Name: examining the effect of pesticides on caenorhabditis elegans neurons
Uploaded: 2022-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

Работа, описанная в этой рукописи, была выполнена для класса среднего уровня в области неврологии. Средства на реагенты и расходные материалы были предоставлены биологическим факультетом колледжа Вассар. Микроскопы и цифровая система визуализации также были предоставлены биологическим факультетом в колледже Вассар. Автор благодарит всех многих студентов, которые прошли этот курс.

Все виды использования беспозвоночных животных осуществлялись в соответствии с руководящими принципами учреждения по уходу за животными и их использованию.
1. Приготовление пластин Петри с пестицидным покрытием
<ol><li>Приготовьте чашку из агара Петри (диаметро...

<ol>
	<li>Duzguner, V., Erdogan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+exposure+to+imidacloprid+induces+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+liver+&amp;+central+nervous+system+of+rats.">Chronic exposure to imidacloprid induces inflammation and oxidative stress in the liver &amp; central nervous system of rats.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 104 (1), 58-64 (2012).</li><li>Catae, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+a+sublethal+concentration+of+imidacloprid+and+the+side+effects+on+target+and+nontarget+organs+of+Apis+mellifera+(Hymenoptera,+Apidae).">Exposure to a sublethal concentration of imidacloprid and the side effects on target and nontarget organs of Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae).</a> Ecotoxicology. 27 (2), 109-121 (2018).</li><li>Bradford, B. R., Whidden, E., Gervasio, E. D., Checchi, P. M., Raley-Susman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonicotinoid-containing+insecticide+disruption+of+growth,+locomotion,+and+fertility+in+Caenorhabditis+elegans.">Neonicotinoid-containing insecticide disruption of growth, locomotion, and fertility in Caenorhabditis elegans.</a> PLOS One. 15 (9), 0238637 (2020).</li><li>Jospin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+acetylcholine+receptor+regulates+the+balance+of+muscle+excitation+and+inhibition+in+Caenorhabditis+elegans.">A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 7 (12), 1000265 (2009).</li><li>Susman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Discovery-Based Learning in the Life Sciences. , (2015).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Brody, H. A., Chou, E., Gray, J. M., Pokyrwka, N. J., Raley-Susman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mancozeb-induced+behavioral+deficits+precede+structural+neural+degeneration.">Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration.</a> NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).</li><li>Chen, P., Martinez-Finley, E. J., Bornhorst, J., Chakraborty, S., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal-induced+neurodegeneration+in+C.+elegans.">Metal-induced neurodegeneration in C. elegans.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 5, (2013).</li><li>Hart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior.">Behavior.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Harlow, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nematode+Caenorhabditis+elegans+as+a+tool+to+predict+chemical+activity+on+mammalian+development+and+identify+mechanisms+influencing+toxicological+outcome.">The nematode Caenorhabditis elegans as a tool to predict chemical activity on mammalian development and identify mechanisms influencing toxicological outcome.</a> Scientific Reports. 6 (1), 22965 (2016).</li></ol>

Протоколы, описанные в этой рукописи, успешно работают в одиночку или в рамках многонедельного независимого проекта студенческой группы. Протоколы также поддаются автономному, недельному исследовательскому опыту. Штаммы нематод дешевы и просты в обслуживании в исследовательской лаб...

Caenorhabditis elegans является отличным модельным организмом для лабораторного курса обучения на курсах биологических наук для студентов вводного и среднего уровня. Эта лабораторная процедура может быть использована как часть многонедельного модуля, который исследует различные эффекты обычно используемых пестицидов на поведение C. elegans и клеточную биологию. Студенты могут научиться разрабатывать и выполнять независимые проекты, которые учат их навыкам анализа данных и презентации. В этой статье основное внимание уделяется протоколам воздействия C. elegans на пестицидные смеси, а затем наблюдению и анализу влияния на морфологию нейронов.
Газонные химические пестицидные смеси широко используются для бытового и сельскохозяйственного использования и могут быть приобретены в любом местном садовом магазине. Растет обеспокоенность по поводу безопасности этих химических веществ для человека и дикой природы 1,2,3. Студенты могут читать научную литературу и выбирать пестицид для экспериментальной оценки и, таким образом, могут узнать о базовой биологии и нейробиологии, а также о важных лабораторных навыках, таких как экспериментальное проектирование и анализ, и общих лабораторных навыках, таких как пипетка и серийные разведения, рассекающая микроскопия, флуоресцентная микроскопия, цифровая фотография и производство фигур.
Протоколы, описанные в этой статье, могут стоять отдельно в курсе среднего уровня по биологии или неврологии или быть частью многонедельного модуля, который также может включать измерения поведения, управляемого определенными группами нейронов. Например, в этом протоколе описана оценка морфологии холинергических нейронов, управляющих локомоцией, с помощью штамма нематоды, экспрессирующего GFP (LX 929) в холинергических нейронах4. Эти штаммы можно получить по очень низким ценам в Центре генетики Caenorhabditis elegans (https://cgc.umn.edu/). Штаммы, экспрессирующие GFP в дофаминергических нейронах (OH 7457), холинергических нейронах (LX 929) или mCherry, экспрессируемые во всех нейронах (PVX4), являются хорошим выбором. Студенты также могут измерять локомоцию и получать данные для сопровождения оценки морфологии. Полное описание многонедельного проекта студенческой группы можно найти в Susman5.
Этот студенческий групповой проект довольно недорогой и простой в настройке для групп из четырех студентов. Необходимые материалы включают рассекающий микроскоп, доступ к флуоресцентному составному микроскопу, который может иметь прикрепленную цифровую камеру, пластины Петри и доступ к агару роста нематод, бактериям с ограничением роста (штамм OP50, из CGC), горелке Бунзена газового пламени или спиртовой лампе, автоклаву, платиновой проволоке и общим лабораторным материалам, таким как микропипеттеры, слайды микроскопа, чехлы и стеклянные пипетки Пастера. В зависимости от химического токсиканта, исследуемого студенческими группами, шаги в протоколе могут быть выполнены под вытяжным капюшоном или в перчатках. В этом протоколе используются химические смеси, которые являются водорастворимыми (не летучими), и соблюдаются все процедуры безопасного обращения, рекомендованные производителем.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP97445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1AGAH0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol lamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;17012826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-012-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strains</td>
			<td>C. elegans Genetics Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1147030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain (OP50)</td>
			<td>C. elegans Genetics Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;131045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9723-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;05408129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-265446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>94060316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-386-319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-1M30P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ61413AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC447810250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining the effect of pesticides on caenorhabditis elegans neurons

Caenorhabditis elegans является мощным модельным организмом, используемым во многих исследовательских лабораториях для понимания последствий воздействия химических загрязнителей, пестицидов и широкого спектра токсичных веществ. С этими нематодами легко работать, и их можно использовать для получения новых результатов исследований, даже в лаборатории биологии бакалавриата. Многонедельная лабораторная серия аутентичных, управляемых студентами исследовательских проектов обучает студентов инструментарию методов и подходов в поведенческих измерениях, клеточной биологии и микроскопии, которые они затем применяют в своих проектах. Одним из методов в этом инструментарии является количественная оценка процента нейронов, проявляющих нейродегенеративное повреждение после воздействия химического токсиканта, такого как пестицид. Молодые взрослые нематоды C. elegans могут подвергаться воздействию различных концентраций коммерчески доступных пестицидов или других типов токсикантов в течение 2-24 ч. Затем студенты бакалавриата могут визуализировать различные подтипы нейронов, используя флуоресцентно-экспрессирующие штаммы C. elegans. Эти методы не требуют сложного программного обеспечения для обработки изображений и эффективны даже при низком увеличении, что делает необходимость в дорогостоящей конфокальной микроскопии ненужной. В этой статье показано, как лечить нематод пестицидами и как изображать и оценивать нейроны. Он также предоставляет простой протокол для микроскопии и анализа морфологии нейронов. Материалы, используемые для этой техники, недороги и легко доступны на большинстве факультетов биологии бакалавриата. Этот метод может быть объединен с поведенческими показателями, такими как локомоция, базальное замедление или яйцекладка, чтобы провести потенциально публикуемую серию экспериментов и дать студентам бакалавриата подлинный исследовательский опыт по очень низкой цене.

Методы и протоколы, описанные в этой статье, обеспечивают важные лабораторные навыки для студентов среднего уровня бакалавриата в области биологии или неврологии. Студенты могут получить важный опыт в разработке независимого проекта и проведении эксперимента собственного дизайна, к?...

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Молодые взрослые нематоды Caenorhabditis elegans подвергаются воздействию различных концентраций коммерческих пестицидов или других токсикантов в течение 2-24 ч. Затем различные нейроны могут быть визуализированы с использованием флуоресцентно-экспрессирующих штаммов. В этой статье показано, как подвергать нематод воздействию пестицидов и оценивать повреждение нейронов.

Изучение влияния пестицидов на нейроны Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a powerful model organism used in many research laboratories to understand the consequences of exposure to chemical pollutants, ...

Этот протокол является простым и осуществимым способом для студентов бакалавриата проводить аутентичные исследования, которые могут привести к публикуемым результатам. Основным преимуществом является то, что студенты могут проводить оригинальные исследования по вопросам, которые они решают самостоятельно. Для начала сделайте разбрасыватель раствора, аккуратно согнув девятимиллилитровую стеклянную пипетку Пастера в пламя горелки Бунзена и закройте отверстие пипетки.Затем этанол стерилизуют разбрасыватель перед каждым разбрасыванием на пластине Петри. Используя микропипеттер, поместите 100 микролитров разведения на центр агара и аккуратно распределите по поверхности стерилизованным разбрасывателем. Затем отложите в сторону чашки Петри и дайте раствору впитаться в поверхность до высыхания.Для периодов воздействия более 12 часов добавьте 50 микролитров ночной культуры кишечной палочки к пластинам перед добавлением нематод, тогда как для острых экспериментов продолжительностью 12 часов или менее нет необходимости иметь E.coli на пластинах. Используя микропипетку, поместите один миллилитр стерильной воды на пластину нематод. Затем разбрызгивайте воду, чтобы поднять нематод, затем удалите жидкость с нематодами в 1,5-миллилитровую микрофьюжную трубку.Через 10 минут, когда нематоды осядут под действием силы тяжести, аккуратно удалите не менее 500 микролитров воды и выбросьте. Затем повторно суспендируют нематоды и, используя отрезанный желтый наконечник пипетки, удаляют от 50 до 100 микролитров взвешенных червей на каждую пластину обработки, гарантируя, что в каждой пластине будет не менее 10 взрослых червей. Подготовьте два слайда, поместив кусок этикеточной ленты только на одну сторону слайда, чтобы сформировать прокладку равномерной толщины, а затем поместите чистый неиспользуемый слайд между ними на столешнице.Поместите 10-микролитровую каплю расплавленной агарозы в центр слайда с помощью микропипеттера. Затем сгладите каплю, поместив еще один чистый слайд сверху перпендикулярно слайду с каплей, и приложите давление, чтобы капля агарозы сформировала толщину этикетировочной ленты. После этого приложите постоянное давление, чтобы разделить два слайда.Затем положите этот слайд агаровой стороной вверх на столешницу и дайте ему высохнуть в течение одной-двух минут перед использованием. Чтобы добавить нематоды подготовленного слайда с агарозной прокладкой, добавьте в агаровую прокладку пятимикролитровую каплю воды, содержащую один молярный азид натрия, которая обезболит червей и мобилизует их. Затем переложить по 10 нематод на один лечебный слайд в капельку с помощью червячной кирки, которую следует стерилизовать до и после переноса нематод.Затем добавьте крышку с помощью щипцов, поместив ее под углом и медленно опуская. После этого поместите подготовленное мокрое крепление на флуоресцентный микроскоп, чтобы наблюдать червей сначала при 10-кратном увеличении и фазовом контрасте, а затем при 40-кратном увеличении с фазовым контрастом и флуоресцентным освещением. Поместите одно подготовленное мокрое крепление за раз на ступень микроскопа и закрепите на месте с помощью зажимов сцены микроскопа, затем начните просмотр мокрых креплений с наименьшим объективом увеличения, которое обычно составляет 10X, и используйте яркое поле или фазовый контраст для визуализации и фокусировки на нематодах.Как только нематода находится в поле зрения, сосредоточьтесь на ней с помощью тонкой ручки фокусировки на микроскопе, затем переключите освещение на флуоресценцию, повернув циферблат и направьте свет на камеру для захвата цифровых изображений. Затем отрегулируйте освещение с помощью программного обеспечения для визуализации так, чтобы нейроны были ярко освещены, но не перенасыщены. В какой-то момент получите отдельное изображение линейки с тем же увеличением, что и изображения ячеек, чтобы обеспечить шкалу увеличения для их фигуры.Было изучено влияние марганца, содержащего пестицид, на морфологию дофаминовых нейронов с использованием штамма, в котором дофаминовые нейроны экспрессировали GFP, показывая яркий сигнал. Тем не менее, флуоресцентный сигнал отбеливает, если нейроны подвергаются воздействию света в течение длительных периодов времени. Эта процедура может быть частью многонедельного студенческого проекта, который также может включать поведенческие или другие данные.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Сканирование мозга Исследование умаление Влияние эмоций на когнитивные

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation нейронов из кусочков мозга грызунов по изучению синаптической передачи изображения и пресинаптические терминалы

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Cut-загрузки: полезный инструмент для изучения Протяженность Gap Муфта Tracer стыке нейронов сетчатки

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

В Vivo Двухфотонные изображений зависящие от опыта молекулярные изменения в корковых нейронов

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Модельной системы для исследования Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Одновременное электрофизиологические записи и Кальций изображений супрахиазматического ядра нейронов

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Методы изучения механизмов действия антипсихотических препаратов в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Анализ по измерению влияния этанола на локомоции Скорость<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Агарозные микрокамеры для долгосрочного Кальций изображений<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Новые Метрики к характеризации эмбриональных Удлинение нематоды<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...