Name: examining the effect of pesticides on caenorhabditis elegans neurons
Uploaded: 2022-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

O trabalho descrito neste manuscrito foi feito para uma classe de nível intermediário em neurociência. Os recursos para os reagentes e suprimentos foram fornecidos pelo Departamento de Biologia da Faculdade Vassar. Os microscópios e o sistema de imagem digital também foram fornecidos pelo Departamento de Biologia da Faculdade Vassar. O autor agradece a todos os muitos alunos que fizeram este curso.

Todo o uso de animais invertebrados foi em conformidade com as orientações de cuidado animal e uso da instituição.
1. Preparação de placas de Petri revestidas de pesticidas
<ol><li>Prepare as placas de ágar Petri (6 cm de diâmetro funcionam melhor) utilizando procedimentos padrão6. NOTA: Estes podem ser feitos com meses de antecedência e armazenados na geladeira até o uso. Leve as placas à temperatura ambiente (RT) no banco. Na maioria ...

<ol>
	<li>Duzguner, V., Erdogan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+exposure+to+imidacloprid+induces+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+liver+&amp;+central+nervous+system+of+rats.">Chronic exposure to imidacloprid induces inflammation and oxidative stress in the liver &amp; central nervous system of rats.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 104 (1), 58-64 (2012).</li><li>Catae, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+a+sublethal+concentration+of+imidacloprid+and+the+side+effects+on+target+and+nontarget+organs+of+Apis+mellifera+(Hymenoptera,+Apidae).">Exposure to a sublethal concentration of imidacloprid and the side effects on target and nontarget organs of Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae).</a> Ecotoxicology. 27 (2), 109-121 (2018).</li><li>Bradford, B. R., Whidden, E., Gervasio, E. D., Checchi, P. M., Raley-Susman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonicotinoid-containing+insecticide+disruption+of+growth,+locomotion,+and+fertility+in+Caenorhabditis+elegans.">Neonicotinoid-containing insecticide disruption of growth, locomotion, and fertility in Caenorhabditis elegans.</a> PLOS One. 15 (9), 0238637 (2020).</li><li>Jospin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+acetylcholine+receptor+regulates+the+balance+of+muscle+excitation+and+inhibition+in+Caenorhabditis+elegans.">A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 7 (12), 1000265 (2009).</li><li>Susman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Discovery-Based Learning in the Life Sciences. , (2015).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Brody, H. A., Chou, E., Gray, J. M., Pokyrwka, N. J., Raley-Susman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mancozeb-induced+behavioral+deficits+precede+structural+neural+degeneration.">Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration.</a> NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).</li><li>Chen, P., Martinez-Finley, E. J., Bornhorst, J., Chakraborty, S., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal-induced+neurodegeneration+in+C.+elegans.">Metal-induced neurodegeneration in C. elegans.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 5, (2013).</li><li>Hart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior.">Behavior.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Harlow, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nematode+Caenorhabditis+elegans+as+a+tool+to+predict+chemical+activity+on+mammalian+development+and+identify+mechanisms+influencing+toxicological+outcome.">The nematode Caenorhabditis elegans as a tool to predict chemical activity on mammalian development and identify mechanisms influencing toxicological outcome.</a> Scientific Reports. 6 (1), 22965 (2016).</li></ol>

Os protocolos descritos neste manuscrito funcionam sozinhos ou como parte de um projeto de grupo estudantil independente de várias semanas. Os protocolos também são favoráveis a experiências exploratórias autônomas de uma semana. As cepas de nematoide são baratas e fáceis de manter no laboratório de pesquisa. Os alunos podem prontamente aprender a escolher vermes com uma picareta de vermes ou como movê-los lavando placas com água e permitindo que eles se instalem pela gravidade. Os experimentos podem ser real...

Caenorhabditis elegans é um excelente organismo modelo para formação de cursos laboratoriais em cursos de ciências biológicas para alunos de nível introdutório e intermediário. Este procedimento laboratorial pode ser usado como parte de um módulo de várias semanas que explora vários efeitos de pesticidas comumente usados no comportamento de C. elegans e biologia celular. Os alunos podem aprender a projetar e realizar projetos independentes que lhes ensinam habilidades de análise de dados e apresentação. Este artigo se concentra nos protocolos para expor C. elegans a misturas de pesticidas e, em seguida, observar e analisar os efeitos sobre a morfologia do neurônio.
Misturas de pesticidas químicos de gramado são amplamente utilizadas para uso residencial e agrícola e podem ser compradas em qualquer loja de jardim local. Há uma preocupação crescente com a segurança desses produtos químicos para humanos e vida selvagem 1,2,3. Os alunos podem ler a literatura científica e selecionar um pesticida para avaliação experimental e, ao fazê-lo, podem aprender sobre biologia básica e neurobiologia, bem como importantes habilidades laboratoriais, como design e análise experimental, e habilidades gerais de laboratório como pipetação e diluições seriais, microscopia dissecando, microscopia fluorescente, fotografia digital e produção de figuras.
Os protocolos descritos neste artigo podem ficar sozinhos em um curso de nível intermediário em biologia ou neurociência ou fazer parte de um módulo de várias semanas que também poderia incluir medições de comportamentos regidos por determinados grupos de neurônios. Por exemplo, descrito neste protocolo é uma avaliação da morfologia dos neurônios colinérgicos que governam a locomoção usando uma cepa de nematoide que expressa GFP (LX 929) em neurônios colinérgicos4. Essas cepas podem ser obtidas por preços muito baixos do Centro de Genética De Caenorhabditis Elegans (https://cgc.umn.edu/). Cepas expressas GFP em neurônios dopaminérgicos (OH 7457), neurônios colinérgicos (LX 929) ou mCherry expressos em todos os neurônios (PVX4) são todas boas escolhas. Os alunos também poderiam medir a locomoção e obter dados para acompanhar a avaliação da morfologia. Uma descrição completa de um projeto de grupo estudantil de várias semanas pode ser encontrada em Susman5.
Este projeto de grupo estudantil é bastante barato e fácil de configurar para grupos de quatro alunos. Os materiais necessários incluem um microscópio dissecando, acesso a um microscópio composto de fluorescência que pode ter uma câmera digital anexada, placas de Petri e acesso a ágar de crescimento de nematoide, bactérias limitadas ao crescimento (cepa OP50, do CGC), um queimador bunsen de chama de gás ou uma lâmpada de álcool, uma autoclave, fio de platina e suprimentos de laboratório gerais como micropipetters, slides de microscópio, tampas, e pipetas pasteur de vidro. Dependendo do toxicante químico que está sendo examinado pelos grupos estudantis, as etapas do protocolo podem precisar ocorrer sob um capuz de fumaça ou com luvas. Este protocolo utiliza misturas químicas solúveis em água (não voláteis), e todos os procedimentos de manuseio seguro recomendados pelo fabricante são seguidos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP97445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1AGAH0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol lamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;17012826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-012-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strains</td>
			<td>C. elegans Genetics Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1147030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain (OP50)</td>
			<td>C. elegans Genetics Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;131045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9723-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;05408129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-265446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>94060316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-386-319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-1M30P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ61413AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC447810250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining the effect of pesticides on caenorhabditis elegans neurons

Caenorhabditis elegans é um poderoso organismo modelo usado em muitos laboratórios de pesquisa para entender as consequências da exposição a poluentes químicos, pesticidas e uma grande variedade de substâncias tóxicas. Esses nematoides são fáceis de trabalhar e podem ser usados para gerar novos achados de pesquisa, mesmo no laboratório de biologia da graduação. Uma série de laboratórios de vários dias de projetos de pesquisa autênticos e orientados por estudantes treina os alunos em um kit de ferramentas de técnicas e abordagens em medidas comportamentais, biologia celular e microscopia que eles então aplicam em seus projetos. Uma técnica nesse kit de ferramentas é quantificar a porcentagem de neurônios que exibem danos neurodegenerativos após a exposição a um toxicante químico como um pesticida. Nematoides jovens adultos C. elegans podem ser expostos a diferentes concentrações de pesticidas disponíveis comercialmente ou outros tipos de tóxicos por 2-24 h. Em seguida, os estudantes de graduação podem visualizar diferentes subtipos de neurônios usando cepas fluorescentes de C. elegans. Essas técnicas não exigem software sofisticado de processamento de imagem e são eficazes até mesmo em baixas ampliações, tornando desnecessária a necessidade de microscopia confocal cara. Este artigo demonstra como tratar os nematoides com pesticidas e como imaginar e pontuar os neurônios. Também fornece um protocolo simples para a microscopia e análise da morfologia do neurônio. Os materiais utilizados para esta técnica são baratos e prontamente disponíveis na maioria dos departamentos de biologia de graduação. Essa técnica pode ser combinada com medidas comportamentais como locomoção, desaceleração basal ou colocação de ovos para realizar uma série potencialmente publicável de experimentos e dar aos estudantes de graduação uma experiência de pesquisa autêntica a um custo muito baixo.

Os métodos e protocolos descritos neste artigo fornecem importantes habilidades laboratoriais para estudantes de graduação de nível intermediário em biologia ou neurociência. Os alunos podem adquirir experiências importantes no desenvolvimento de um projeto independente e na condução de um experimento de seu próprio design que poderia fornecer novos resultados. A Figura 3 mostra um resultado ideal de um projeto estudantil que eventualmente se tornou parte de um artigo publicado<sup...

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Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Os nematoides de caenorhabditis para jovens adultos são expostos a diferentes concentrações de pesticidas comerciais ou outros tóxicos por 2-24 h. Em seguida, diferentes neurônios podem ser visualizados usando cepas fluorescentes. Este artigo demonstra como expor nematoides a pesticidas e avaliar danos aos neurônios.

Examinando o efeito dos pesticidas em Caenorhabditis elegans Neurônios

Caenorhabditis elegans is a powerful model organism used in many research laboratories to understand the consequences of exposure to chemical pollutants, ...

Este protocolo é uma maneira simples e viável para os estudantes de graduação realizarem pesquisas autênticas que possam levar a resultados publicáveis. A principal vantagem é que os alunos podem realizar pesquisas originais sobre questões que decidem por conta própria. Para começar, faça um espalhador de solução dobrando cuidadosamente uma pipeta Pasteur de vidro de nove mililitros em uma chama de queimador Bunsen e feche a abertura da pipeta.Em seguida, o etanol esteriliza o espalhador antes de cada um se espalhar na placa de Petri. Usando uma micropipetter, coloque 100 microlitres da diluição no centro do ágar e espalhe suavemente pela superfície com o espalhador esterilizado. Em seguida, reserve as placas de Petri cobertas e deixe a solução mergulhar na superfície até secar.Para períodos de exposição maiores que 12 horas, adicione 50 microliters de uma cultura noturna de Escherichia coli às placas antes de adicionar os nematoides, enquanto para experimentos agudos de 12 horas ou menos, não há necessidade de ter E.coli nas placas. Usando uma micropipette, coloque um mililitro de água estéril na placa de nematoides. Em seguida, swish a água ao redor para levantar os nematoides, em seguida, remover o líquido com os nematoides para um tubo de microfuge de 1,5 mililitro.Após 10 minutos, à medida que os nematoides se instalaram pela gravidade, remova cuidadosamente pelo menos 500 microliters da água e descarte. Em seguida, resuspenque os nematoides, e usando uma ponta de pipeta amarela de corte, remova 50 a 100 microliters de vermes suspensos em cada placa de tratamento, garantindo que cada placa tenha pelo menos 10 vermes adultos. Prepare dois slides colocando um pedaço de fita de etiqueta em apenas um lado do slide para formar uma almofada de espessura uniforme, em seguida, posicione um slide limpo nãoused entre eles no banco.Coloque uma gota de 10 microliteres de agarose derretida no centro do slide usando uma micropipetter. Em seguida, achate a gota colocando outro slide limpo no perpendicular superior ao slide com a gota e aplique pressão para que a gota de agarose forme a espessura da fita de rotulagem. Depois, aplique pressão constante para separar os dois slides.Em seguida, descanse este slide com o lado do ágar para cima no banco e deixe-o secar por um a dois minutos antes de usar. Para adicionar nematoides do slide preparado com a almofada de agarose, adicione uma gota de água de cinco microlitos contendo um azida de sódio molar à almofada de ágar, que irá anestesiar os vermes e mobilizá-los. Em seguida, transfira a 10 nematoides por deslizamento de tratamento para a gotícula usando uma picareta de verme, que deve ser esterilizada antes e depois da transferência dos nematoides.Em seguida, adicione um deslizamento de tampa usando fórceps colocando-o em um ângulo e lentamente baixando-o. Depois, coloque o suporte molhado preparado em um microscópio fluorescente para observar os vermes primeiro sob ampliação de 10X e contraste de fase, depois sob ampliação de 40X com contraste de fase e iluminação fluorescente. Coloque uma montagem molhada preparada de cada vez no palco do microscópio e se fixe no lugar usando os clipes do palco do microscópio, em seguida, comece a visualizar as montagens molhadas com o objetivo de ampliação mais baixo, que é tipicamente 10X e use um campo ou contraste de fase brilhante para visualizar e focar nos nematoides.Uma vez que um nematoide esteja localizado no campo de visão, concentre-se nele usando o botão de foco fino no microscópio, em seguida, mude a iluminação para fluorescência girando o mostrador e direcionando a luz para a câmera para capturar as imagens digitais. Em seguida, ajuste a iluminação usando o software de imagem para que os neurônios sejam brilhantemente iluminados, mas não supersaturados. Em algum momento, obtenha uma imagem separada de uma régua na mesma ampliação que as imagens celulares para fornecer uma escala de ampliação para sua figura.Os efeitos do manganês contendo pesticida na morfologia do neurônio dopamina usando uma cepa na qual os neurônios de dopamina expressavam GFP mostrando um sinal brilhante. No entanto, o sinal fluorescente clareia se os neurônios forem expostos à luz por longos períodos de tempo. Esse procedimento pode fazer parte de um projeto de várias semanas orientado por estudantes que também pode incluir dados comportamentais ou outros.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Investigação por imagem do cérebro o efeito prejudicial da emoção sobre a Cognição

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Neurociência

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Cut-loading: Uma ferramenta útil para examinar a extensão da Gap Coupling Tracer junção entre neurônios da retina

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

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Métodos para o estudo dos mecanismos de ação dos antipsicóticos Drogas em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

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Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Microchambers agarose para Imagem de cálcio a longo prazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

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Novas métricas para Caracterizar Embryonic Alongamento do nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...