et flerugers modul, der udforsker forskellige virkninger af almindeligt anvendte pesticider på C. elegans adfærd og cellebiologi. Studerende kan lære at designe og gennemføre uafhængige projekter, der lærer dem dataanalyse og præsentationsfærdigheder. Dette papir fokuserer på protokollerne til udsættelse af C. elegans for pesticidblandinger og derefter observere og analysere virkningerne på neuronmorfologi.
Græsplæne kemiske pesticidblandinger anvendes i vid udstrækning til bolig- og landbrugsbrug og kan købes hos enhver lokal havebutik. Der er stigende bekymring for sikkerheden af disse kemikalier for mennesker og dyreliv 1,2,3. Studerende kan læse den videnskabelige litteratur og vælge et pesticid til eksperimentel evaluering og kan dermed lære om grundlæggende biologi og neurobiologi samt vigtige laboratoriefærdigheder som eksperimentelt design og analyse og generelle laboratoriefærdigheder som pipettering og serielle fortyndinger, dissekering af mikroskopi, fluorescerende mikroskopi, digital fotografering og figurproduktion.
De protokoller, der er beskrevet i dette papir, kan stå alene i et mellemliggende kursus i biologi eller neurovidenskab eller være en del af et flere ugers modul, der også kan omfatte målinger af adfærd styret af bestemte grupper af neuroner. For eksempel er beskrevet i denne protokol en vurdering af morfologien af kolinerge neuroner, der styrer bevægelse ved hjælp af en stamme af nematode, der udtrykker GFP (LX 929) i kolinerge neuroner4. Disse stammer kan fås til meget lave priser fra Caenorhabditis elegans Genetics Center (https://cgc.umn.edu/). Stammer, der udtrykker GFP i dopaminerge neuroner (OH 7457), kolinerge neuroner (LX 929) eller mCherry udtrykt i alle neuroner (PVX4) er alle gode valg. Studerende kunne også måle bevægelse og få data til at ledsage vurderingen af morfologi. En fuldstændig beskrivelse af et flerugers studentergruppeprojekt findes i Susman5.
Dette studentergruppeprojekt er ret billigt og let at oprette for grupper på fire studerende. De nødvendige materialer omfatter et dissekeringsmikroskop, adgang til et fluorescensforbindelsesmikroskop, der kan have et vedhæftet digitalkamera, Petri-plader og adgang til nematodevækstar, vækstbegrænsede bakterier (stamme OP50, fra CGC), en gasflamme Bunsen-brænder eller en alkohollampe, en autoklave, platintråd og generelle laboratorieforsyninger som mikropipettere, mikroskopdias, dæksedler og pasteurpipetter af glas. Afhængigt af det kemiske toksiske stof, der undersøges af elevgrupperne, skal trinene i protokollen muligvis forekomme under en stinkhætte eller med handsker. Denne protokol bruger kemiske blandinger, der er vandopløselige (ikke flygtige), og alle sikre håndteringsprocedurer, der anbefales af producenten, følges.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP97445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1AGAH0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol lamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;17012826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-012-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strains</td>
			<td>C. elegans Genetics Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1147030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain (OP50)</td>
			<td>C. elegans Genetics Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;131045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9723-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;05408129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-265446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>94060316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-386-319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-1M30P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ61413AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC447810250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining the effect of pesticides on caenorhabditis elegans neurons

Caenorhabditis elegans er en kraftfuld modelorganisme, der anvendes i mange forskningslaboratorier til at forstå konsekvenserne af eksponering for kemiske forurenende stoffer, pesticider og en lang række giftige stoffer. Disse nematoder er nemme at arbejde med og kan bruges til at generere nye forskningsresultater, selv i bachelorbiologilaboratoriet. En flerugers laboratorieserie af autentiske, studenterdrevne forskningsprojekter træner eleverne i et værktøjssæt af teknikker og tilgange inden for adfærdsmålinger, cellebiologi og mikroskopi, som de derefter anvender på deres projekter. En teknik i dette værktøjssæt er at kvantificere procentdelen af neuroner, der udviser neurodegenerativ skade efter eksponering for et kemisk toksisk stof som et pesticid. Unge voksne C. elegans nematoder kan udsættes for forskellige koncentrationer af kommercielt tilgængelige pesticider eller andre typer toksiske stoffer i 2-24 timer. Derefter kan bachelorstuderende visualisere forskellige neuronundertyper ved hjælp af fluorescerende ekspresserende stammer af C. elegans. Disse teknikker kræver ikke sofistikeret billedbehandlingssoftware og er effektive ved selv lave forstørrelser, hvilket gør behovet for dyr konfokal mikroskopi unødvendigt. Dette papir viser, hvordan man behandler nematoderne med pesticider, og hvordan man afbilder og scorer neuronerne. Det giver også en ligetil protokol til mikroskopi og analyse af neuronmorfologi. De materialer, der anvendes til denne teknik, er billige og let tilgængelige i de fleste bachelorbiologiske afdelinger. Denne teknik kan kombineres med adfærdsmæssige foranstaltninger som bevægelse, basal opbremsning eller æglægning for at gennemføre en potentielt publicerbar række eksperimenter og give bachelorstuderende en autentisk forskningsoplevelse til en meget lav pris.

De metoder og protokoller, der er beskrevet i dette papir, giver vigtige laboratoriefærdigheder til bachelorstuderende på mellemniveau i biologi eller neurovidenskab. Studerende kan få vigtig erfaring med at udvikle et uafhængigt projekt og gennemføre et eksperiment af deres eget design, der kan give nye resultater. Figur 3 viser et optimalt resultat af et studenterprojekt, der til sidst blev en del af en publiceret opgave3. Mens de fleste elevprojekter ikke resu...

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Unge voksne Caenorhabditis elegans nematoder udsættes for forskellige koncentrationer af kommercielle pesticider eller andre toksiske stoffer i 2-24 timer. Derefter kan forskellige neuroner visualiseres ved hjælp af fluorescerende ekspressionerende stammer. Dette papir viser, hvordan man udsætter nematoder for pesticider og vurderer neuronskader.

Undersøgelse af virkningen af pesticider på Caenorhabditis elegans neuroner

Caenorhabditis elegans is a powerful model organism used in many research laboratories to understand the consequences of exposure to chemical pollutants, ...

Denne protokol er en ligetil og gennemførlig måde for bachelorstuderende at udføre autentisk forskning, der kan føre til publicerbare resultater. Den største fordel er, at eleverne kan udføre original forskning på spørgsmål, som de selv beslutter. Til at begynde med skal du lave en opløsningsspreder ved forsigtigt at bøje en pasteur-pipette på ni milliliter glas i en Bunsen-brænderflamme og lukke pipettens åbning.Derefter steriliseres sprederen, før hver spredes på Petri-pladen. Brug en mikropipetter til at placere 100 mikroliter fortynding på midten af agaren og spredes forsigtigt over overfladen med den steriliserede spreder. Sæt derefter de tildækkede petriskåle til side, og lad opløsningen suge ind i overfladen, indtil den er tør.I eksponeringsperioder på mere end 12 timer tilsættes 50 mikroliter af en natlig kultur af Escherichia coli til pladerne, inden nematoderne tilsættes, mens det ved akutte forsøg på 12 timer eller derunder ikke er behov for at have E.coli på pladerne. Brug en mikropipette til at placere en milliliter sterilt vand på nematodepladen. Svirp derefter vandet rundt for at løfte nematoderne op, og fjern derefter væsken med nematoderne til et 1,5 ml mikrofugerør.Efter 10 minutter, når nematoderne afregnes af tyngdekraften, skal du forsigtigt fjerne mindst 500 mikroliter af vandet og kassere. Derefter suspenderes nematoderne igen, og ved hjælp af en afskåret gul pipettespids fjernes 50 til 100 mikroliter suspenderede orme til hver behandlingsplade, hvilket sikrer, at hver plade har mindst 10 voksne orme. Forbered to dias ved at placere et stykke etikettape på kun den ene side af diaset for at danne en pude af ensartet tykkelse, og placer derefter et rent ubrugt dias mellem dem på bordpladen.Placer en 10 mikroliter dråbe smeltet agarose på midten af diaset ved hjælp af en mikropipetter. Flad derefter dråben ved at placere et andet rent dias ovenpå vinkelret på diaset med dråben og påfør tryk, så agarosefaldet danner tykkelsen af mærkningsbåndet. Påfør derefter konstant tryk for at adskille de to dias.Hvil derefter dette dias med agarsiden op på bordpladen og lad det tørre i et til to minutter før brug. For at tilføje nematoder af det forberedte dias med agarosepuden tilsættes en fem mikroliter dråbe vand indeholdende et molært natriumazid til agarpuden, som vil anæstetisere ormene og mobilisere dem. Derefter overføres ved 10 nematoder pr. Behandling glider til dråben ved hjælp af en ormplukker, som skal steriliseres før og efter overførsel af nematoderne.Tilsæt derefter et dæksel ved hjælp af tang ved at placere det i en vinkel og langsomt sænke det. Derefter placeres den forberedte våde montering på et fluorescerende mikroskop for at observere ormene først under 10X forstørrelse og fasekontrast, derefter under 40X forstørrelse med fasekontrast og fluorescerende belysning. Placer en forberedt våd montering ad gangen på mikroskopstadiet og fastgør på plads ved hjælp af mikroskopets sceneklip, og begynd derefter at se de våde monteringer med det laveste forstørrelsesmål, som typisk er 10X, og brug et lyst felt eller fasekontrast til at visualisere og fokusere på nematoderne.Når en nematode er placeret i synsfeltet, skal du fokusere på den ved hjælp af den fine fokusknap på mikroskopet og derefter skifte belysningen til fluorescens ved at dreje drejeknappen og lede lyset til kameraet for at fange de digitale billeder. Juster derefter belysningen ved hjælp af billeddannelsessoftwaren, så neuronerne er stærkt belyst, men ikke overmættede. På et tidspunkt skal du få et separat billede af en lineal med samme forstørrelse som cellebillederne for at give en forstørrelsesskala for deres figur.Virkningerne af mangan indeholdende pesticid på dopaminneuronmorfologi ved hjælp af en stamme, hvor dopaminneuroner udtrykte GFP, blev undersøgt, hvilket viste et lyst signal. Det fluorescerende signal bleger imidlertid, hvis neuronerne udsættes for lys i lange perioder. Denne procedure kan være en del af et flere ugers studenterdrevet projekt, der også kan omfatte adfærdsmæssige eller andre data.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Brain Imaging Undersøgelse af forringe Effekt af Emotion på kognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Cut-loading: Et nyttigt værktøj for behandlingen af ​​omfanget af Gap Junction Tracer kobling mellem Retinal Neuroner

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo to-foton billedbehandling af oplevelsesbaseret afhængige molekylære ændringer i kortikal neuroner

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Metoder til undersøgelse af virkningsmekanismer for antipsykotika i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

En analyse til måling virkningerne af ethanol på Locomotion hastighed<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Langsigtet Calcium Imaging af<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Nye Metrics at karakterisere Embryonale Forlængelse af nematoden<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...