Name: examining the effect of pesticides on caenorhabditis elegans neurons
Uploaded: 2022-05-27T15:00:00
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Le travail décrit dans ce manuscrit a été réalisé pour une classe de niveau intermédiaire en neurosciences. Les fonds pour les réactifs et les fournitures ont été fournis par le département de biologie du Vassar College. Les microscopes et le système d’imagerie numérique ont également été fournis par le département de biologie du Vassar College. L’auteur remercie tous les nombreux étudiants qui ont suivi ce cours.

Toute utilisation d’animaux invertébrés était conforme aux directives de l’établissement en matière de soins et d’utilisation des animaux.
1. Préparation de plaques de Petri recouvertes de pesticides
<ol><li>Préparez des boîtes de Petri d’agar (6 cm de diamètre fonctionnent le mieux) en utilisant des procédures standard6. REMARQUE: Ceux-ci peuvent être préparés des mois à l’avance et conservés au réfrigérateur jusqu’à ...

<ol>
	<li>Duzguner, V., Erdogan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+exposure+to+imidacloprid+induces+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+liver+&amp;+central+nervous+system+of+rats.">Chronic exposure to imidacloprid induces inflammation and oxidative stress in the liver &amp; central nervous system of rats.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 104 (1), 58-64 (2012).</li><li>Catae, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+a+sublethal+concentration+of+imidacloprid+and+the+side+effects+on+target+and+nontarget+organs+of+Apis+mellifera+(Hymenoptera,+Apidae).">Exposure to a sublethal concentration of imidacloprid and the side effects on target and nontarget organs of Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae).</a> Ecotoxicology. 27 (2), 109-121 (2018).</li><li>Bradford, B. R., Whidden, E., Gervasio, E. D., Checchi, P. M., Raley-Susman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonicotinoid-containing+insecticide+disruption+of+growth,+locomotion,+and+fertility+in+Caenorhabditis+elegans.">Neonicotinoid-containing insecticide disruption of growth, locomotion, and fertility in Caenorhabditis elegans.</a> PLOS One. 15 (9), 0238637 (2020).</li><li>Jospin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+acetylcholine+receptor+regulates+the+balance+of+muscle+excitation+and+inhibition+in+Caenorhabditis+elegans.">A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 7 (12), 1000265 (2009).</li><li>Susman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Discovery-Based Learning in the Life Sciences. , (2015).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Brody, H. A., Chou, E., Gray, J. M., Pokyrwka, N. J., Raley-Susman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mancozeb-induced+behavioral+deficits+precede+structural+neural+degeneration.">Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration.</a> NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).</li><li>Chen, P., Martinez-Finley, E. J., Bornhorst, J., Chakraborty, S., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal-induced+neurodegeneration+in+C.+elegans.">Metal-induced neurodegeneration in C. elegans.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 5, (2013).</li><li>Hart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior.">Behavior.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Harlow, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nematode+Caenorhabditis+elegans+as+a+tool+to+predict+chemical+activity+on+mammalian+development+and+identify+mechanisms+influencing+toxicological+outcome.">The nematode Caenorhabditis elegans as a tool to predict chemical activity on mammalian development and identify mechanisms influencing toxicological outcome.</a> Scientific Reports. 6 (1), 22965 (2016).</li></ol>

Les protocoles décrits dans ce manuscrit fonctionnent avec succès seuls ou dans le cadre d’un projet de groupe d’étudiants indépendant de plusieurs semaines. Les protocoles se prêtent également à des expériences exploratoires autonomes d’une semaine. Les souches de nématodes sont bon marché et faciles à entretenir dans le laboratoire de recherche. Les élèves peuvent facilement apprendre à cueillir les vers avec un pic à vers ou à les déplacer en rinçant les plaques avec de l’eau et en leur perme...

Caenorhabditis elegans est un excellent organisme modèle pour la formation en laboratoire dans les cours de sciences biologiques pour les étudiants de niveau d’introduction et intermédiaire. Cette procédure de laboratoire peut être utilisée dans le cadre d’un module de plusieurs semaines qui explore divers effets des pesticides couramment utilisés sur le comportement de C. elegans et la biologie cellulaire. Les étudiants peuvent apprendre à concevoir et à réaliser des projets indépendants qui leur enseignent des compétences en analyse de données et en présentation. Cet article se concentre sur les protocoles d’exposition de C. elegans à des mélanges de pesticides, puis sur l’observation et l’analyse des effets sur la morphologie des neurones.
Les mélanges de pesticides chimiques pour pelouse sont largement utilisés à des fins résidentielles et agricoles et peuvent être achetés dans n’importe quel magasin de jardinage local. On s’inquiète de plus en plus de la sécurité de ces produits chimiques pour les humains et la faune 1,2,3. Les étudiants peuvent lire la littérature scientifique et choisir un pesticide pour l’évaluation expérimentale et, ce faisant, peuvent en apprendre davantage sur la biologie de base et la neurobiologie, ainsi que sur d’importantes compétences de laboratoire telles que la conception et l’analyse expérimentales, et des compétences générales en laboratoire telles que le pipetage et les dilutions en série, la microscopie disséquante, la microscopie fluorescente, la photographie numérique et la production de figures.
Les protocoles décrits dans cet article peuvent être autonomes dans un cours de niveau intermédiaire en biologie ou en neurosciences ou faire partie d’un module de plusieurs semaines qui pourrait également inclure des mesures de comportements régis par des groupes particuliers de neurones. Par exemple, décrit dans ce protocole est une évaluation de la morphologie des neurones cholinergiques qui régissent la locomotion à l’aide d’une souche de nématode qui exprime la GFP (LX 929) dans les neurones cholinergiques4. Ces souches peuvent être obtenues à des prix très bas auprès du Caenorhabditis elegans Genetics Center (https://cgc.umn.edu/). Les souches exprimant la GFP dans les neurones dopaminergiques (OH 7457), les neurones cholinergiques (LX 929) ou mCherry exprimées dans tous les neurones (PVX4) sont toutes de bons choix. Les élèves ont également pu mesurer la locomotion et obtenir des données pour accompagner l’évaluation de la morphologie. Une description complète d’un projet de groupe d’étudiants de plusieurs semaines peut être trouvée dans Susman5.
Ce projet de groupe d’étudiants est assez peu coûteux et facile à mettre en place pour des groupes de quatre étudiants. Les matériaux nécessaires comprennent un microscope à dissection, l’accès à un microscope composé à fluorescence pouvant avoir un appareil photo numérique attaché, des plaques de Petri et l’accès à une gélose de croissance des nématodes, des bactéries à croissance limitée (souche OP50, de la CGC), un brûleur Bunsen à flamme gazeuse ou une lampe à alcool, un autoclave, un fil de platine et des fournitures de laboratoire générales comme des micropipetters, des lames de microscope, couvercles et pipettes Pasteur en verre. Selon le toxique chimique examiné par les groupes d’étudiants, les étapes du protocole peuvent devoir se dérouler sous une hotte ou avec des gants. Ce protocole utilise des mélanges chimiques solubles dans l’eau (non volatils) et toutes les procédures de manipulation sécuritaire recommandées par le fabricant sont suivies.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP97445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1AGAH0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol lamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;17012826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-012-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strains</td>
			<td>C. elegans Genetics Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1147030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain (OP50)</td>
			<td>C. elegans Genetics Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;131045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9723-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;05408129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-265446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>94060316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-386-319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-1M30P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ61413AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC447810250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining the effect of pesticides on caenorhabditis elegans neurons

Caenorhabditis elegans est un puissant organisme modèle utilisé dans de nombreux laboratoires de recherche pour comprendre les conséquences de l’exposition aux polluants chimiques, aux pesticides et à une grande variété de substances toxiques. Ces nématodes sont faciles à utiliser et peuvent être utilisés pour générer de nouveaux résultats de recherche, même dans le laboratoire de biologie de premier cycle. Une série de laboratoires de plusieurs semaines de projets de recherche authentiques dirigés par des étudiants forme les étudiants à une boîte à outils de techniques et d’approches en mesures comportementales, en biologie cellulaire et en microscopie qu’ils appliquent ensuite à leurs projets. Une technique de cette boîte à outils consiste à quantifier le pourcentage de neurones présentant des dommages neurodégénératifs à la suite d’une exposition à un toxique chimique comme un pesticide. Les nématodes C. elegans jeunes adultes peuvent être exposés à différentes concentrations de pesticides disponibles dans le commerce ou d’autres types de toxiques pendant 2 à 24 h. Ensuite, les étudiants de premier cycle peuvent visualiser différents sous-types de neurones en utilisant des souches de C. elegans exprimant la fluorescence. Ces techniques ne nécessitent pas de logiciel de traitement d’image sophistiqué et sont efficaces même à faible grossissement, ce qui rend inutile le besoin d’une microscopie confocale coûteuse. Cet article montre comment traiter les nématodes avec des pesticides et comment imager et marquer les neurones. Il fournit également un protocole simple pour la microscopie et l’analyse de la morphologie des neurones. Les matériaux utilisés pour cette technique sont peu coûteux et facilement disponibles dans la plupart des départements de biologie de premier cycle. Cette technique peut être combinée avec des mesures comportementales telles que la locomotion, le ralentissement basal ou la ponte pour mener une série d’expériences potentiellement publiables et donner aux étudiants de premier cycle une expérience de recherche authentique à un coût très faible.

Les méthodes et les protocoles décrits dans cet article fournissent des compétences de laboratoire importantes pour les étudiants de premier cycle de niveau intermédiaire en biologie ou en neurosciences. Les étudiants peuvent acquérir une expérience importante dans le développement d’un projet indépendant et la réalisation d’une expérience de leur propre conception qui pourrait fournir de nouveaux résultats. La figure 3 montre un résultat optimal d’un projet étudiant qui...

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Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Les nématodes Caenorhabditis elegans jeunes adultes sont exposés à différentes concentrations de pesticides commerciaux ou d’autres toxiques pendant 2 à 24 h. Ensuite, différents neurones peuvent être visualisés à l’aide de souches exprimant la fluorescence. Cet article montre comment exposer les nématodes aux pesticides et évaluer les dommages aux neurones.

Examen de l’effet des pesticides sur les neurones de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a powerful model organism used in many research laboratories to understand the consequences of exposure to chemical pollutants, ...

Ce protocole est un moyen simple et réalisable pour les étudiants de premier cycle de mener des recherches authentiques qui pourraient conduire à des résultats publiables. Le principal avantage est que les étudiants peuvent mener des recherches originales sur des questions qu’ils décident eux-mêmes. Pour commencer, fabriquez un épandeur de solution en pliant soigneusement une pipette Pasteur en verre de neuf millilitres dans une flamme de brûleur Bunsen et fermez l’ouverture de la pipette.Ensuite, l’éthanol stérilise l’épandeur avant chaque étalement sur la plaque de Pétri. À l’aide d’un micropipetter, placez 100 microlitres de la dilution au centre de la gélose et étalez doucement sur la surface avec l’épandeur stérilisé. Ensuite, mettez de côté les boîtes de Petri couvertes et laissez la solution tremper dans la surface jusqu’à ce qu’elle soit sèche.Pour les périodes d’exposition supérieures à 12 heures, ajouter 50 microlitres d’une culture nocturne d’Escherichia coli aux plaques avant d’ajouter les nématodes, alors que pour les expériences aiguës de 12 heures ou moins, il n’est pas nécessaire d’avoir E. coli sur les plaques. À l’aide d’une micropipette, placez un millilitre d’eau stérile sur la plaque de nématodes. Ensuite, faites pivoter l’eau pour soulever les nématodes, puis retirez le liquide avec les nématodes dans un tube de microfuge de 1,5 millilitre.Après 10 minutes, lorsque les nématodes se sont déposés par gravité, retirez soigneusement au moins 500 microlitres d’eau et jetez-les. Ensuite, remettez en suspension les nématodes et, à l’aide d’une pointe de pipette jaune coupée, retirez 50 à 100 microlitres de vers en suspension dans chaque plaque de traitement, en vous assurant que chaque plaque contient au moins 10 vers adultes. Préparez deux diapositives en plaçant un morceau de ruban adhésif sur un seul côté de la diapositive pour former un tampon d’épaisseur uniforme, puis placez une glissière propre inutilisée entre elles sur la paillasse.Placez une goutte de 10 microlitres d’agarose fondue sur le centre de la lame à l’aide d’un micropipetter. Ensuite, aplatissez la goutte en plaçant une autre lame propre sur le dessus perpendiculairement à la glissière avec la goutte et appliquez une pression pour que la goutte d’agarose forme l’épaisseur du ruban d’étiquetage. Ensuite, appliquez une pression constante pour séparer les deux glissières.Ensuite, posez cette glissière avec le côté agar vers le haut sur la paillasse et laissez-la sécher pendant une à deux minutes avant de l’utiliser. Pour ajouter des nématodes de la lame préparée avec le tampon d’agarose, ajoutez une goutte d’eau de cinq microlitres contenant un azoture molaire de sodium au tampon de gélose, ce qui anesthésiera les vers et les mobilisera. Ensuite, transférer à 10 nématodes par lame de traitement à la gouttelette à l’aide d’un pic à vers, qui doit être stérilisé avant et après le transfert des nématodes.Ensuite, ajoutez un glissement de couverture à l’aide d’une pince en le plaçant à un angle et en l’abaissant lentement. Ensuite, placez la monture humide préparée sur un microscope fluorescent pour observer les vers d’abord sous un grossissement et un contraste de phase de 10X, puis sous un grossissement de 40X avec contraste de phase et éclairage fluorescent. Placez une monture humide préparée à la fois sur la scène du microscope et fixez-la en place à l’aide des clips de la scène du microscope, puis commencez à visualiser les montures humides avec l’objectif de grossissement le plus bas, qui est généralement de 10X et utilisez un champ lumineux ou un contraste de phase pour visualiser et se concentrer sur les nématodes.Une fois qu’un nématode est situé dans le champ de vision, concentrez-vous dessus à l’aide du bouton de mise au point fine du microscope, puis basculez l’éclairage en fluorescence en tournant le cadran et dirigez la lumière vers l’appareil photo pour capturer les images numériques. Ensuite, ajustez l’éclairage à l’aide du logiciel d’imagerie afin que les neurones soient brillamment éclairés, mais pas sursaturés. À un moment donné, obtenez une image séparée d’une règle au même grossissement que les images de cellule pour fournir une échelle de grossissement pour leur figure.Les effets du pesticide contenant du manganèse sur la morphologie des neurones dopaminergiques à l’aide d’une souche dans laquelle les neurones dopaminergiques exprimaient la GFP ont été étudiés montrant un signal lumineux. Cependant, le signal fluorescent blanchit si les neurones sont exposés à la lumière pendant de longues périodes. Cette procédure peut faire partie d’un projet de plusieurs semaines dirigé par des étudiants qui peut également inclure des données comportementales ou autres.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

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