Name: mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes
Uploaded: 2022-08-31T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).

1. Bemonstering en sortering van muggen
<ol><li>Vang de volwassen muggen door de lichtvallen MXA-02 of kooldioxidemuggenvallen in het veld.</li>
	<li>Dood de verzamelde muggen door te dopen in vloeibare stikstof10,11. Transporteer ze naar het laboratorium door het logistieke systeem van de koelketen12. OPMERKING: Droogijs werd voornamelijk gebruikt in het logistieke systeem van de koelketen.</li>
	<li>(Optioneel) Als ...

<ol>
	<li>Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-associated+viruses+in+China.">Mosquito-associated viruses in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+distribution+and+diversity+of+mosquito-associated+viruses+and+their+mosquito+vectors+in+China.">A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China.</a> Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+global+distribution+of+novel+mosquito-associated+viruses+in+the+last+decade+(2007-2017).">The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017).</a> Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+metagenomic+profiling+of+viromes+associated+with+four+common+mosquito+species+in+China.">Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).</li><li>Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+viruses+and+non-human+vertebrates+in+Australia:+A+review.">Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review.</a> Viruses. 13 (2), 265 (2021).</li><li>Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+viruses-transmission+and+interaction.">Mosquito-specific viruses-transmission and interaction.</a> Viruses. 11 (9), 873 (2019).</li><li>Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+and+mosquito-borne+viruses:+evolution,+infection,+and+host+defense.">Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense.</a> Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).</li><li>Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+dynamics+of+an+insect-specific+flavivirus+in+a+naturally+infected+Culex+pipiens+laboratory+colony+and+effects+of+co-infection+on+vector+competence+for+West+Nile+virus.">Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus.</a> Virology. 427 (2), 90-97 (2012).</li><li>Baidaliuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-fusing+agent+virus+reduces+arbovirus+dissemination+in+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+vivo.">Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo.</a> Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+virome+analysis+of+Culex+mosquitoes+from+Kenya+and+China.">Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China.</a> Viruses. 10 (1), 30 (2018).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+isolation+and+characterization+of+a+group+C+Banna+virus+(BAV)+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Hubei,+China.">First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China.</a> Viruses. 10 (10), 555 (2018).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+the+virome+in+lab-+and+field-collected+Aedes+albopictus+mosquitoes+across+different+developmental+stages+and+possible+core+viruses+in+the+publicly+available+virome+data+of+Aedes+mosquitoes.">Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes.</a> mSystems. 5 (5), 00640 (2020).</li><li>Zhou, M., Chu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+main+mosquito+species+in+China+based+on+DNA+barcoding.">Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding.</a> Plos One. 7 (10), (2012).</li><li>Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bold:+The+Barcode+of+Life+Data+System+(www.barcodinglife.org).">Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org).</a> Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+new+strain+of+mosquito+Flavivirus+derived+from+Culicoides.">In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides.</a> Viruses. 14 (6), 1298 (2022).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+Tanay+virus+isolated+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Yunnan,+China.">Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).</li><li>Ren, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+reassortment+Tibet+orbivirus+isolated+from+Culicoides+spp.+in+Yunnan,+PR+China.">Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China.</a> Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).</li></ol>

Het doel van deze methode was om een praktische manier te bieden voor het isoleren van muggen-geassocieerde virussen met behulp van verschillende cellijnen. Het is van cruciaal belang om het antibioticum-antimycoticum (penicilline-streptomycine-amfotericine) toe te voegen aan de supernatanten van de muggenhomogenaten om besmetting door bacteriën of schimmels te voorkomen. Muggen en virale supernatanten die in het veld worden verkregen, moeten bij -80 °C worden gekoeld om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen.
<p c...

Muggen zijn een groep belangrijke pathogene geleedpotige vectoren. Er zijn ongeveer 3.500 soorten muggen in de familie Culicidae 1,2. De ontwikkeling van high-throughput sequencing-technologieën heeft geleid tot de ontdekking van vele nieuwe, virusachtige sequenties in muggen uit verschillende delen van de wereld3. Over het algemeen kunnen deze muggengerelateerde virussen worden ingedeeld in twee hoofdgroepen: MBV's en MSV's.
MBV's zijn een groep van diverse virussen die veroorzakers zijn van veel menselijke of dierlijke ziekten, zoals gelekoortsvirus (YFV), denguevirus (DENV), Japans encefalitisvirus (JEV), Westnijlvirus (WNV) en Rift Valley-koortsvirus (RVFV)4. Ze hebben de volksgezondheid ernstig bedreigd door ernstige morbiditeit en mortaliteit te veroorzaken bij zowel mensen als dieren over de hele wereld. MBV's ondersteunen van nature een levenscyclus tussen verschillende gastheren door overdracht van een geïnfecteerde mug naar een naïeve gastheer, evenals van een met virus geïnfecteerde gastheer en naar een voedende mug5. Daarom kunnen deze virussen zowel muggencellijnen als gewervelde cellijnen in het labinfecteren 1.
MSV's, waaronder Yichang-virus (YCN), Culex flavivirus (CxFV) en Chaoyang-virus (CHAOV), zijn een subgroep van insectenspecifieke virussen 1,6,7. In de afgelopen jaren is er een toename geweest in de ontdekking van nieuwe MSV's, en sommige van deze MSV's blijken een impact te hebben op de transmissie van MBV's. CxFV, dat een aanhoudende infectie in Culex pipiens kan zijn, kan bijvoorbeeld WNV-replicatie in een vroeg stadiumonderdrukken 8. Een ander insectspecifiek flavivirus, cell-fusing agent virus (CFAV), blijkt de verspreiding van DENV- en Zika-virus (ZIKV) in Aedes aegypti-muggen te remmen 9. Dit protocol is dus een nuttige benadering voor het isoleren van muggen-geassocieerde virussen en kan helpen bij verder onderzoek naar de verspreiding van pathogenen gerelateerd aan muggen en de bestrijding van door muggen overgedragen ziekten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3524</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 flasks</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Instrument for centrifugation of mosquito samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s minimal essential medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>medium for vertebrate cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feta Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141C</td>
			<td> 
			 
			Provide nutrition for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-speed low-temperature tissue homogenizer</td>
			<td>servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (28 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15410-122</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute&#160; medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td>medium for mosiquto cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL)</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile pestles</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y004</td>
			<td>Consumables&#160; for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y30</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the light traps MXA-02</td>
			<td>Maxttrac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The QIAamp viral RNA mini kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes

Met de brede toepassing van sequencingtechnologieën zijn veel nieuwe virusachtige sequenties ontdekt in geleedpotigen, waaronder muggen. De twee belangrijkste categorieën van deze nieuwe muggen-geassocieerde virussen zijn "mug-borne virussen (MBV's)" en "mug-specifieke virussen (MSV's)". Deze nieuwe virussen kunnen pathogeen zijn voor zowel gewervelde dieren als muggen, of ze kunnen gewoon symbiotisch zijn met muggen. Entiteitsvirussen zijn essentieel om de biologische kenmerken van deze virussen te bevestigen. Zo is hier een gedetailleerd protocol beschreven voor virusisolatie en versterking van in het veld verzamelde muggen. Eerst werden de muggenmonsters bereid als supernatanten van muggenhomogenaten. Na tweemaal centrifugeren werden de supernatanten vervolgens ingeënt in muggencellijn C6/36 of gewervelde cellijn BHK-21 voor virusversterking. Na 7 dagen werden de supernatanten verzameld als de P1-supernatanten en bewaard bij -80 °C. Vervolgens werden P1-supernatanten nog twee keer gepasseerd in C6/36- of BHK-21-cellen terwijl de celstatus dagelijks werd gecontroleerd. Toen cytopathogeen effect (CPE) op de cellen werd ontdekt, werden deze supernatanten verzameld en gebruikt om virussen te identificeren. Dit protocol dient als basis voor toekomstig onderzoek naar muggen-geassocieerde virussen, waaronder MBV's en MSV's.

Na inenting met de supernatanten van de muggenhomogenaten (P0) vertoonden de C6/36-cellen een brede intercellulaire ruimte en geëxfolieerde cellen werden waargenomen na 120 uur (figuur 1A) in vergelijking met de niet-geënte cellen (controle) op hetzelfde moment (figuur 1B). Na het incuberen van de BHK-21-cellen met de P3-supernatanten werd zichtbare CPE waargenomen in de BHK-21-cellen na 48 uur (figuur 1C) in tegenstelling tot de ...

Watch this Scientific Journal Video about Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes at JoVE.com

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

Talrijke nieuwe virusachtige sequenties zijn gevonden in muggen als gevolg van het uitgebreide gebruik van sequencing-technologieën. We bieden een effectieve procedure voor het isoleren en versterken van virussen met behulp van gewervelde en muggencellijnen, die als basis kunnen dienen voor toekomstige studies naar muggengerelateerde virussen, waaronder door muggen overgedragen en muggenspecifieke virussen.

Muggen-geassocieerde virusisolatie van in het veld verzamelde muggen

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

Dit protocol is een nuttige aanpak voor het isoleren van muggen-geassocieerde virussen en kan helpen bij verder onderzoek naar de verspreiding van pathogenen gerelateerd aan muggen en de bestrijding van door muggen overgedragen ziekten. Het gebruik van dunne lijnen om virussen te isoleren in bioveiligheidsniveau 2 laboratorium is veiliger en efficiënter. In tegenstelling tot andere virusisolatieprocedures, zoals het fietsen van rode inenting met variërende vloeistof, vereist deze techniek geen dierproeven of ethische beoordeling.De besmetting van monsters en de cellen die tijdens de incubatie worden getekend, kan leiden tot het mislukken van het experiment. Daarom is het noodzakelijk om 2% Penicilline-Streptomycine-Amfotericine in het medium toe te voegen om besmetting te voorkomen. Begin met de toevoeging van drie millimeter keramische kralen, 1,5 milliliter RPMI-medium aangevuld met 2% Penicilline-Streptomycine-Amfotericine B-oplossing in een steriele buis van twee milliliter die op ijs wordt geplaatst en breng er vervolgens 50 muggen in over.Homogeniseer vervolgens de muggen met een weefselhomogenisator op lage temperatuur door gedurende 30 seconden te malen bij 70 hertz en 4 graden Celsius gedurende 3 cycli. Centrifugeer het homogenaat bij 15.000 G gedurende 30 minuten bij 4 graden Celsius en breng de supernatanten over naar de nieuwe buizen. Om het muggenresten volledig te verwijderen, centrifugeert u het supernatant opnieuw bij 15.000 G gedurende 10 minuten bij 4 graden Celsius.Aliquot de 200 microliter supernatant P0 in een opslagbuis met schroefdop van twee milliliter en bewaar deze bij min 80 graden Celsius. Gebruik voor de virusversterking Aedes albopictus RNAi-deficiënte muggencellijn C6/36 en een gewervelde cellijn, babyhamsternier of BHK-21 uit een vierkante kolf van 75 centimeter en zaai ze afzonderlijk in 24 putplaten. Leg de gezaaide 24 putplaat een nacht op 28 of 37 graden Celsius.Observeer de volgende dag de cellen onder de microscoop om 80 tot 90% samenvloeiing in elke put te bevestigen. Bereid 500 milliliter van het celkweekonderhoudsmedium aangevuld met antibiotica. Verwijder het celkweekmedium uit de 24 putplaten en voeg 100 microliter van het celkweekonderhoudsmedium toe aan elke put.Ent vervolgens de cellen met 100 microliter van het supernatant van het muggenhomogenaat of P0. Incubeer de platen op 28 of 37 graden Celsius gedurende 60 minuten en schud de platen voorzichtig na elke 15 minuten om het drogen van de cellen te voorkomen. Als u klaar bent, verwijdert u het supernatant en spoelt u elke put af met 600 microliter celkweekonderhoudsmedium om het vuil volledig te verwijderen. Voeg vervolgens 800 microliter celkweekonderhoudsmedium toe aan elke put voordat u de platen gedurende 7 dagen in een 5% koolstofdioxide bevochtigde incubator bij 28 of 37 graden Celsius plaatst.Controleer dagelijks de toestand van de cellen van elke put onder de microscoop. Verzamel op de zevende dag het supernatant van cellen die bekend staat als P1 en bewaar het bij min 80 graden Celsius. Herhaal de procedure om P2- en P3-virale supernatanten te verzamelen.Door het cytopathogene effect, of CPE, sterven cellen uit sommige van de putten en maken ze los van het oppervlak. Om de virussen sterk te versterken, verzamel 300 tot 400 microliter van het supernatant uit putten met het CPE-effect en breng het over naar een nieuwe zesputplaat met 80 tot 90% celconfluentie van kweekcellen. Verzamel en breng ten slotte 500 microliter van het supernatant over van de putten van de zesputplaat naar opslagbuizen met schroefdop van twee milliliter voordat u ze opslaat bij min 80 graden Celsius.De inenting van C6/36-cellen met de muggenhomogenaten P0 vertoonde een brede intercellulaire ruimte in geëxfolieerde cellen 120 uur na de infectieperiode in vergelijking met de niet-geënte of controlecellen. Incubatie van BHK21-cellen met de P3-virale supernatanten toonde een zichtbare CPE 48 uur na infectie, met de dood van de cel en loslating van het oppervlak in tegenstelling tot de controlecellen. In de handel verkrijgbare universele primers of Flavivirussen, Alphavirussen en Bunyavirussen werden gebruikt om de PCR-producten voor het virale supernatant te genereren.Een PCR-product voor het Bunyavirus, Ebinur Lake-virus, werd ingesteld als een positieve controle. De PCR-versterkingsverboden in banen van Bunyavirussen en de positieve controle benadrukten de mogelijkheid van de aanwezigheid van Bunyavirus in de supernatanten. Om het slagingspercentage van virusisolatie te verbeteren, moet u een lage temperatuur aanhouden tijdens monstertransport, isolatie en malen.Voeg antibiotica toe bij het homogeniseren van de muggen en de cultuur zelf. En behandel de cultuur snel tijdens de incubatie en het verwijderen van het kweekmedium. Naast deze procedure kan de maaloplossing worden geïnjecteerd in een fietsende rat of kippenembryo.De bevestigingsprocedure zal echter ethische bezwaren oproepen en de kosten van het experiment verhogen.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Ontleding van Midgut en speekselklieren van de Ae. aegypti Muggen

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolatie van Genomic DNA van muis Tails

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondriale Isolatie van skeletspieren

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolatie van immuuncellen van primaire tumoren

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolatie van Myofibroblasten van muis en mens slokdarm

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Een Multi-detectie test voor Malaria Zenden Muggen

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protocollen voor het testen van de toxiciteit van roman insecticide chemicaliën aan muggen

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van Vector bevoegdheid van muggen

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca2+ transiënten en L-type calciumstroom

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...