Name: mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes
Uploaded: 2022-08-31T13:20:00
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Diese Arbeit wurde durch das Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501) unterstützt.

1. Mückenprobenahme und -sortierung
<ol><li>Fangen Sie die erwachsenen Mücken durch die Lichtfallen MXA-02 oder Kohlendioxid-Mückenfallen im Feld ein.</li>
	<li>Töten Sie die gesammelten Mücken, indem Sie sie in flüssigen Stickstoff tauchen10,11. Transportieren Sie sie mit dem Kühlketten-Logistiksystem12 ins Labor. HINWEIS: Trockeneis wurde hauptsächlich in der Kühlkettenlogistik verwendet.</li>
	<li>(Optiona...

<ol>
	<li>Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-associated+viruses+in+China.">Mosquito-associated viruses in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+distribution+and+diversity+of+mosquito-associated+viruses+and+their+mosquito+vectors+in+China.">A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China.</a> Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+global+distribution+of+novel+mosquito-associated+viruses+in+the+last+decade+(2007-2017).">The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017).</a> Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+metagenomic+profiling+of+viromes+associated+with+four+common+mosquito+species+in+China.">Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).</li><li>Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+viruses+and+non-human+vertebrates+in+Australia:+A+review.">Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review.</a> Viruses. 13 (2), 265 (2021).</li><li>Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+viruses-transmission+and+interaction.">Mosquito-specific viruses-transmission and interaction.</a> Viruses. 11 (9), 873 (2019).</li><li>Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+and+mosquito-borne+viruses:+evolution,+infection,+and+host+defense.">Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense.</a> Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).</li><li>Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+dynamics+of+an+insect-specific+flavivirus+in+a+naturally+infected+Culex+pipiens+laboratory+colony+and+effects+of+co-infection+on+vector+competence+for+West+Nile+virus.">Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus.</a> Virology. 427 (2), 90-97 (2012).</li><li>Baidaliuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-fusing+agent+virus+reduces+arbovirus+dissemination+in+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+vivo.">Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo.</a> Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+virome+analysis+of+Culex+mosquitoes+from+Kenya+and+China.">Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China.</a> Viruses. 10 (1), 30 (2018).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+isolation+and+characterization+of+a+group+C+Banna+virus+(BAV)+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Hubei,+China.">First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China.</a> Viruses. 10 (10), 555 (2018).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+the+virome+in+lab-+and+field-collected+Aedes+albopictus+mosquitoes+across+different+developmental+stages+and+possible+core+viruses+in+the+publicly+available+virome+data+of+Aedes+mosquitoes.">Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes.</a> mSystems. 5 (5), 00640 (2020).</li><li>Zhou, M., Chu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+main+mosquito+species+in+China+based+on+DNA+barcoding.">Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding.</a> Plos One. 7 (10), (2012).</li><li>Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bold:+The+Barcode+of+Life+Data+System+(www.barcodinglife.org).">Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org).</a> Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+new+strain+of+mosquito+Flavivirus+derived+from+Culicoides.">In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides.</a> Viruses. 14 (6), 1298 (2022).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+Tanay+virus+isolated+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Yunnan,+China.">Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).</li><li>Ren, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+reassortment+Tibet+orbivirus+isolated+from+Culicoides+spp.+in+Yunnan,+PR+China.">Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China.</a> Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).</li></ol>

Ziel dieser Methode war es, eine praktikable Möglichkeit zu bieten, Mücken-assoziierte Viren mit Hilfe verschiedener Zelllinien zu isolieren. Es ist wichtig, das Antibiotikum-Antimykotikum (Penicillin-Streptomycin-Amphotericin) zu den Überständen der Mückenhomogenate hinzuzufügen, um eine Kontamination durch Bakterien oder Pilze zu vermeiden. Stechmücken und virale Überstände, die im Feld gewonnen werden, müssen bei -80 °C gekühlt werden, um wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.
<p class="jove_conten...

Stechmücken sind eine Gruppe wichtiger pathogener Arthropoden-Vektoren. Es gibt ungefähr 3.500 Arten von Stechmücken in der Familie Culicidae 1,2. Die Entwicklung von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien hat zur Entdeckung vieler neuartiger, virusähnlicher Sequenzen in Stechmücken aus verschiedenen Teilen der Welt geführt3. Im Allgemeinen können diese Mücken-assoziierten Viren in zwei Hauptgruppen eingeteilt werden: MBVs und MSVs.
MBVs sind eine Gruppe verschiedener Viren, die Erreger vieler menschlicher oder tierischer Krankheiten sind, wie z. B. das Gelbfiebervirus (YFV), das Dengue-Virus (DENV), das Japanische Enzephalitisvirus (JEV), das West-Nil-Virus (WNV) und das Rift-Valley-Fiebervirus (RVFV)4. Sie haben die öffentliche Gesundheit ernsthaft bedroht, indem sie schwere Morbidität und Mortalität bei Menschen und Tieren auf der ganzen Welt verursacht haben. MBVs halten auf natürliche Weise einen Lebenszyklus zwischen verschiedenen Wirten aufrecht, indem sie von einer infizierten Mücke auf einen naiven Wirt sowie von einem virusinfizierten Wirt und auf eine fressende Mücke übertragenwerden 5. Daher können diese Viren sowohl Mückenzelllinien als auch Wirbeltierzelllinien im Labor infizieren1.
MSVs, zu denen das Yichang-Virus (YCN), das Culex-Flaviviren (CxFV) und das Chaoyang-Virus (CHAOV) gehören, sind eine Untergruppe insektenspezifischer Viren 1,6,7. In den letzten Jahren hat die Entdeckung neuartiger MSVs zugenommen, und es wurde festgestellt, dass einige dieser MSVs einen Einfluss auf die Übertragung von MBVs haben. Zum Beispiel könnte CxFV, eine persistierende Infektion bei Culex pipiens, die WNV-Replikation in einem frühen Stadium unterdrücken8. Ein weiteres insektenspezifisches Flavivirus, das Cell-Fusing Agent Virus (CFAV), hemmt die Ausbreitung des DENV- und Zika-Virus (ZIKV) in Aedes aegypti-Mücken 9. Daher ist dieses Protokoll ein nützlicher Ansatz zur Isolierung von Mücken-assoziierten Viren und kann bei der weiteren Erforschung der Verbreitung von Krankheitserregern, die mit Stechmücken verwandt sind, und der Kontrolle von durch Stechmücken übertragenen Krankheiten helfen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3524</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 flasks</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Instrument for centrifugation of mosquito samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s minimal essential medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>medium for vertebrate cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feta Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141C</td>
			<td> 
			 
			Provide nutrition for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-speed low-temperature tissue homogenizer</td>
			<td>servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (28 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15410-122</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute&#160; medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td>medium for mosiquto cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL)</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile pestles</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y004</td>
			<td>Consumables&#160; for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y30</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the light traps MXA-02</td>
			<td>Maxttrac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The QIAamp viral RNA mini kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes

Mit der breiten Anwendung von Sequenzierungstechnologien wurden viele neue virusähnliche Sequenzen in Arthropoden, einschließlich Mücken, entdeckt. Die beiden Hauptkategorien dieser neuen Mücken-assoziierten Viren sind "durch Stechmücken übertragene Viren (MBVs)" und "Mückenspezifische Viren (MSVs)". Diese neuartigen Viren könnten sowohl für Wirbeltiere als auch für Mücken pathogen sein, oder sie könnten einfach eine Symbiose mit Mücken eingehen. Entitätsviren sind unerlässlich, um die biologischen Eigenschaften dieser Viren zu bestätigen. Daher wurde hier ein detailliertes Protokoll zur Virusisolierung und -vermehrung von im Feld gesammelten Stechmücken beschrieben. Zunächst wurden die Mückenproben als Überstände von Mückenhomogenaten präpariert. Nach zweimaliger Zentrifugation wurden die Überstände entweder in die Mückenzelllinie C6/36 oder in die Wirbeltierzelllinie BHK-21 zur Virusamplifikation inokuliert. Nach 7 Tagen wurden die Überstände als P1-Überstände gesammelt und bei -80 °C gelagert. Als nächstes wurden P1-Überstände noch zweimal in C6/36- oder BHK-21-Zellen passageiert, während der Zellstatus täglich überprüft wurde. Als die zytopathogene Wirkung (CPE) auf die Zellen entdeckt wurde, wurden diese Überstände gesammelt und zur Identifizierung von Viren verwendet. Dieses Protokoll dient als Grundlage für zukünftige Forschungen zu Mücken-assoziierten Viren, einschließlich MBVs und MSVs.

Nach der Inokulation mit den Überständen der Mückenhomogenate (P0) wiesen die C6/36-Zellen einen großen interzellulären Raum auf, und exfoliierte Zellen wurden nach 120 h beobachtet (Abbildung 1A) im Vergleich zu den nicht inokulierten Zellen (Kontrolle) zur gleichen Zeit (Abbildung 1B). Nach Inkubation der BHK-21-Zellen mit den P3-Überständen wurde in den BHK-21-Zellen nach 48 h sichtbares CPE beobachtet (Abbildung 1C) im Ge...

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Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

Zahlreiche neuartige virusähnliche Sequenzen wurden aufgrund des umfangreichen Einsatzes von Sequenzierungstechnologien in Stechmücken gefunden. Wir stellen ein effektives Verfahren zur Isolierung und Amplifikation von Viren unter Verwendung von Wirbeltier- und Mückenzelllinien zur Verfügung, das als Grundlage für zukünftige Studien zu Stechmücken-assoziierten Viren, einschließlich mückenübertragener und mückenspezifischer Viren, dienen könnte.

Mückenassoziierte Virusisolierung aus im Feld gesammelten Stechmücken

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

Dieses Protokoll ist ein nützlicher Ansatz zur Isolierung von Mücken-assoziierten Viren und kann bei der weiteren Erforschung der Verbreitung von Krankheitserregern im Zusammenhang mit Stechmücken und der Kontrolle von durch Stechmücken übertragenen Krankheiten helfen. Die Verwendung dünner Linien zur Isolierung von Viren im Labor der Biosicherheitsstufe 2 ist sicherer und effizienter. Im Gegensatz zu anderen Verfahren zur Virusisolierung, wie z. B. der zyklischen Rotimpfung mit unterschiedlicher Flüssigkeit, sind bei dieser Technik keine Tierversuche oder ethische Bewertungen erforderlich.Die Kontamination durch die Proben und die Entnahme der Zellen während der Inkubation kann zum Scheitern des Experiments führen. Daher ist es notwendig, dem Medium 2% Penicillin-Streptomycin-Amphotericin zuzusetzen, um eine Kontamination zu vermeiden. Beginnen Sie mit der Zugabe von drei Millimeter dicken Keramikkügelchen, 1,5 Milliliter RPMI-Medium, ergänzt mit 2%Penicillin-Streptomycin-Amphotericin-B-Lösung in einem sterilen Zwei-Milliliter-Röhrchen, das auf Eis gelegt wird, und übertragen Sie dann 50 Mücken darin.Als nächstes homogenisieren Sie die Mücken mit einem Niedertemperatur-Gewebehomogenisator, indem Sie 30 Sekunden lang bei 70 Hertz und 4 Grad Celsius für 3 Zyklen mahlen. Zentrifugieren Sie das Homogenat bei 15.000 G für 30 Minuten bei 4 Grad Celsius und übertragen Sie die Überstände in die neuen Röhrchen. Um die Mückenreste vollständig zu entfernen, zentrifugieren Sie den Überstand erneut bei 15.000 G für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius.Aliquotieren Sie die 200 Mikroliter Überstand P0 in ein zwei Milliliter fassendes Schraubverschluss-Vorratsröhrchen und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius. Verwenden Sie für die Virusamplifikation die Aedes albopictus RNAi-defiziente Mückenzelllinie C6/36 und eine Wirbeltierzelllinie, eine Babyhamsterniere oder BHK-21 aus einem 75-Zentimeter-Quadratkolben und säen Sie sie separat in 24-Well-Platten. Stellen Sie die entkernte 24-Well-Platte über Nacht bei 28 oder 37 Grad Celsius auf.Beobachten Sie die Zellen am nächsten Tag unter dem Mikroskop, um eine Konfluenz von 80 bis 90 % in jeder Vertiefung zu bestätigen. Bereiten Sie 500 Milliliter des mit Antibiotika ergänzten Zellkultur-Erhaltungsmediums vor. Entfernen Sie das Zellkulturmedium aus den 24-Well-Platten und geben Sie 100 Mikroliter des Zellkultur-Pflegemediums in jede Well.Anschließend beimpfen Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern des Überstandes des Mückenhomogenats oder P0. Inkubieren Sie die Platten 60 Minuten lang bei 28 oder 37 Grad Celsius und schütteln Sie die Platten alle 15 Minuten vorsichtig, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie den Überstand und spülen Sie jede Vertiefung mit 600 Mikrolitern Zellkultur-Pflegemedium, um den Schmutz vollständig zu entfernen. Als nächstes geben Sie 800 Mikroliter Zellkultur-Pflegemedium in jede Vertiefung, bevor Sie die Platten 7 Tage lang in einen befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 28 oder 37 Grad Celsius stellen.Überwachen Sie täglich den Zustand der Zellen jedes Brunnens unter dem Mikroskop. Sammeln Sie am siebten Tag den Überstand der Zellen, die als P1 bekannt sind, und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius. Wiederholen Sie den Vorgang, um virale P2- und P3-Überstände zu sammeln.Aufgrund der zytopathogenen Wirkung (CPE) sterben Zellen aus einigen der Vertiefungen ab und lösen sich von der Oberfläche. Um die Viren stark zu vermehren: Sammeln Sie 300 bis 400 Mikroliter des Überstands aus Vertiefungen, die den CPE-Effekt zeigen, und übertragen Sie ihn auf eine neue Sechs-Well-Platte mit einer Zellkonfluenz von 80 bis 90 % der Kulturzellen. Zum Schluss werden 500 Mikroliter des Überstands aus den Vertiefungen der Sechs-Well-Platte gesammelt und in Zwei-Milliliter-Schraubdeckel-Speicherröhrchen umgefüllt, bevor sie bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.Die Inokulation von C6/36-Zellen mit den Mückenhomogenaten P0 zeigte 120 Stunden nach der Infektion einen großen interzellulären Raum in exfoliierten Zellen im Vergleich zu den nicht inokulierten oder Kontrollzellen. Die Inkubation von BHK21-Zellen mit den P3-Virusüberständen zeigte 48 Stunden nach der Infektion ein sichtbares CPE, das im Gegensatz zu den Kontrollzellen das Absterben der Zelle und die Ablösung von der Oberfläche zeigte. Zur Herstellung der PCR-Produkte für den viralen Überstand wurden kommerziell erhältliche Universalprimer oder Flaviviren, Alphaviren und Bunyaviren verwendet.Ein PCR-Produkt für das Bunyavirus, das Ebinur-Lake-Virus, wurde als Positivkontrolle festgelegt. Die PCR-Amplifikationsverbote in den Bahnen von Bunyaviren und die Positivkontrolle unterstrichen die Möglichkeit des Vorhandenseins von Bunyavirus in den Überständen. Um die Erfolgsrate der Virusisolierung zu verbessern, halten Sie die Temperatur während des Probentransports, der Isolierung und des Mahlens niedrig.Fügen Sie Antibiotika hinzu, wenn Sie die Mücken und die Kultur selbst homogenisieren. Und handhaben Sie die Kultur schnell während der Inkubation und der Entnahme des Nährmediums. Zusätzlich zu diesem Verfahren kann die Mahllösung in einen zyklischen Ratten- oder Hühnerembryo injiziert werden.Das Bestätigungsverfahren wird jedoch ethische Bedenken aufwerfen und die Kosten des Experiments erhöhen.

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Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

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