Name: mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes
Uploaded: 2022-08-31T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).

1. Mygprøveudtagning og sortering
<ol><li>Fang de voksne myg gennem lysfælderne MXA-02 eller kuldioxid myggefælder i marken.</li>
	<li>Dræb de indsamlede myg ved at dyppe i flydende nitrogen10,11. Transporter dem til laboratoriet med kølekædens logistiksystem12. BEMÆRK: Tøris blev primært brugt i kølekædens logistiksystem.</li>
	<li>(Valgfrit) Hvis prøvestederne var i nærheden af laboratoriet, skal du dir...

<ol>
	<li>Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-associated+viruses+in+China.">Mosquito-associated viruses in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+distribution+and+diversity+of+mosquito-associated+viruses+and+their+mosquito+vectors+in+China.">A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China.</a> Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+global+distribution+of+novel+mosquito-associated+viruses+in+the+last+decade+(2007-2017).">The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017).</a> Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+metagenomic+profiling+of+viromes+associated+with+four+common+mosquito+species+in+China.">Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).</li><li>Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+viruses+and+non-human+vertebrates+in+Australia:+A+review.">Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review.</a> Viruses. 13 (2), 265 (2021).</li><li>Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+viruses-transmission+and+interaction.">Mosquito-specific viruses-transmission and interaction.</a> Viruses. 11 (9), 873 (2019).</li><li>Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+and+mosquito-borne+viruses:+evolution,+infection,+and+host+defense.">Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense.</a> Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).</li><li>Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+dynamics+of+an+insect-specific+flavivirus+in+a+naturally+infected+Culex+pipiens+laboratory+colony+and+effects+of+co-infection+on+vector+competence+for+West+Nile+virus.">Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus.</a> Virology. 427 (2), 90-97 (2012).</li><li>Baidaliuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-fusing+agent+virus+reduces+arbovirus+dissemination+in+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+vivo.">Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo.</a> Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+virome+analysis+of+Culex+mosquitoes+from+Kenya+and+China.">Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China.</a> Viruses. 10 (1), 30 (2018).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+isolation+and+characterization+of+a+group+C+Banna+virus+(BAV)+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Hubei,+China.">First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China.</a> Viruses. 10 (10), 555 (2018).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+the+virome+in+lab-+and+field-collected+Aedes+albopictus+mosquitoes+across+different+developmental+stages+and+possible+core+viruses+in+the+publicly+available+virome+data+of+Aedes+mosquitoes.">Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes.</a> mSystems. 5 (5), 00640 (2020).</li><li>Zhou, M., Chu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+main+mosquito+species+in+China+based+on+DNA+barcoding.">Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding.</a> Plos One. 7 (10), (2012).</li><li>Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bold:+The+Barcode+of+Life+Data+System+(www.barcodinglife.org).">Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org).</a> Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+new+strain+of+mosquito+Flavivirus+derived+from+Culicoides.">In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides.</a> Viruses. 14 (6), 1298 (2022).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+Tanay+virus+isolated+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Yunnan,+China.">Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).</li><li>Ren, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+reassortment+Tibet+orbivirus+isolated+from+Culicoides+spp.+in+Yunnan,+PR+China.">Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China.</a> Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).</li></ol>

Formålet med denne metode var at tilbyde en praktisk måde at isolere myg-associerede vira ved hjælp af forskellige cellelinjer. Det er afgørende at tilsætte antibiotika-antimykotikum (Penicillin-Streptomycin-Amphotericin) til myggehomogenaternes supernatanter for at undgå forurening med bakterier eller svampe. Myg og evirale supernatanter i marken skal nedkøles ved -80 °C for at undgå gentagne cyklusser med fryse-optøning.
Et andet kritisk trin i protokollen var slibning. Mygprøver ...

Myg er en gruppe af vigtige patogene leddyrvektorer. Der er cirka 3.500 arter af myg i familien Culicidae 1,2. Udviklingen af high-throughput sekventeringsteknologier har ført til opdagelsen af mange nye, viruslignende sekvenser i myg fra forskellige dele af verden3. Generelt kan disse myg-associerede vira klassificeres i to hovedgrupper: MBV'er og MSV'er.
MBV'er er en gruppe af forskellige vira, der er årsagsmidler til mange sygdomme hos mennesker eller dyr, såsom gul feber-virus (YFV), dengue-virus (DENV), japansk encefalitisvirus (JEV), West Nile-virus (WNV) og Rift Valley fever-virus (RVFV)4. De har alvorligt truet folkesundheden ved at forårsage alvorlig sygelighed og dødelighed hos både mennesker og dyr over hele verden. MBV'er opretholder naturligt en livscyklus mellem forskellige værter gennem transmission fra en inficeret myg til en naiv vært såvel som fra en virusinficeret vært og til en fodringsmyg5. Derfor kan disse vira inficere både mygcellelinjer og hvirveldyrcellelinjer i laboratoriet1.
MSV'er, som omfatter Yichang-virus (YCN), Culex flavivirus (CxFV) og Chaoyang-virus (CHAOV), er en undergruppe af insektspecifikke vira 1,6,7. I de senere år har der været en stigning i opdagelsen af nye MSV'er, og nogle af disse MSV'er har vist sig at have en indvirkning på transmissionen af MBV'er. For eksempel kan CxFV, som kan være en vedvarende infektion i Culex pipiens, undertrykke WNV-replikation på et tidligt stadium8. Et andet insektspecifikt flavivirus, cellefusionsmiddelvirus (CFAV), har vist sig at hæmme udbredelsen af DENV og Zika-virus (ZIKV) i Aedes aegypti-myg 9. Således er denne protokol en nyttig tilgang til isolering af mygassocierede vira og kan hjælpe med yderligere forskning i fordelingen af patogener relateret til myg og kontrol af mygbårne sygdomme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3524</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 flasks</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Instrument for centrifugation of mosquito samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s minimal essential medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>medium for vertebrate cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feta Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141C</td>
			<td> 
			 
			Provide nutrition for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-speed low-temperature tissue homogenizer</td>
			<td>servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (28 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15410-122</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute&#160; medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td>medium for mosiquto cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL)</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile pestles</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y004</td>
			<td>Consumables&#160; for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y30</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the light traps MXA-02</td>
			<td>Maxttrac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The QIAamp viral RNA mini kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes

Med den brede anvendelse af sekventeringsteknologier er mange nye viruslignende sekvenser blevet opdaget i leddyr, herunder myg. De to hovedkategorier af disse nye myggeassocierede vira er "myggebårne vira (MBV'er)" og "myggespecifikke vira (MSV'er)". Disse nye vira kan være patogene for både hvirveldyr og myg, eller de kan bare være symbiotiske med myg. Entitetsvira er afgørende for at bekræfte disse viras biologiske egenskaber. Således er der beskrevet en detaljeret protokol her for virusisolering og forstærkning fra feltindsamlede myg. Først blev myggeprøverne fremstillet som supernatanter af myggehomogenater. Efter centrifugering to gange blev supernatanterne podet til enten mygcellelinje C6/36 eller hvirvelcellelinje BHK-21 til virusamplifikation. Efter 7 dage blev supernatanterne opsamlet som P1-supernatanter og opbevaret ved -80 °C. Dernæst blev P1-supernatanter passeret to gange mere i C6/36- eller BHK-21-celler, mens cellestatus blev kontrolleret dagligt. Når cytopatogen virkning (CPE) på cellerne blev opdaget, blev disse supernatanter indsamlet og anvendt til at identificere vira. Denne protokol tjener som grundlag for fremtidig forskning i myg-associerede vira, herunder MBV'er og MSV'er.

Efter podning med supernatanterne af myggehomogenaterne (P0) udviste C6/36-cellerne et bredt intercellulært rum, og eksfolierede celler blev observeret ved 120 timer (figur 1A) sammenlignet med de ikke-inokulerede celler (kontrol) på samme tid (figur 1B). Efter inkubation af BHK-21-cellerne med P3-supernatanterne blev der observeret synlig CPE i BHK-21-cellerne ved 48 timer (figur 1C) i modsætning til kontrolcellerne (<strong cla...

Watch this Scientific Journal Video about Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes at JoVE.com

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

Talrige nye viruslignende sekvenser er fundet i myg på grund af den omfattende brug af sekventeringsteknologier. Vi leverer en effektiv procedure til isolering og forstærkning af vira ved hjælp af hvirveldyr og mygcellelinjer, som kan tjene som grundlag for fremtidige undersøgelser af myggeassocierede vira, herunder myggebårne og myggespecifikke vira.

Myg-associeret virusisolering fra feltindsamlede myg

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

Denne protokol er en nyttig tilgang til isolering af myg-associerede vira og kan hjælpe med yderligere forskning i fordelingen af patogener relateret til myg og kontrol af mygbårne sygdomme. Brug af tynde linjer til at isolere vira i Biosafety level 2 laboratoriet er sikrere og mere effektivt. I modsætning til andre virusisolationsprocedurer, såsom cykling af rød podning med varierende væske, kræver denne teknik ikke dyreforsøg eller etisk vurdering.Forureningen fra prøver og cellerne, der trækkes under inkubationen, kan føre til, at eksperimentet mislykkes. Derfor er det nødvendigt at tilføje 2% Penicillin-Streptomycin-Amphotericin i mediet for at forhindre forurening. Begynd med tilsætning af tre millimeter keramiske perler, 1,5 ml RPMI-medium suppleret med 2% Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B-opløsning i et to-milliliter sterilt rør anbragt på is og overfør derefter 50 myg i det.Derefter homogeniseres myggene med en lavtemperaturvævshomogenisator ved slibning i 30 sekunder ved 70 hertz og 4 grader Celsius i 3 cyklusser. Homogenatet centrifugeres ved 15.000 G i 30 minutter ved 4 grader Celsius, og supernatanterne overføres til de nye glas. For at fjerne mygresterne helt, centrifuger supernatanten igen ved 15.000 G i 10 minutter ved 4 grader Celsius.De 200 mikroliter supernatant P0 hældes i et opbevaringsrør med skruelåg på to ml, og det opbevares ved minus 80 grader Celsius. Til virusforstærkning skal du bruge Aedes albopictus RNAi-mangelfuld mygcellelinje C6/36 og en hvirveldyrcellelinje, babyhamsternyre eller BHK-21 fra en 75 centimeter firkantet kolbe og frø dem i 24 brøndplader separat. Placer den seedede 24 brøndplade natten over ved 28 eller 37 grader Celsius.Den næste dag skal du observere cellerne under mikroskopet for at bekræfte 80 til 90% sammenløb i hver brønd. Forbered 500 ml af cellekulturvedligeholdelsesmediet suppleret med antibiotika. Fjern cellekulturmediet fra de 24 brøndplader, og tilsæt 100 mikroliter cellekulturvedligeholdelsesmediet til hver brønd.Derefter podes cellerne med 100 mikroliter supernatant af myghomogenatet eller P0. Inkuber pladerne ved 28 eller 37 grader Celsius i 60 minutter og ryst forsigtigt pladerne efter hvert 15. minut for at forhindre tørring af cellerne. Når det er gjort, fjernes supernatanten, og hvert hul skylles med 600 mikroliter vedligeholdelsesmedium for cellekultur for at fjerne snavset helt. Derefter tilsættes 800 mikroliter cellekulturvedligeholdelsesmedium til hver brønd, inden pladerne placeres i en 5% kuldioxidbefugtet inkubator ved 28 eller 37 grader Celsius i 7 dage.Daglig overvågning af tilstanden af cellerne i hver brønd under mikroskopet. På den syvende dag opsamles supernatanten af celler kendt som P1 og opbevares ved minus 80 grader Celsius. Proceduren for indsamling af P2- og P3-virussupernatanter gentages.På grund af den cytopatogene virkning eller CPE dør celler fra nogle af brøndene og løsner sig fra overfladen. For i høj grad at forstærke viraerne Opsaml 300 til 400 mikroliter supernatant fra huller, der viser CPE-effekten, og overfør den til en ny plade med seks brønde med 80 til 90% cellesammenløb af dyrkningsceller. Endelig opsamles og overføres 500 mikroliter supernatant fra hullerne i seksbrøndspladen til opbevaringsrør med skruelåg på to ml, inden de opbevares ved minus 80 grader Celsius.Podningen af C6/36-celler med myggehomogenaterne P0 udviste et bredt intercellulært rum i eksfolierede celler 120 timer efter infektionsperioden sammenlignet med de ikke-inokulerede celler eller kontrolceller. Inkubation af BHK21-celler med P3-virussupernatanterne viste en synlig CPE 48 timer efter infektion, der viste cellens død og løsrivelse fra overfladen i modsætning til kontrolcellerne. Kommercielt tilgængelige universalprimere eller flavivirus, alfavirus og bunyavirus blev brugt til at generere PCR-produkterne til virussupernatanten.Et PCR-produkt til Bunyavirus, Ebinur Lake-virus, blev sat som en positiv kontrol. PCR-amplifikationsforbuddene i baner, der tilhører bunyavirus, og den positive kontrol fremhævede muligheden for tilstedeværelse af bunyavirus i supernatanterne. For at forbedre succesraten for virusisolering skal du holde en lav temperatur under prøvetransport, isolering og slibning.Tilsæt antibiotika, når du homogeniserer myggene og selve kulturen. Og håndter kulturen hurtigt under inkubation og fjernelse af kulturmediet. Ud over denne procedure kan slibeopløsningen injiceres i en cyklende rotte eller kyllingembryo.Bekræftelsesproceduren vil imidlertid rejse etiske bekymringer og øge omkostningerne ved eksperimentet.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex Production Platform på EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolering af myofibroblaster fra mus og human Spiserøret

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

En Multi-påvisningsassay for Malaria Fremsendende Myg

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protokoller for afprøvning toksicitet af roman insektbekæmpelsesmidler kemi til myg

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Tvunget spytsekretion som en metode til at analysere vektor kompetence af myg

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolering af murin atriale og ventrikulære myocytter af høj kvalitet til samtidige målinger afCa2+ transienter og L-type calciumstrøm

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...