Name: examining the effect of pesticides on caenorhabditis elegans neurons
Uploaded: 2022-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

Arbetet som beskrivs i detta manuskript gjordes för en mellannivåklass i neurovetenskap. Medel för reagenser och förnödenheter tillhandahölls av biologiska avdelningen vid Vassar College. Mikroskopen och det digitala bildsystemet tillhandahölls också av biologiska avdelningen vid Vassar College. Författaren tackar alla de många studenter som tog denna kurs.

All användning av ryggradslösa djur var i enlighet med institutionens riktlinjer för djurvård och användning.
1. Beredning av bekämpningsmedelsbelagda petriplattor
<ol><li>Förbered agar Petri-rätter (6 cm diameter fungerar bäst) med standardprocedurer6. OBS: Dessa kan göras månader i förväg och förvaras i kylskåp tills de används. Ta tallrikarna till rumstemperatur (RT) på bänkskivan. I de flesta fall bör studentgrupperna förses...

<ol>
	<li>Duzguner, V., Erdogan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+exposure+to+imidacloprid+induces+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+liver+&amp;+central+nervous+system+of+rats.">Chronic exposure to imidacloprid induces inflammation and oxidative stress in the liver &amp; central nervous system of rats.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 104 (1), 58-64 (2012).</li><li>Catae, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+a+sublethal+concentration+of+imidacloprid+and+the+side+effects+on+target+and+nontarget+organs+of+Apis+mellifera+(Hymenoptera,+Apidae).">Exposure to a sublethal concentration of imidacloprid and the side effects on target and nontarget organs of Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae).</a> Ecotoxicology. 27 (2), 109-121 (2018).</li><li>Bradford, B. R., Whidden, E., Gervasio, E. D., Checchi, P. M., Raley-Susman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonicotinoid-containing+insecticide+disruption+of+growth,+locomotion,+and+fertility+in+Caenorhabditis+elegans.">Neonicotinoid-containing insecticide disruption of growth, locomotion, and fertility in Caenorhabditis elegans.</a> PLOS One. 15 (9), 0238637 (2020).</li><li>Jospin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+acetylcholine+receptor+regulates+the+balance+of+muscle+excitation+and+inhibition+in+Caenorhabditis+elegans.">A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 7 (12), 1000265 (2009).</li><li>Susman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Discovery-Based Learning in the Life Sciences. , (2015).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Brody, H. A., Chou, E., Gray, J. M., Pokyrwka, N. J., Raley-Susman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mancozeb-induced+behavioral+deficits+precede+structural+neural+degeneration.">Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration.</a> NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).</li><li>Chen, P., Martinez-Finley, E. J., Bornhorst, J., Chakraborty, S., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal-induced+neurodegeneration+in+C.+elegans.">Metal-induced neurodegeneration in C. elegans.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 5, (2013).</li><li>Hart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior.">Behavior.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Harlow, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nematode+Caenorhabditis+elegans+as+a+tool+to+predict+chemical+activity+on+mammalian+development+and+identify+mechanisms+influencing+toxicological+outcome.">The nematode Caenorhabditis elegans as a tool to predict chemical activity on mammalian development and identify mechanisms influencing toxicological outcome.</a> Scientific Reports. 6 (1), 22965 (2016).</li></ol>

Protokollen som beskrivs i detta manuskript fungerar framgångsrikt ensamma eller som en del av ett flera veckors självständigt studentgruppsprojekt. Protokollen är också mottagliga för fristående, en veckas utforskande upplevelser. Nematodstammarna är billiga och lätta att underhålla i forskningslaboratoriet. Eleverna kan lätt lära sig att plocka maskar med en maskplockning eller hur man flyttar dem genom att spola plattor med vatten och låta dem bosätta sig genom tyngdkraften. Experimenten kan utföras und...

Caenorhabditis elegans är en utmärkt modellorganism för laboratoriekursutbildning i biologiska vetenskapskurser för introduktions- och mellannivåstudenter. Denna laboratorieprocedur kan användas som en del av en flerveckorsmodul som utforskar olika effekter av vanliga bekämpningsmedel på C. elegans beteende och cellbiologi. Studenterna kan lära sig att designa och genomföra självständiga projekt som lär dem dataanalys och presentationsförmåga. Denna uppsats fokuserar på protokollen för att utsätta C. elegans för bekämpningsmedelsblandningar och sedan observera och analysera effekterna på neuronmorfologi.
Gräsmattor kemiska bekämpningsmedelsblandningar används ofta för bostads- och jordbruksbruk och kan köpas i alla lokala trädgårdsbutiker. Det finns en ökande oro för säkerheten för dessa kemikalier för människor och vilda djur 1,2,3. Studenter kan läsa den vetenskapliga litteraturen och välja ett bekämpningsmedel för experimentell utvärdering och därigenom lära sig om grundläggande biologi och neurobiologi, liksom viktiga laboratoriefärdigheter som experimentell design och analys, och allmänna laboratoriefärdigheter som pipettering och seriella utspädningar, dissekeringsmikroskopi, fluorescerande mikroskopi, digital fotografering och figurproduktion.
Protokollen som beskrivs i detta papper kan stå ensamma i en kurs på mellannivå i biologi eller neurovetenskap eller vara en del av en flerveckorsmodul som också kan innehålla mätningar av beteenden som styrs av särskilda grupper av neuroner. Till exempel beskrivs i detta protokoll en bedömning av morfologin hos kolinerga neuroner som styr rörelse med användning av en stam av nematod som uttrycker GFP (LX 929) i kolinerga neuroner4. Dessa stammar kan erhållas till mycket låga priser från Caenorhabditis elegans Genetics Center (https://cgc.umn.edu/). Stammar som uttrycker GFP i dopaminerga neuroner (OH 7457), kolinerga neuroner (LX 929) eller mCherry uttryckt i alla neuroner (PVX4) är alla bra val. Eleverna kunde också mäta rörelse och få data som åtföljer bedömningen av morfologi. En fullständig beskrivning av ett flerveckors studentgruppsprojekt finns i Susman5.
Detta studentgruppsprojekt är ganska billigt och enkelt att ställa in för grupper om fyra studenter. Materialen som behövs inkluderar ett dissekeringsmikroskop, tillgång till ett fluorescensföreningsmikroskop som kan ha en ansluten digitalkamera, petriplattor och tillgång till nematodtillväxtagar, tillväxtbegränsade bakterier (stam OP50, från CGC), en gasflamma Bunsen-brännare eller en alkohollampa, en autoklav, platinatråd och allmänna laboratorietillbehör som mikropipetters, mikroskopglas, täckglas och glas Pasteur pipetter. Beroende på vilket kemiskt toxiskt ämne som undersöks av studentgrupperna kan stegen i protokollet behöva ske under en dragskåp eller med handskar. Detta protokoll använder kemiska blandningar som är vattenlösliga (inte flyktiga), och alla säkra hanteringsförfaranden som rekommenderas av tillverkaren följs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP97445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP1AGAH0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol lamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;17012826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-012-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strains</td>
			<td>C. elegans Genetics Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1147030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain (OP50)</td>
			<td>C. elegans Genetics Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>These can vary depending on the requirement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;131045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9723-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;05408129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-265446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS4050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>94060316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-386-319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-1M30P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ61413AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC447810250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining the effect of pesticides on caenorhabditis elegans neurons

Caenorhabditis elegans är en kraftfull modellorganism som används i många forskningslaboratorier för att förstå konsekvenserna av exponering för kemiska föroreningar, bekämpningsmedel och en mängd olika giftiga ämnen. Dessa nematoder är lätta att arbeta med och kan användas för att generera nya forskningsresultat, även i grundutbildningsbiologilaboratoriet. En flerveckors laboratorieserie av autentiska, studentdrivna forskningsprojekt tränar studenterna i en verktygslåda med tekniker och tillvägagångssätt inom beteendemätningar, cellbiologi och mikroskopi som de sedan tillämpar på sina projekt. En teknik i den verktygslådan är att kvantifiera andelen neuroner som uppvisar neurodegenerativ skada efter exponering för ett kemiskt toxiskt ämne som ett bekämpningsmedel. Unga vuxna C. elegans nematoder kan utsättas för olika koncentrationer av kommersiellt tillgängliga bekämpningsmedel eller andra typer av giftiga ämnen i 2-24 timmar. Sedan kan studenter på grundnivå visualisera olika neuronundertyper med hjälp av fluorescerande uttryckande stammar av C. elegans. Dessa tekniker kräver inte sofistikerad bildbehandlingsprogramvara och är effektiva vid även låga förstoringar, vilket gör behovet av dyr konfokalmikroskopi onödig. Detta dokument visar hur man behandlar nematoderna med bekämpningsmedel och hur man avbildar och poängsätter neuronerna. Det ger också ett enkelt protokoll för mikroskopi och analys av neuronmorfologi. Materialen som används för denna teknik är billiga och lättillgängliga i de flesta grundutbildningsbiologiska avdelningar. Denna teknik kan kombineras med beteendemässiga åtgärder som rörelse, basal bromsning eller äggläggning för att genomföra en potentiellt publiceringsbar serie experiment och ge studenter en autentisk forskningsupplevelse till en mycket låg kostnad.

De metoder och protokoll som beskrivs i detta dokument ger viktiga laboratoriefärdigheter för studenter på mellannivå i biologi eller neurovetenskap. Studenterna kan få viktig erfarenhet av att utveckla ett självständigt projekt och genomföra ett experiment av egen design som kan ge nya resultat. Figur 3 visar ett optimalt resultat av ett studentprojekt som så småningom blev en del av en publicerad artikel3. Medan majoriteten av studentprojekten inte resulte...

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons at JoVE.com

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Unga vuxna Caenorhabditis elegans nematoder utsätts för olika koncentrationer av kommersiella bekämpningsmedel eller andra giftiga ämnen i 2-24 timmar. Sedan kan olika neuroner visualiseras med hjälp av fluorescerande uttryckande stammar. Detta dokument visar hur man utsätter nematoder för bekämpningsmedel och bedömer neuronskador.

Undersöker effekten av bekämpningsmedel på Caenorhabditis elegans Neurons

Caenorhabditis elegans is a powerful model organism used in many research laboratories to understand the consequences of exposure to chemical pollutants, ...

Detta protokoll är ett enkelt och genomförbart sätt för studenter att genomföra autentisk forskning som kan leda till publiceringsbara resultat. Den största fördelen är att eleverna kan genomföra originalforskning om frågor som de bestämmer på egen hand. Börja med att göra en lösningsspridare genom att försiktigt böja en Pasteur-pipett i nio milliliter glas i en Bunsen-brännarflamma och stäng pipettens öppning.Därefter steriliserar etanol spridaren före varje spridning på petriplattan. Använd en mikropipetter, placera 100 mikroliter av utspädningen på mitten av agar och sprid försiktigt över ytan med den steriliserade spridaren. Lägg sedan petriskålarna åt sidan täckta och låt lösningen suga in i ytan tills den är torr.För exponeringsperioder längre än 12 timmar, tillsätt 50 mikroliter av en nattkultur av Escherichia coli till plattorna innan nematoderna tillsätts, medan det för akuta experiment på 12 timmar eller mindre inte finns något behov av att ha E.coli på plattorna. Använd en mikropipett och placera en milliliter sterilt vatten på plattan av nematoder. Swisha sedan runt vattnet för att lyfta upp nematoderna och ta sedan bort vätskan med nematoderna till ett 1,5 milliliter mikrofugerör.Efter 10 minuter, när nematoderna avgjordes av tyngdkraften, ta försiktigt bort minst 500 mikroliter av vattnet och kassera. Återsuspendera sedan nematoderna och ta bort 50 till 100 mikroliter suspenderade maskar till varje behandlingsplatta med en avskuren gul pipettspets, så att varje platta har minst 10 vuxna maskar. Förbered två bilder genom att placera en bit etiketttejp på endast ena sidan av bilden för att bilda en dyna med enhetlig tjocklek och placera sedan en ren oanvänd bild mellan dem på bänkskivan.Placera en 10 mikroliter droppe smält agaros på mitten av bilden med hjälp av en mikropipetter. Platta sedan ut droppen genom att placera en annan ren bild ovanpå vinkelrätt mot bilden med droppen och applicera tryck så att agarosfallet bildar tjockleken på märkningstejpen. Använd sedan ett stadigt tryck för att separera de två bilderna.Vila sedan denna bild med agarsidan uppåt på bänkskivan och låt den torka i en till två minuter innan du använder den. För att tillsätta nematoder av den beredda bilden med agarosdynan, tillsätt en fem mikroliter droppe vatten innehållande en molär natriumazid till agarkudden, som kommer att bedöva maskarna och mobilisera dem. Överför sedan vid 10 nematoder per behandlingsglas till droppen med hjälp av en maskplockning, som bör steriliseras före och efter överföring av nematoderna.Lägg sedan till en täckglidning med pincett genom att placera den i en vinkel och sakta sänka den. Placera sedan det förberedda våta fästet på ett fluorescerande mikroskop för att observera maskarna först under 10X förstoring och faskontrast, sedan under 40X förstoring med faskontrast och fluorescerande belysning. Placera ett förberett vått fäste i taget på mikroskopsteget och säkra på plats med hjälp av mikroskopstegklämmorna, börja sedan titta på de våta fästena med det lägsta förstoringsmålet, som vanligtvis är 10X och använd ett ljust fält eller faskontrast för att visualisera och fokusera på nematoderna.När en nematod är placerad i synfältet, fokusera på den med hjälp av den fina fokusknappen på mikroskopet, växla sedan belysningen till fluorescens genom att vrida på ratten och rikta ljuset till kameran för att fånga de digitala bilderna. Justera sedan belysningen med hjälp av bildprogramvaran så att neuronerna är starkt upplysta men inte övermättade. Vid något tillfälle får du en separat bild av en linjal med samma förstoring som cellbilderna för att ge en förstoringsskala för deras figur.Effekterna av manganinnehållande bekämpningsmedel på dopaminneuronmorfologi med hjälp av en stam där dopaminneuroner uttrycktA GFP studerades och visade en ljus signal. Den fluorescerande signalen bleks dock om neuronerna utsätts för ljus under långa perioder. Denna procedur kan vara en del av ett flera veckors studentdrivet projekt som också kan innehålla beteendemässiga eller andra data.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Brain Imaging Undersökning av försämra Effekt av Emotion på kognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation av nervceller från Slices Gnagare Brain att studera synaptisk transmission och bild Presynaptiska Terminaler

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Cut-loading: ett användbart verktyg för att undersöka omfattningen av Gap Junction Tracer kopplingen mellan näthinnan nervceller

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo Två-foton avbildning av erfarenhet beroende molekylära förändringar i kortikala neuron

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

ETT<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modellsystem för Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Metoder för att studera verkningsmekanismerna för antipsykotiska läkemedel i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

En analys för mätning av effekterna av etanol på rörelsefart av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers för Långsiktig Kalcium Imaging av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Nya Metrics för att karaktärisera Embryonala Förlängning av nematoden<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...