Name: examining the effect of pesticides on caenorhabditis elegans neurons
Uploaded: 2022-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

Il lavoro descritto in questo manoscritto è stato fatto per una classe di livello intermedio in neuroscienze. I fondi per i reagenti e le forniture sono stati forniti dal Dipartimento di Biologia del Vassar College. I microscopi e il sistema di imaging digitale sono stati forniti anche dal Dipartimento di Biologia del Vassar College. L'autore ringrazia tutti i numerosi studenti che hanno seguito questo corso.

Tutto l'uso di animali invertebrati era conforme alle linee guida per la cura e l'uso degli animali dell'istituzione.
1. Preparazione di piastre di Petri rivestite di pesticidi
<ol><li>Preparare le piastre di Petri di agar (6 cm di diametro funzionano meglio) utilizzando le procedure standard6. NOTA: Questi possono essere fatti con mesi di anticipo e conservati in frigorifero fino all'uso. Portare le piastre a temperatura ambiente (RT) sul banco. N...

<ol>
	<li>Duzguner, V., Erdogan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+exposure+to+imidacloprid+induces+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+liver+&amp;+central+nervous+system+of+rats.">Chronic exposure to imidacloprid induces inflammation and oxidative stress in the liver &amp; central nervous system of rats.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 104 (1), 58-64 (2012).</li><li>Catae, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+a+sublethal+concentration+of+imidacloprid+and+the+side+effects+on+target+and+nontarget+organs+of+Apis+mellifera+(Hymenoptera,+Apidae).">Exposure to a sublethal concentration of imidacloprid and the side effects on target and nontarget organs of Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae).</a> Ecotoxicology. 27 (2), 109-121 (2018).</li><li>Bradford, B. R., Whidden, E., Gervasio, E. D., Checchi, P. M., Raley-Susman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonicotinoid-containing+insecticide+disruption+of+growth,+locomotion,+and+fertility+in+Caenorhabditis+elegans.">Neonicotinoid-containing insecticide disruption of growth, locomotion, and fertility in Caenorhabditis elegans.</a> PLOS One. 15 (9), 0238637 (2020).</li><li>Jospin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+acetylcholine+receptor+regulates+the+balance+of+muscle+excitation+and+inhibition+in+Caenorhabditis+elegans.">A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 7 (12), 1000265 (2009).</li><li>Susman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Discovery-Based Learning in the Life Sciences. , (2015).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Brody, H. A., Chou, E., Gray, J. M., Pokyrwka, N. J., Raley-Susman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mancozeb-induced+behavioral+deficits+precede+structural+neural+degeneration.">Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration.</a> NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).</li><li>Chen, P., Martinez-Finley, E. J., Bornhorst, J., Chakraborty, S., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal-induced+neurodegeneration+in+C.+elegans.">Metal-induced neurodegeneration in C. elegans.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 5, (2013).</li><li>Hart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior.">Behavior.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Harlow, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nematode+Caenorhabditis+elegans+as+a+tool+to+predict+chemical+activity+on+mammalian+development+and+identify+mechanisms+influencing+toxicological+outcome.">The nematode Caenorhabditis elegans as a tool to predict chemical activity on mammalian development and identify mechanisms influencing toxicological outcome.</a> Scientific Reports. 6 (1), 22965 (2016).</li></ol>

I protocolli descritti in questo manoscritto funzionano con successo da soli o come parte di un progetto di gruppo di studenti indipendenti di più settimane. I protocolli sono anche suscettibili di esperienze esplorative autonome di una settimana. I ceppi di nematodi sono economici e facili da mantenere nel laboratorio di ricerca. Gli studenti possono facilmente imparare come raccogliere i vermi con un piccone o come spostarli lavando le piastre con acqua e permettendo loro di stabilirsi per gravità. Gli esperimenti po...

Caenorhabditis elegans è un eccellente organismo modello per la formazione di corsi di laboratorio in corsi di scienze biologiche per studenti di livello introduttivo e intermedio. Questa procedura di laboratorio può essere utilizzata come parte di un modulo di più settimane che esplora vari effetti dei pesticidi comunemente usati sul comportamento di C. elegans e sulla biologia cellulare. Gli studenti possono imparare come progettare e realizzare progetti indipendenti che insegnano loro l'analisi dei dati e le capacità di presentazione. Questo documento si concentra sui protocolli per esporre C. elegans a miscele di pesticidi e quindi osservare e analizzare gli effetti sulla morfologia dei neuroni.
Le miscele di pesticidi chimici per prato sono ampiamente utilizzate per uso residenziale e agricolo e possono essere acquistate in qualsiasi negozio di giardinaggio locale. C'è una crescente preoccupazione per la sicurezza di queste sostanze chimiche perl'uomo e la fauna selvatica 1,2,3. Gli studenti possono leggere la letteratura scientifica e selezionare un pesticida per la valutazione sperimentale e, così facendo, possono conoscere la biologia e la neurobiologia di base, nonché importanti abilità di laboratorio come la progettazione e l'analisi sperimentale e le abilità generali di laboratorio come pipettaggio e diluizioni seriali, microscopia sezionante, microscopia fluorescente, fotografia digitale e produzione di figure.
I protocolli descritti in questo articolo possono stare da soli in un corso di livello intermedio in biologia o neuroscienze o far parte di un modulo di più settimane che potrebbe anche includere misurazioni di comportamenti governati da particolari gruppi di neuroni. Ad esempio, descritta in questo protocollo è una valutazione della morfologia dei neuroni colinergici che governano la locomozione utilizzando un ceppo di nematode che esprime GFP (LX 929) nei neuroni colinergici4. Questi ceppi possono essere ottenuti a prezzi molto bassi dal Caenorhabditis elegans Genetics Center (https://cgc.umn.edu/). I ceppi che esprimono GFP nei neuroni dopaminergici (OH 7457), nei neuroni colinergici (LX 929) o mCherry espressi in tutti i neuroni (PVX4) sono tutte buone scelte. Gli studenti potrebbero anche misurare la locomozione e ottenere dati per accompagnare la valutazione della morfologia. Una descrizione completa di un progetto di gruppo di studenti di più settimane può essere trovata in Susman5.
Questo progetto di gruppo di studenti è abbastanza economico e facile da configurare per gruppi di quattro studenti. I materiali necessari includono un microscopio di dissezione, l'accesso a un microscopio composto a fluorescenza che può avere una fotocamera digitale collegata, piastre di Petri e accesso all'agar di crescita dei nematodi, batteri con crescita limitata (ceppo OP50, dal CGC), un bruciatore Bunsen a fiamma di gas o una lampada ad alcool, un'autoclave, filo di platino e forniture di laboratorio generali come micropipetteri, vetrini per microscopi, coverslips e pipette Pasteur in vetro. A seconda del tossico chimico esaminato dai gruppi di studenti, le fasi del protocollo potrebbero dover verificarsi sotto un cappuccio di fumo o con i guanti. Questo protocollo utilizza miscele chimiche solubili in acqua (non volatili) e vengono seguite tutte le procedure di manipolazione sicura raccomandate dal produttore.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP97445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1AGAH0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol lamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;17012826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-012-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strains</td>
			<td>C. elegans Genetics Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1147030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain (OP50)</td>
			<td>C. elegans Genetics Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;131045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9723-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;05408129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-265446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>94060316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-386-319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-1M30P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ61413AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC447810250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining the effect of pesticides on caenorhabditis elegans neurons

Caenorhabditis elegans è un potente organismo modello utilizzato in molti laboratori di ricerca per comprendere le conseguenze dell'esposizione a inquinanti chimici, pesticidi e un'ampia varietà di sostanze tossiche. Questi nematodi sono facili da lavorare e possono essere utilizzati per generare nuovi risultati di ricerca, anche nel laboratorio di biologia universitaria. Una serie di laboratori di più settimane di progetti di ricerca autentici e guidati dagli studenti forma gli studenti in un toolkit di tecniche e approcci in misurazioni comportamentali, biologia cellulare e microscopia che poi applicano ai loro progetti. Una tecnica in quel toolkit è quantificare la percentuale di neuroni che mostrano danni neurodegenerativi a seguito dell'esposizione a un tossico chimico come un pesticida. I nematodi C. elegans giovani adulti possono essere esposti a diverse concentrazioni di pesticidi disponibili in commercio o altri tipi di sostanze tossiche per 2-24 ore. Quindi, gli studenti universitari possono visualizzare diversi sottotipi di neuroni utilizzando ceppi fluorescenti di C. elegans. Queste tecniche non richiedono sofisticati software di elaborazione delle immagini e sono efficaci anche a bassi ingrandimenti, rendendo superflua la necessità di costose microscopie confocali. Questo documento dimostra come trattare i nematodi con pesticidi e come visualizzare e segnare i neuroni. Fornisce inoltre un protocollo semplice per la microscopia e l'analisi della morfologia dei neuroni. I materiali utilizzati per questa tecnica sono economici e prontamente disponibili nella maggior parte dei dipartimenti di biologia universitari. Questa tecnica può essere combinata con misure comportamentali come la locomozione, il rallentamento basale o la deposizione delle uova per condurre una serie di esperimenti potenzialmente pubblicabili e offrire agli studenti universitari un'autentica esperienza di ricerca a un costo molto basso.

I metodi e i protocolli descritti in questo documento forniscono importanti competenze di laboratorio per studenti universitari di livello intermedio in biologia o neuroscienze. Gli studenti possono acquisire un'esperienza importante nello sviluppo di un progetto indipendente e condurre un esperimento del proprio design che potrebbe fornire nuovi risultati. La Figura 3 mostra un risultato ottimale di un progetto studentesco che alla fine è diventato parte di un documento pubblicato<sup clas...

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Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

I nematodi caenorhabditis elegans giovani adulti sono esposti a diverse concentrazioni di pesticidi commerciali o altre sostanze tossiche per 2-24 ore. Quindi, diversi neuroni possono essere visualizzati utilizzando ceppi che esprimono fluorescenza. Questo documento dimostra come esporre i nematodi ai pesticidi e valutare il danno ai neuroni.

Esaminare l'effetto dei pesticidi sui neuroni caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a powerful model organism used in many research laboratories to understand the consequences of exposure to chemical pollutants, ...

Questo protocollo è un modo semplice e fattibile per gli studenti universitari di condurre ricerche autentiche che potrebbero portare a risultati pubblicabili. Il vantaggio principale è che gli studenti possono condurre ricerche originali su domande che decidono da soli. Per iniziare, fare uno spandiluvitore di soluzioni piegando con cura una pipetta Pasteur di vetro da nove millilitri in una fiamma del bruciatore Bunsen e chiudere l'apertura della pipetta.Quindi l'etanolo sterilizza lo spargitore prima di ogni diffusione sulla piastra di Petri. Utilizzando un micropipettero, posizionare 100 microlitri della diluizione sul centro dell'agar e distribuire delicatamente sulla superficie con lo spargitore sterilizzato. Quindi mettere da parte le piastre di Petri coperte e lasciare la soluzione in ammollo in superficie fino a quando non si asciuga.Per periodi di esposizione superiori a 12 ore, aggiungere 50 microlitri di una coltura notturna di Escherichia coli alle piastre prima di aggiungere i nematodi, mentre per esperimenti acuti di 12 ore o meno, non è necessario avere E.coli sulle piastre. Usando una micropipetta, posizionare un millilitro di acqua sterile sulla piastra dei nematodi. Quindi, avvolgere l'acqua per sollevare i nematodi, quindi rimuovere il liquido con i nematodi in un tubo di microfuga da 1,5 millilitri.Dopo 10 minuti, mentre i nematodi si depositano per gravità, rimuovere con cura almeno 500 microlitri dell'acqua e scartare. Quindi risospese i nematodi e, utilizzando una punta della pipetta gialla tagliata, rimuovere da 50 a 100 microlitri di vermi sospesi in ogni piastra di trattamento, assicurandosi che ogni piastra abbia almeno 10 vermi adulti. Preparare due diapositive posizionando un pezzo di nastro adesivo su un solo lato del vetrino per formare un tampone di spessore uniforme, quindi posizionare un vetrino inutilizzato pulito tra di loro sul piano di lavoro.Posizionare una goccia di 10 microlitri di agarosio fuso al centro del vetrino usando un micropipettero. Quindi appiattire la goccia posizionando un'altra diapositiva pulita sulla parte superiore perpendicolare alla diapositiva con la goccia e applicare una pressione in modo che la goccia di agarosio formi lo spessore del nastro adesivo. Successivamente, applicare una pressione costante per separare le due diapositive.Quindi appoggiare questo vetrino con il lato dell'agar sul piano di lavoro e lasciarlo asciugare per uno o due minuti prima dell'uso. Per aggiungere nematodi del vetrino preparato con il tampone di agarosio, aggiungere una goccia d'acqua di cinque microlitri contenente un azide di sodio molare al tampone di agar, che anestetizzerà i vermi e li mobiliterà. Quindi trasferire a 10 nematodi per vetrino di trattamento sulla goccia usando un plettro a verme, che deve essere sterilizzato prima e dopo il trasferimento dei nematodi.Quindi, aggiungi una scivolata di copertura usando una pinza posizionandola ad angolo e abbassandola lentamente. Successivamente, posizionare il supporto bagnato preparato su un microscopio fluorescente per osservare i vermi prima sotto l'ingrandimento 10X e il contrasto di fase, quindi sotto l'ingrandimento 40X con contrasto di fase e illuminazione fluorescente. Posizionare un supporto a umido preparato alla volta sullo stadio del microscopio e fissarlo in posizione utilizzando le clip dello stadio del microscopio, quindi iniziare a visualizzare i supporti bagnati con l'obiettivo di ingrandimento più basso, che in genere è 10X e utilizzare un campo luminoso o un contrasto di fase per visualizzare e concentrarsi sui nematodi.Una volta che un nematode si trova nel campo visivo, concentrati su di esso usando la manopola di messa a fuoco fine sul microscopio, quindi passa l'illuminazione alla fluorescenza ruotando il quadrante e dirigi la luce verso la fotocamera per catturare le immagini digitali. Quindi, regolare l'illuminazione utilizzando il software di imaging in modo che i neuroni siano illuminati in modo luminoso, ma non sovrasaturati. Ad un certo punto, ottenere un'immagine separata di un righello allo stesso ingrandimento delle immagini delle celle per fornire una scala di ingrandimento per la loro figura.Gli effetti del pesticida contenente manganese sulla morfologia dei neuroni della dopamina utilizzando un ceppo in cui i neuroni della dopamina esprimevano GFP sono stati studiati mostrando un segnale luminoso. Tuttavia, il segnale fluorescente sbianca se i neuroni sono esposti alla luce per lunghi periodi di tempo. Questa procedura può far parte di un progetto guidato dagli studenti di più settimane che può anche includere dati comportamentali o di altro tipo.

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