Name: examining the effect of pesticides on caenorhabditis elegans neurons
Uploaded: 2022-05-27T15:00:00
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この原稿に記載されている作業は、神経科学の中級レベルのクラスのために行われました。試薬と物資のための資金は、ヴァッサー大学の生物学部によって提供された。顕微鏡とデジタルイメージングシステムもヴァッサー大学の生物学部によって提供されました。著者は、このコースを受講した多くの学生全員に感謝します。

無脊椎動物のすべての使用は、施設の動物ケアおよび使用ガイドラインに準拠していた。
1. 農薬でコーティングされたペトリプレートの作製
<ol><li>寒天ペトリ皿(直径6cmが最適)を標準的な手順6を使用して準備する。 注:これらは数ヶ月前に作成し、使用時まで冷蔵庫に保管することができます。ベンチトップでプレートを室温(RT)にしま?...

<ol>
	<li>Duzguner, V., Erdogan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+exposure+to+imidacloprid+induces+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+liver+&amp;+central+nervous+system+of+rats.">Chronic exposure to imidacloprid induces inflammation and oxidative stress in the liver &amp; central nervous system of rats.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 104 (1), 58-64 (2012).</li><li>Catae, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+a+sublethal+concentration+of+imidacloprid+and+the+side+effects+on+target+and+nontarget+organs+of+Apis+mellifera+(Hymenoptera,+Apidae).">Exposure to a sublethal concentration of imidacloprid and the side effects on target and nontarget organs of Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae).</a> Ecotoxicology. 27 (2), 109-121 (2018).</li><li>Bradford, B. R., Whidden, E., Gervasio, E. D., Checchi, P. M., Raley-Susman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonicotinoid-containing+insecticide+disruption+of+growth,+locomotion,+and+fertility+in+Caenorhabditis+elegans.">Neonicotinoid-containing insecticide disruption of growth, locomotion, and fertility in Caenorhabditis elegans.</a> PLOS One. 15 (9), 0238637 (2020).</li><li>Jospin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+acetylcholine+receptor+regulates+the+balance+of+muscle+excitation+and+inhibition+in+Caenorhabditis+elegans.">A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 7 (12), 1000265 (2009).</li><li>Susman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Discovery-Based Learning in the Life Sciences. , (2015).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Brody, H. A., Chou, E., Gray, J. M., Pokyrwka, N. J., Raley-Susman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mancozeb-induced+behavioral+deficits+precede+structural+neural+degeneration.">Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration.</a> NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).</li><li>Chen, P., Martinez-Finley, E. J., Bornhorst, J., Chakraborty, S., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal-induced+neurodegeneration+in+C.+elegans.">Metal-induced neurodegeneration in C. elegans.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 5, (2013).</li><li>Hart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior.">Behavior.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Harlow, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nematode+Caenorhabditis+elegans+as+a+tool+to+predict+chemical+activity+on+mammalian+development+and+identify+mechanisms+influencing+toxicological+outcome.">The nematode Caenorhabditis elegans as a tool to predict chemical activity on mammalian development and identify mechanisms influencing toxicological outcome.</a> Scientific Reports. 6 (1), 22965 (2016).</li></ol>

この原稿に記載されているプロトコルは、単独で、または数週間の独立した学生グループプロジェクトの一環として成功裏に機能します。プロトコルは、スタンドアロンの1週間の探索的経験にも適しています。線虫株は安価で、実験室で維持するのが簡単です。生徒は、ワームピックでワームを選ぶ方法や、プレートを水で洗い流し、重力で落ち着かせることによってそれらを動かす方法を...

Caenorhabditis elegans は、入門および中級レベルの学生のための生物科学コースの実験室コーストレーニングのための優れたモデル生物です。この実験室手順は、 C. elegans の行動および細胞生物学に対する一般的に使用される農薬の様々な影響を探求する数週間のモジュールの一部として使用することができる。学生は、データ分析とプレゼンテーションのスキルを教える独立したプロジェクトを設計して実行する方法を学ぶことができます。本稿では、 C. elegans を農薬混合物に曝露し、ニューロン形態への影響を観察および分析するためのプロトコルに焦点を当てる。
芝生の化学農薬混合物は、住宅用および農業用として広く使用されており、地元のガーデンストアで購入できます。人間や野生生物に対するこれらの化学物質の安全性に対する懸念が高まっています1,2,3。学生は科学文献を読み、実験評価のために農薬を選択することができ、そうすることで、基本的な生物学と神経生物学、実験設計や分析などの重要な実験室スキル、ピペッティングや連続希釈、解剖顕微鏡、蛍光顕微鏡、デジタル写真、フィギュア制作などの一般的なラボスキルを学ぶことができます。
この論文で説明するプロトコルは、生物学または神経科学の中級レベルのコースで単独で立つことも、特定のニューロングループによって支配される行動の測定を含む複数週のモジュールの一部にすることもできます。例えば、このプロトコールに記載されているのは、コリン作動性ニューロン4においてGFP(LX 929)を発現する線虫の株を用いた移動運動を支配するコリン作動性ニューロンの形態の評価である。これらの株は、 Caenorhabditis elegans Genetics Center(https://cgc.umn.edu/)から非常に低価格で入手できます。ドーパミン作動性ニューロン(OH 7457)、コリン作動性ニューロン(LX 929)、またはすべてのニューロンで発現されるmCherry(PVX4)においてGFPを発現する株はすべて良い選択である。学生はまた、移動を測定し、形態学の評価に付随するデータを取得することもできます。複数週間の学生グループプロジェクトの詳細については、Susman5を参照してください。
この学生グループプロジェクトは非常に安価で、4人の学生のグループのためにセットアップするのが簡単です。必要な材料には、解剖顕微鏡、取り付けられたデジタルカメラを持つことができる蛍光化合物顕微鏡へのアクセス、ペトリプレートおよび線虫増殖寒天へのアクセス、増殖が制限された細菌(CGC由来のOP50株)、ガス炎ブンゼンバーナーまたはアルコールランプ、オートクレーブ、白金線、およびマイクロピペッター、顕微鏡スライドなどの一般的な実験室用品が含まれます。 カバースリップ、ガラスパスツールピペット。学生グループによって検査されている化学毒物に応じて、プロトコルのステップはヒュームフードの下または手袋で行われる必要があるかもしれません。このプロトコルは、水溶性(揮発性ではない)の化学混合物を使用し、製造業者が推奨するすべての安全な取り扱い手順に従います。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP97445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1AGAH0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol lamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;17012826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-012-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strains</td>
			<td>C. elegans Genetics Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1147030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain (OP50)</td>
			<td>C. elegans Genetics Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;131045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9723-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;05408129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-265446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>94060316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-386-319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-1M30P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ61413AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC447810250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining the effect of pesticides on caenorhabditis elegans neurons

Caenorhabditis elegans は、化学汚染物質、農薬、および多種多様な有毒物質への曝露の結果を理解するために多くの研究所で使用される強力なモデル生物である。これらの線虫は扱いやすく、学部の生物学研究室でも新しい研究成果を生み出すために使用できます。数週間にわたる本格的な学生主導の研究プロジェクトのラボシリーズは、行動測定、細胞生物学、顕微鏡検査の技術とアプローチのツールキットを学生に訓練し、プロジェクトに適用します。そのツールキットの1つの技術は、農薬のような化学毒性物質にさらされた後に神経変性損傷を示すニューロンの割合を定量化することです。若年成人 のC. elegans 線虫は、市販の農薬または他のタイプの毒性物質の異なる濃度に2〜24時間曝露され得る。その後、学部生は、蛍光発現株の C. elegansを用いて、異なるニューロンサブタイプを視覚化することができる。これらの技術は、高度な画像処理ソフトウェアを必要とせず、低倍率でも有効であるため、高価な共焦点顕微鏡の必要性が不要である。この論文は、線虫を農薬で処理する方法と、ニューロンを画像化してスコアリングする方法を示しています。また、ニューロン形態の顕微鏡検査および分析のための簡単なプロトコルも提供します。この技術に使用される材料は安価で、ほとんどの学部生物学部門で容易に入手可能です。このテクニックは、移動、基礎減速、産卵などの行動尺度と組み合わせて、潜在的に公開可能な一連の実験を行い、学部生に非常に低コストで本物の研究体験を提供することができます。

この論文で説明されている方法とプロトコルは、生物学または神経科学の中級レベルの学部生にとって重要な実験室スキルを提供します。学生は、独立したプロジェクトを開発し、斬新な結果をもたらすことができる独自の設計の実験を行う上で重要な経験を得ることができます。 図3は 、最終的に出版された論文3の一部となった学生プロジェクトの...

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Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

若年成人 のCaenorhabditis elegans 線虫は、異なる濃度の市販の農薬または他の毒性物質に2〜24時間曝露される。次いで、蛍光発現株を用いて異なるニューロンを視覚化することができる。この論文は、線虫を農薬にさらし、ニューロンの損傷を評価する方法を実証する。

カエノルハブディティス・エレガンス神経細胞に対する農薬の効果の検討

Caenorhabditis elegans is a powerful model organism used in many research laboratories to understand the consequences of exposure to chemical pollutants, ...

このプロトコルは、学部生が出版可能な結果につながる可能性のある本物の研究を行うための簡単で実行可能な方法です。主な利点は、学生が自分で決めた問題について独自の研究を行うことができることです。まず、9ミリリットルのガラス製パスツールピペットをブンゼンバーナーの炎で慎重に曲げて溶液スプレッダーを作り、ピペットの開口部を閉じます。次に、ペトリプレート上に各スプレッドが広がる前にスプレッダーをエタノール滅菌します。マイクロピペッターを使用して、100マイクロリットルの希釈液を寒天の中心に置き、滅菌スプレッダーで表面全体に静かに広げる。その後、覆ったペトリ皿を脇に置き、溶液を乾くまで表面に浸します。12時間を超える曝露期間の場合、線虫を添加する前に50マイクロリットルの大腸菌の一晩培養物をプレートに加えるが、12時間以下の急性実験では、プレート上に大腸菌を有する必要はない。マイクロピペットを使用して、線虫のプレート上に1ミリリットルの滅菌水を置く。次に、線虫を持ち上げるために水を振り回し、線虫と一緒に液体を1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに取り除く。10分後、線虫が重力によって落ち着いたら、少なくとも500マイクロリットルの水を慎重に取り除き、捨てる。その後、線虫を再懸濁し、切り取られた黄色のピペットチップを使用して、各処理プレートに50〜100マイクロリットルの懸濁したワームを除去し、各プレートに少なくとも10匹の成虫があることを確認する。スライドの片側だけにラベルテープを貼って均一な厚さのパッドを形成し、その間に清潔な未使用のスライドをベンチトップに置き、スライドを2枚用意します。マイクロピペッターを使用して、溶融したアガロースの10マイクロリットルの滴をスライドの中央に置きます。次に、別のきれいなスライドをスライドと垂直な上に置き、アガロースドロップがラベリングテープの厚さを形成するように圧力をかけて、ドロップを平らにします。その後、一定の圧力をかけて 2 つのスライドを分離します。次に、このスライドを寒天側を上にしてベンチトップに置き、1〜2分間乾燥させてから使用してください。調製したスライドの線虫をアガロースパッドで追加するには、1モルのアジ化ナトリウムを含む5マイクロリットルの水滴を寒天パッドに加え、ワームを麻酔して動員します。次に、線虫を移す前後に滅菌する必要があるワームピックを使用して、治療スライドあたり10個の線虫を液滴に移す。次に、鉗子を使ってカバースリップを斜めに置き、ゆっくりと下げて追加します。その後、準備したウェットマウントを蛍光顕微鏡の上に置き、最初に10倍の倍率と位相コントラストの下でワームを観察し、次に位相コントラストと蛍光照明で40倍の倍率でワームを観察しました。準備したウェットマウントを一度に1つずつ顕微鏡ステージに置き、顕微鏡ステージクリップを使用して所定の位置に固定し、最も低い倍率対物レンズ(通常は10倍)でウェットマウントの表示を開始し、明視野または位相コントラストを使用して線虫を視覚化し、焦点を合わせます。線虫が視野に入ったら、顕微鏡の細かいフォーカスノブを使って線虫に焦点を合わせ、ダイヤルを回して照明を蛍光に切り替え、カメラに光を向けてデジタル画像をキャプチャします。次に、イメージングソフトウェアを使用して照明を調整して、ニューロンが明るく照らされるが過飽和にならないようにします。ある時点で、セル画像と同じ倍率で定規の別の画像を取得して、その図の倍率スケールを提供します。ドーパミンニューロンがGFPを発現した株を用いてドーパミンニューロン形態に及ぼすマンガン含有農薬の影響を、明るいシグナルを示すものとして検討した。しかし、蛍光シグナルは、ニューロンが長期間光にさらされると漂白する。この手順は、行動やその他のデータを含めることができる複数週の学生主導のプロジェクトの一部にすることができます。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

認知に関する情動の損なう効果の脳イメージング研究

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

カットローディング：網膜ニューロン間ギャップ結合トレーサーカップリングの程度を調べるための便利なツール

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</emAmylopathyの研究のための&gt;モデルシステム

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

抗精神病薬の作用のメカニズムを研究するための方法<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

の歩行速度に対するエタノールの効果を測定するためのアッセイ<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

の長期カルシウムイメージングのためのアガロースマイクロチャンバー<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

新規メトリックは、線虫の胚伸びを特徴づけるために、<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...