Name: mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes
Uploaded: 2022-08-31T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل مشروع خطة ووهان للعلوم والتكنولوجيا (2018201261638501).

1. أخذ عينات البعوض والفرز
<ol><li>اصطياد البعوض البالغ من خلال الفخاخ الخفيفة MXA-02 أو مصائد بعوض ثاني أكسيد الكربون في الحقل.</li>
	<li>قتل البعوض الذي تم جمعه عن طريق غمس النيتروجين السائل10،11. نقلهم إلى المختبر بواسطة النظام اللوجستي لسلسلة التبريد<sup class...

<ol>
	<li>Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-associated+viruses+in+China.">Mosquito-associated viruses in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+distribution+and+diversity+of+mosquito-associated+viruses+and+their+mosquito+vectors+in+China.">A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China.</a> Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+global+distribution+of+novel+mosquito-associated+viruses+in+the+last+decade+(2007-2017).">The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017).</a> Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+metagenomic+profiling+of+viromes+associated+with+four+common+mosquito+species+in+China.">Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).</li><li>Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+viruses+and+non-human+vertebrates+in+Australia:+A+review.">Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review.</a> Viruses. 13 (2), 265 (2021).</li><li>Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+viruses-transmission+and+interaction.">Mosquito-specific viruses-transmission and interaction.</a> Viruses. 11 (9), 873 (2019).</li><li>Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+and+mosquito-borne+viruses:+evolution,+infection,+and+host+defense.">Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense.</a> Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).</li><li>Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+dynamics+of+an+insect-specific+flavivirus+in+a+naturally+infected+Culex+pipiens+laboratory+colony+and+effects+of+co-infection+on+vector+competence+for+West+Nile+virus.">Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus.</a> Virology. 427 (2), 90-97 (2012).</li><li>Baidaliuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-fusing+agent+virus+reduces+arbovirus+dissemination+in+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+vivo.">Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo.</a> Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+virome+analysis+of+Culex+mosquitoes+from+Kenya+and+China.">Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China.</a> Viruses. 10 (1), 30 (2018).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+isolation+and+characterization+of+a+group+C+Banna+virus+(BAV)+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Hubei,+China.">First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China.</a> Viruses. 10 (10), 555 (2018).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+the+virome+in+lab-+and+field-collected+Aedes+albopictus+mosquitoes+across+different+developmental+stages+and+possible+core+viruses+in+the+publicly+available+virome+data+of+Aedes+mosquitoes.">Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes.</a> mSystems. 5 (5), 00640 (2020).</li><li>Zhou, M., Chu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+main+mosquito+species+in+China+based+on+DNA+barcoding.">Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding.</a> Plos One. 7 (10), (2012).</li><li>Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bold:+The+Barcode+of+Life+Data+System+(www.barcodinglife.org).">Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org).</a> Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+new+strain+of+mosquito+Flavivirus+derived+from+Culicoides.">In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides.</a> Viruses. 14 (6), 1298 (2022).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+Tanay+virus+isolated+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Yunnan,+China.">Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).</li><li>Ren, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+reassortment+Tibet+orbivirus+isolated+from+Culicoides+spp.+in+Yunnan,+PR+China.">Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China.</a> Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).</li></ol>

كان الهدف من هذه الطريقة هو تقديم طريقة عملية لعزل الفيروسات المرتبطة بالبعوض باستخدام خطوط الخلايا المختلفة. من الأهمية بمكان إضافة المضادات الحيوية ومضادات الفطريات (البنسلين - الستربتومايسين - الأمفوتريسين) إلى المواد الطافية لمتجانسات البعوض لتجنب التلوث بالبكتيريا أو الفطريات. يجب...

البعوض هي مجموعة من ناقلات المفصليات المسببة للأمراض الهامة. هناك ما يقرب من 3500 نوع من البعوض في عائلة Culicidae1،2. أدى تطوير تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية إلى اكتشاف العديد من التسلسلات الجديدة الشبيهة بالفيروسات في البعوض من أجزاء مختلفة من العالم3. بشكل عام ، يمكن تصنيف هذه الفيروسات المرتبطة بالبعوض إلى مجموعتين رئيسيتين: MBVs و MSVs.
MBVs هي مجموعة من الفيروسات المتنوعة التي تعد عوامل مسببة للعديد من الأمراض البشرية أو الحيوانية ، مثل فيروس الحمى الصفراء (YFV) وفيروس حمى الضنك (DENV) وفيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV) وفيروس غرب النيل (WNV) وفيروس حمى الوادي المتصدع (RVFV)4. لقد هددت الصحة العامة بشكل خطير من خلال التسبب في مراضة ووفيات شديدة لكل من البشر والحيوانات في جميع أنحاء العالم. تحافظ MBVs بشكل طبيعي على دورة حياة بين مضيفين متنوعين من خلال الانتقال من بعوضة مصابة إلى مضيف ساذج ، وكذلك من مضيف مصاب بالفيروس وإلى بعوضة تتغذى5. لذلك ، يمكن لهذه الفيروسات أن تصيب كلا من خطوط خلايا البعوض وخطوط خلايا الفقاريات في المختبر1.
MSVs ، والتي تشمل فيروس Yichang (YCN) ، وفيروس Culex flavivirus (CxFV) ، وفيروس Chaoyang (CHAOV) ، هي مجموعة فرعية من الفيروسات الخاصة بالحشرات1،6،7. في السنوات الأخيرة ، كان هناك ارتفاع في اكتشاف MSVs الجديدة ، وقد وجد أن بعض هذه MSVs لها تأثير على انتقال MBVs. على سبيل المثال ، يمكن ل CxFV ، الذي يمكن أن يكون عدوى مستمرة في Culex pipiens، قمع تكرار WNV في مرحلة مبكرة8. وقد وجد أن فيروسا فلافيا آخر خاصا بالحشرات، وهو فيروس عامل الالتحام الخلوي (CFAV)، يمنع انتشار فيروس حمى الضنك وفيروس زيكا في بعوضة الزاعجة المصرية 9. وبالتالي ، فإن هذا البروتوكول هو نهج مفيد لعزل الفيروسات المرتبطة بالبعوض ويمكن أن يساعد في مزيد من البحوث في توزيع مسببات الأمراض المتعلقة بالبعوض ومكافحة الأمراض التي ينقلها البعوض.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3524</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 flasks</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Instrument for centrifugation of mosquito samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s minimal essential medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>medium for vertebrate cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feta Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141C</td>
			<td> 
			 
			Provide nutrition for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-speed low-temperature tissue homogenizer</td>
			<td>servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (28 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15410-122</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute&#160; medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td>medium for mosiquto cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL)</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile pestles</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y004</td>
			<td>Consumables&#160; for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y30</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the light traps MXA-02</td>
			<td>Maxttrac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The QIAamp viral RNA mini kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes

مع التطبيق الواسع لتقنيات التسلسل ، تم اكتشاف العديد من التسلسلات الجديدة الشبيهة بالفيروسات في المفصليات ، بما في ذلك البعوض. الفئتان الرئيسيتان لهذه الفيروسات الجديدة المرتبطة بالبعوض هما "الفيروسات التي ينقلها البعوض (MBVs)" و "الفيروسات الخاصة بالبعوض (MSVs)". قد تكون هذه الفيروسات الجديدة مسببة للأمراض لكل من الفقاريات والبعوض ، أو يمكن أن تكون تكافلية مع البعوض. فيروسات الكيانات ضرورية لتأكيد الخصائص البيولوجية لهذه الفيروسات. وبالتالي ، تم وصف بروتوكول مفصل هنا لعزل الفيروس وتضخيمه من البعوض الذي تم جمعه ميدانيا. أولا ، تم تحضير عينات البعوض كطاف لمتجانسات البعوض. بعد الطرد المركزي مرتين ، تم بعد ذلك تلقيح المواد الطافية إما في خط خلايا البعوض C6 / 36 أو خط خلايا الفقاريات BHK-21 لتضخيم الفيروس. بعد 7 أيام ، تم جمع المواد الطافية كمواد طافية P1 وتخزينها عند -80 درجة مئوية. بعد ذلك ، تم تمرير طافات P1 مرتين أخريين في خلايا C6 / 36 أو BHK-21 أثناء فحص حالة الخلية يوميا. عندما تم اكتشاف التأثير الممرض الخلوي (CPE) على الخلايا ، تم جمع هذه المواد الطافية واستخدامها لتحديد الفيروسات. يعمل هذا البروتوكول كأساس للبحوث المستقبلية حول الفيروسات المرتبطة بالبعوض ، بما في ذلك MBVs و MSVs.

بعد التلقيح بالمواد الطافية لمتجانسات البعوض (P0) ، أظهرت خلايا C6 / 36 مساحة واسعة بين الخلايا ، ولوحظت الخلايا المقشرة عند 120 ساعة (الشكل 1 أ) مقارنة بالخلايا غير الملقحة (السيطرة) في نفس الوقت (الشكل 1 ب). بعد احتضان خلايا BHK-21 بالمواد الطافية P3 ، لوحظ CPE مرئي في خل...

Watch this Scientific Journal Video about Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes at JoVE.com

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

تم العثور على العديد من التسلسلات الجديدة الشبيهة بالفيروسات في البعوض بسبب الاستخدام المكثف لتقنيات التسلسل. نحن نقدم إجراء فعالا لعزل الفيروسات وتضخيمها باستخدام الفقاريات وخطوط خلايا البعوض ، والتي قد تكون بمثابة أساس للدراسات المستقبلية حول الفيروسات المرتبطة بالبعوض ، بما في ذلك الفيروسات التي ينقلها البعوض والفيروسات الخاصة بالبعوض.

عزل الفيروسات المرتبطة بالبعوض من البعوض الذي تم جمعه في الحقول

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

هذا البروتوكول هو نهج مفيد لعزل الفيروسات المرتبطة بالبعوض ويمكن أن يساعد في مزيد من البحوث في توزيع مسببات الأمراض المتعلقة بالبعوض ومكافحة الأمراض التي ينقلها البعوض. يعد استخدام خطوط رفيعة لعزل الفيروسات في مختبر السلامة الأحيائية من المستوى 2 أكثر أمانا وكفاءة. على عكس إجراءات عزل الفيروسات الأخرى ، مثل التلقيح الأحمر بالدراجة بسائل متغير ، لا تتطلب هذه التقنية إجراء تجارب على الحيوانات أو تقييم أخلاقي.يمكن أن يؤدي التلوث من العينات والخلايا التي يتم سحبها أثناء الحضانة إلى فشل التجربة. وبالتالي ، من الضروري إضافة 2٪ بنسلين-ستربتومايسين-أمفوتريسين إلى الوسط لمنع التلوث. ابدأ بإضافة حبات خزفية بثلاثة ملليمترات ، 1.5 ملليلتر من وسط RPMI مكمل بمحلول 2٪ بنسلين-ستربتومايسين-أمفوتريسين ب في أنبوب معقم سعة 2 مليلتر يوضع على الجليد ثم انقل 50 بعوضة فيه.بعد ذلك ، قم بتجانس البعوض باستخدام خالط الأنسجة بدرجة حرارة منخفضة عن طريق الطحن لمدة 30 ثانية عند 70 هرتز و 4 درجات مئوية لمدة 3 دورات. أجهزة الطرد المركزي المجانسة عند 15،000 G لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ونقل المواد الطافية إلى الأنابيب الجديدة. لإزالة حطام البعوض تماما ، قم بطرد الجهاز الطافي مرة أخرى عند 15،000 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.قم بقسمة 200 ميكرولتر من المادة الطافية P0 في أنبوب تخزين بغطاء لولبي سعة 2 ملليلتر ، وقم بتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. لتضخيم الفيروس ، استخدم خط خلايا البعوض Aedes albopictus RNAi الذي يعاني من نقص C6 / 36 وخط خلايا الفقاريات أو كلية الهامستر الصغيرة أو BHK-21 من قارورة مربعة طولها 75 سم وقم بزرعها في 24 لوحة بئر بشكل منفصل. ضع صفيحة البئر المصنفة 24 طوال الليل عند 28 أو 37 درجة مئوية.في اليوم التالي ، راقب الخلايا الموجودة تحت المجهر لتأكيد التقاء 80 إلى 90٪ في كل بئر. تحضير 500 ملليلتر من وسط صيانة زراعة الخلايا تستكمل بالمضادات الحيوية. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا من 24 لوحة بئر وأضف 100 ميكرولتر من وسيط صيانة زراعة الخلايا إلى كل بئر.ثم تلقيح الخلايا مع 100 ميكرولتر من طاف البعوض المجانس أو P0. احتضن الألواح عند 28 أو 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة وهز الألواح برفق بعد كل 15 دقيقة لمنع جفاف الخلايا. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وشطف كل بئر ب 600 ميكرولتر من وسط صيانة زراعة الخلايا لإزالة الحطام تماما. بعد ذلك ، أضف 800 ميكرولتر من وسط صيانة زراعة الخلايا إلى كل بئر قبل وضع الألواح في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 28 أو 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام.مراقبة يومية لحالة خلايا كل بئر تحت المجهر. في اليوم السابع ، اجمع طاف الخلايا المعروف باسم P1 وقم بتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. كرر الإجراء لجمع الطافات الفيروسية P2 و P3.بسبب التأثير الممرض الخلوي ، أو CPE ، تموت الخلايا من بعض الآبار وتنفصل عن السطح. لتضخيم الفيروسات بشكل كبير ، اجمع 300 إلى 400 ميكرولتر من المادة الطافية من الآبار التي تظهر تأثير CPE وانقلها إلى صفيحة جديدة من ستة آبار تحتوي على 80 إلى 90٪ من خلايا التقاء خلايا الثقافة. أخيرا ، قم بجمع ونقل 500 ميكرولتر من المادة الطافية من آبار الصفيحة ذات الستة آبار إلى أنابيب تخزين ذات غطاء لولبي سعة 2 مليلتر قبل تخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.أظهر تلقيح خلايا C6 / 36 بمتجانسات البعوض P0 مساحة واسعة بين الخلايا في الخلايا المقشرة في فترة 120 ساعة بعد الإصابة مقارنة بالخلايا غير الملقحة أو الضابطة. أظهرت حضانة خلايا BHK21 مع الطافات الفيروسية P3 CPE مرئية في 48 ساعة بعد الإصابة ، مما يدل على موت الخلية والانفصال عن السطح على عكس الخلايا الضابطة. تم استخدام الاشعال العالمية المتاحة تجاريا أو Flaviviruses و Alphaviruses و Bunyaviruses لتوليد منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل للطاف الفيروسي.تم تعيين منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل لفيروس بونيا ، فيروس بحيرة إبينور ، كعنصر تحكم إيجابي. وسلط حظر تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الممرات التابعة لفيروسات بونيا والمراقبة الإيجابية الضوء على إمكانية وجود فيروس بونيا في المواد الطافية. لتحسين معدل نجاح عزل الفيروس ، حافظ على درجة حرارة منخفضة أثناء نقل العينات وعزلها وطحنها.أضف المضادات الحيوية عند تجانس البعوض والثقافة نفسها. والتعامل مع الثقافة بسرعة أثناء الحضانة وإزالة وسط الاستزراع. بالإضافة إلى هذا الإجراء ، يمكن حقن محلول الطحن في فأر ركوب الدراجات أو جنين الدجاج.ومع ذلك ، فإن إجراء التأكيد سيثير مخاوف أخلاقية ويزيد من تكلفة التجربة.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

تشريح الغدد اللعابية والمعي المتوسط ​​من AE. بعوض البعوض

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

عزل الحمض النووي الجينوم من الذيول ماوس

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

الميتوكوندريا من عزل العضلات والهيكل العظمي

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

عزل الخلايا المناعية من الأورام الأولية

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

على البروتين MultiBac مجمع منصة الإنتاج في EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

عزل Myofibroblasts من الفأر والمرئ الإنسان

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

مقايسة متعدد الكشف عن الملاريا بث البعوض

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

بروتوكولات لاختبار السمية لرواية كيمياء مبيدات الحشرات للبعوض

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

أجبر اللعاب كأسلوب لتحليل اختصاص البعوض ناقل

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

عزل الخلايا العضلية الأذينية والبطينية عالية الجودة للقياسات المتزامنة لتيار الكالسيوم2+ العابر وتيار الكالسيوم من النوع L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...