Name: examining the effect of pesticides on caenorhabditis elegans neurons
Uploaded: 2022-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

Arbeidet beskrevet i dette manuskriptet ble gjort for en mellomnivåklasse i nevrovitenskap. Midler til reagenser og forsyninger ble gitt av biologiavdelingen ved Vassar College. Mikroskopene og det digitale bildesystemet ble også levert av biologiavdelingen ved Vassar College. Forfatteren takker alle de mange studentene som tok dette kurset.

All bruk av hvirvelløse dyr var i samsvar med institusjonens retningslinjer for dyrepleie og bruk.
1. Tilberedning av plantevernmiddelbelagte Petri-plater
<ol><li>Forbered agar Petri retter (6 cm diameter fungerer best) ved hjelp av standard prosedyrer6. MERK: Disse kan gjøres måneder i forveien og oppbevares i kjøleskapet til bruk. Ta platene til romtemperatur (RT) på benken. I de fleste tilfeller bør studentgruppene få en tallerken for hve...

<ol>
	<li>Duzguner, V., Erdogan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+exposure+to+imidacloprid+induces+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+liver+&amp;+central+nervous+system+of+rats.">Chronic exposure to imidacloprid induces inflammation and oxidative stress in the liver &amp; central nervous system of rats.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 104 (1), 58-64 (2012).</li><li>Catae, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+a+sublethal+concentration+of+imidacloprid+and+the+side+effects+on+target+and+nontarget+organs+of+Apis+mellifera+(Hymenoptera,+Apidae).">Exposure to a sublethal concentration of imidacloprid and the side effects on target and nontarget organs of Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae).</a> Ecotoxicology. 27 (2), 109-121 (2018).</li><li>Bradford, B. R., Whidden, E., Gervasio, E. D., Checchi, P. M., Raley-Susman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonicotinoid-containing+insecticide+disruption+of+growth,+locomotion,+and+fertility+in+Caenorhabditis+elegans.">Neonicotinoid-containing insecticide disruption of growth, locomotion, and fertility in Caenorhabditis elegans.</a> PLOS One. 15 (9), 0238637 (2020).</li><li>Jospin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+acetylcholine+receptor+regulates+the+balance+of+muscle+excitation+and+inhibition+in+Caenorhabditis+elegans.">A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 7 (12), 1000265 (2009).</li><li>Susman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Discovery-Based Learning in the Life Sciences. , (2015).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Brody, H. A., Chou, E., Gray, J. M., Pokyrwka, N. J., Raley-Susman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mancozeb-induced+behavioral+deficits+precede+structural+neural+degeneration.">Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration.</a> NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).</li><li>Chen, P., Martinez-Finley, E. J., Bornhorst, J., Chakraborty, S., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal-induced+neurodegeneration+in+C.+elegans.">Metal-induced neurodegeneration in C. elegans.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 5, (2013).</li><li>Hart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior.">Behavior.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Harlow, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nematode+Caenorhabditis+elegans+as+a+tool+to+predict+chemical+activity+on+mammalian+development+and+identify+mechanisms+influencing+toxicological+outcome.">The nematode Caenorhabditis elegans as a tool to predict chemical activity on mammalian development and identify mechanisms influencing toxicological outcome.</a> Scientific Reports. 6 (1), 22965 (2016).</li></ol>

Protokollene som er beskrevet i dette manuskriptet, fungerer vellykket alene eller som en del av et flerukes uavhengig studentgruppeprosjekt. Protokollene er også egnet til frittstående, en ukes utforskende opplevelser. Nematodestammene er billige og enkle å vedlikeholde i forskningslaboratoriet. Elevene kan lett lære å plukke ormer med et ormplukk eller hvordan de kan bevege seg ved å skylle plater med vann og la dem slå seg ned med tyngdekraften. Eksperimentene kan utføres i løpet av en enkelt laboratorieperio...

Caenorhabditis elegans er en utmerket modellorganisme for laboratoriekursopplæring i biovitenskapelige kurs for introduksjons- og mellomnivåstudenter. Denne laboratorieprosedyren kan brukes som en del av en flerukemodul som utforsker ulike effekter av ofte brukte plantevernmidler på C. elegans oppførsel og cellebiologi. Studentene kan lære å designe og gjennomføre selvstendige prosjekter som lærer dem dataanalyse og presentasjonsevner. Dette dokumentet fokuserer på protokollene for å utsette C. elegans for plantevernmidler blandinger og deretter observere og analysere effekten på nevron morfologi.
Plen kjemiske plantevernmidler blandinger er mye brukt til bolig- og landbruksbruk og kan kjøpes hos enhver lokal hagebutikk. Det er økende bekymring for sikkerheten til disse kjemikaliene for mennesker og dyreliv 1,2,3. Studentene kan lese den vitenskapelige litteraturen og velge et plantevernmiddel for eksperimentell evaluering og på den måten lære om grunnleggende biologi og nevrobiologi, samt viktige laboratorieferdigheter som eksperimentell design og analyse, og generelle laboratorieferdigheter som pipettering og seriell fortynning, dissekering av mikroskopi, fluorescerende mikroskopi, digital fotografering og figurproduksjon.
Protokollene beskrevet i dette dokumentet kan stå alene i et mellomnivåkurs i biologi eller nevrovitenskap eller være en del av en flerukemodul som også kan omfatte målinger av atferd styrt av bestemte grupper nevroner. For eksempel er beskrevet i denne protokollen en vurdering av morfologien til kolinerge nevroner som styrer bevegelse ved hjelp av en stamme nematode som uttrykker GFP (LX 929) i kolinerge nevroner4. Disse stammene kan oppnås for svært lave priser fra Caenorhabditis elegans Genetics Center (https://cgc.umn.edu/). Stammer som uttrykker GFP i dopaminerge nevroner (OH 7457), kolinerge nevroner (LX 929) eller mCherry uttrykt i alle nevroner (PVX4) er alle gode valg. Studentene kunne også måle bevegelse og innhente data for å følge vurderingen av morfologi. En fullstendig beskrivelse av et flerukes studentgruppeprosjekt finner du i Susman5.
Dette studentgruppeprosjektet er ganske billig og enkelt å sette opp for grupper på fire studenter. Materialene som trengs inkluderer et dissekerende mikroskop, tilgang til et fluorescens sammensatt mikroskop som kan ha et vedlagt digitalt kamera, Petri-plater og tilgang til nematode vekstagar, vekstbegrensede bakterier (stamme OP50, fra CGC), en gassflamme Bunsen brenner eller en alkohollampe, en autoklav, platinatråd og generelle laboratorieforsyninger som mikropipettere, mikroskoplys, lysbilder, deksler og pasteurpipetter i glass. Avhengig av det kjemiske toksiske middelet som undersøkes av studentgruppene, kan det hende at trinnene i protokollen må skje under en avtrekkshette eller med hansker. Denne protokollen bruker kjemiske blandinger som er vannløselige (ikke flyktige), og alle prosedyrer for sikker håndtering anbefalt av produsenten følges.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP97445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1AGAH0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol lamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;17012826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-012-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strains</td>
			<td>C. elegans Genetics Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1147030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain (OP50)</td>
			<td>C. elegans Genetics Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;131045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9723-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;05408129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-265446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>94060316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-386-319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-1M30P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ61413AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC447810250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining the effect of pesticides on caenorhabditis elegans neurons

Caenorhabditis elegans er en kraftig modellorganisme som brukes i mange forskningslaboratorier for å forstå konsekvensene av eksponering for kjemiske miljøgifter, plantevernmidler og et bredt utvalg av giftige stoffer. Disse nematodene er enkle å jobbe med og kan brukes til å generere nye forskningsfunn, selv i bachelorbiologilaboratoriet. En fler ukers laboratorieserie med autentiske, studentdrevne forskningsprosjekter trener studentene i et verktøysett med teknikker og tilnærminger i atferdsmålinger, cellebiologi og mikroskopi som de deretter bruker på prosjektene sine. En teknikk i verktøysettet kvantifiserer prosentandelen nevroner som utviser nevrodegenerativ skade etter eksponering for et kjemisk toksisk middel som et plantevernmiddel. Unge voksne C. elegans nematoder kan bli utsatt for forskjellige konsentrasjoner av kommersielt tilgjengelige plantevernmidler eller andre typer toksiske stoffer i 2-24 timer. Deretter kan studenter på lavere nivå visualisere forskjellige nevronundertyper ved hjelp av fluorescerende uttrykkende stammer av C. elegans. Disse teknikkene krever ikke sofistikert bildebehandlingsprogramvare og er effektive ved selv lave forstørrelser, noe som gjør behovet for dyr konfektmikroskopi unødvendig. Dette papiret demonstrerer hvordan man behandler nematodene med plantevernmidler og hvordan man skal avbilde og score nevronene. Det gir også en enkel protokoll for mikroskopi og analyse av nevronmorfologi. Materialene som brukes til denne teknikken er billige og lett tilgjengelige i de fleste lavere biologiavdelinger. Denne teknikken kan kombineres med atferdsmessige tiltak som bevegelse, basal slowing eller egglegging for å gjennomføre en potensielt publiserbar serie eksperimenter og gi studenter en autentisk forskningsopplevelse til en svært lav pris.

Metodene og protokollene som er beskrevet i denne artikkelen gir viktige laboratorieferdigheter for studenter på mellomnivå i biologi eller nevrovitenskap. Studentene kan få viktig erfaring med å utvikle et selvstendig prosjekt og gjennomføre et eksperiment av sitt eget design som kan gi nye resultater. Figur 3 viser et optimalt resultat av et studentprosjekt som til slutt ble en del av en publisert artikkel3. Selv om de fleste studentprosjekter ikke resulterer i...

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Unge voksne Caenorhabditis elegans nematoder er utsatt for forskjellige konsentrasjoner av kommersielle plantevernmidler eller andre toksiske stoffer i 2-24 timer. Deretter kan forskjellige nevroner visualiseres ved hjelp av fluorescerende uttrykkende stammer. Dette papiret demonstrerer hvordan man eksponerer nematoder for plantevernmidler og vurderer nevronskader.

Undersøke effekten av plantevernmidler på Caenorhabditis elegans Neurons

Caenorhabditis elegans is a powerful model organism used in many research laboratories to understand the consequences of exposure to chemical pollutants, ...

Denne protokollen er en enkel og gjennomførbar måte for studenter å utføre autentisk forskning som kan føre til publiseringsresultater. Hovedfordelen er at studentene kan utføre original forskning på spørsmål som de bestemmer på egen hånd. Til å begynne med, lag en løsningsspreder ved å forsiktig bøye en ni milliliter glass Pasteur pipette i en Bunsen brennerflamme og lukk åpningen av pipetten.Deretter steriliserer etanol sprederen før hver spredning på Petri-platen. Bruk en mikropipetter, plasser 100 mikroliter av fortynning i midten av agaren og spred forsiktig over overflaten med den steriliserte sprederen. Sett deretter til side Petri-rettene som er dekket og la løsningen suge inn i overflaten til den er tørr.For eksponeringsperioder lenger enn 12 timer, tilsett 50 mikroliter av en nattkultur av Escherichia coli til platene før du legger til nematodene, mens for akutte eksperimenter på 12 timer eller mindre er det ikke nødvendig å ha E.coli på platene. Bruk en mikropipette, plasser en milliliter sterilt vann på platen av nematoder. Deretter svinger vannet rundt for å løfte opp nematodene, og fjern deretter væsken med nematodene til et 1,5 milliliter mikrofugerør.Etter 10 minutter, da nematodene avgjort av tyngdekraften, fjern forsiktig minst 500 mikroliter av vannet og kast. Deretter resuspenderer nematodene, og ved hjelp av en avskåret gul pipettespiss, fjern 50 til 100 mikroliter suspenderte ormer til hver behandlingsplate, og sørg for at hver tallerken har minst 10 voksne ormer. Forbered to lysbilder ved å plassere et stykke etikettbånd på bare den ene siden av lysbildet for å danne en pute med jevn tykkelse, og plasser deretter et rent ubrukt lysbilde mellom dem på benken.Plasser en 10 mikroliterdråpe smeltet agarose på midten av lysbildet ved hjelp av en mikropipetter. Deretter flater du ut dråpen ved å plassere et annet rent lysbilde på toppen vinkelrett på lysbildet med dråpen og legge trykk slik at agarosefallet danner tykkelsen på etikettbåndet. Deretter legger du jevnt trykk for å skille de to lysbildene.Hvil deretter denne sklien med agarsiden opp på benken og la den tørke i ett til to minutter før bruk. For å legge til nematoder av den forberedte lysbildet med agaroseputen, legg til en fem mikroliterdråpe vann som inneholder en molar natriumazid til agarputen, som vil bedøve ormene og mobilisere dem. Deretter overføres ved 10 nematoder per behandling glir til dråpen ved hjelp av et ormplukk, som skal steriliseres før og etter overføring av nematodene.Deretter legger du til en dekselslipp ved hjelp av tang ved å plassere den i en vinkel og sakte senke den. Deretter plasserer du den tilberedte våte braketten på et fluorescerende mikroskop for å observere ormene først under 10X forstørrelse og fasekontrast, deretter under 40X forstørrelse med fasekontrast og fluorescerende belysning. Plasser en forberedt våtmontering om gangen på mikroskopstadiet og fest på plass ved hjelp av mikroskopets trinnklemmer, og begynn deretter å se de våte brakettene med det laveste forstørrelsesmålet, som vanligvis er 10X og bruk et lyst felt eller fasekontrast for å visualisere og fokusere på nematodene.Når en nematode er plassert i synsfeltet, fokuser på den ved hjelp av den fine fokusknappen på mikroskopet, og bytt deretter belysningen til fluorescens ved å dreie hjulet og lede lyset til kameraet for å fange de digitale bildene. Deretter justerer du belysningen ved hjelp av bildeprogramvaren slik at nevronene er sterkt opplyst, men ikke overmettet. På et eller annet tidspunkt får du et eget bilde av en linjal med samme forstørrelse som cellebildene for å gi figuren en forstørrelsesskala.Effekten av mangan som inneholder plantevernmidler på dopamin neuron morfologi ved hjelp av en stamme der dopamin nevroner uttrykt GFP ble studert viser et sterkt signal. Det fluorescerende signalet bleker imidlertid hvis nevronene blir utsatt for lys i lange perioder. Denne prosedyren kan være en del av et studentdrevet prosjekt med flere uker som også kan omfatte atferd eller andre data.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Brain Imaging Gransking av svekke Effekt av Emotion på Cognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Cut-lasting: et nyttig verktøy for å undersøke graden av Gap Junction Tracer kobling mellom Retinal Neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

I Vivo to-foton avbildning av erfaring-avhengige molekylære endringer i kortikale Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

En<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modell System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Metoder for å studere virkningsmekanismer av antipsykotiske legemidler i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

En undersøkelse for å måle effekten av etanol på Locomotion Speed ​​av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agaroseplater Microchambers for Long-term Kalsium Imaging av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Nye beregninger for å karakter Embryonic Forlengelse av nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...