Name: mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes
Uploaded: 2022-08-31T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט תוכנית המדע והטכנולוגיה של ווהאן (2018201261638501).

1. דיגום ומיון יתושים
<ol><li>לכדו את היתושים הבוגרים דרך מלכודות האור MXA-02 או מלכודות יתושים פחמן דו חמצני בשטח.</li>
	<li>הרגו את היתושים שנאספו על ידי טבילה בחנקן נוזלי10,11. העברתם למעבדה על ידי המערכת הלוגיסטית של שרשרת הקירור12. הערה: קרח י?...

<ol>
	<li>Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-associated+viruses+in+China.">Mosquito-associated viruses in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+distribution+and+diversity+of+mosquito-associated+viruses+and+their+mosquito+vectors+in+China.">A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China.</a> Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+global+distribution+of+novel+mosquito-associated+viruses+in+the+last+decade+(2007-2017).">The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017).</a> Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+metagenomic+profiling+of+viromes+associated+with+four+common+mosquito+species+in+China.">Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).</li><li>Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+viruses+and+non-human+vertebrates+in+Australia:+A+review.">Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review.</a> Viruses. 13 (2), 265 (2021).</li><li>Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+viruses-transmission+and+interaction.">Mosquito-specific viruses-transmission and interaction.</a> Viruses. 11 (9), 873 (2019).</li><li>Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+and+mosquito-borne+viruses:+evolution,+infection,+and+host+defense.">Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense.</a> Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).</li><li>Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+dynamics+of+an+insect-specific+flavivirus+in+a+naturally+infected+Culex+pipiens+laboratory+colony+and+effects+of+co-infection+on+vector+competence+for+West+Nile+virus.">Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus.</a> Virology. 427 (2), 90-97 (2012).</li><li>Baidaliuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-fusing+agent+virus+reduces+arbovirus+dissemination+in+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+vivo.">Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo.</a> Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+virome+analysis+of+Culex+mosquitoes+from+Kenya+and+China.">Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China.</a> Viruses. 10 (1), 30 (2018).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+isolation+and+characterization+of+a+group+C+Banna+virus+(BAV)+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Hubei,+China.">First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China.</a> Viruses. 10 (10), 555 (2018).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+the+virome+in+lab-+and+field-collected+Aedes+albopictus+mosquitoes+across+different+developmental+stages+and+possible+core+viruses+in+the+publicly+available+virome+data+of+Aedes+mosquitoes.">Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes.</a> mSystems. 5 (5), 00640 (2020).</li><li>Zhou, M., Chu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+main+mosquito+species+in+China+based+on+DNA+barcoding.">Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding.</a> Plos One. 7 (10), (2012).</li><li>Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bold:+The+Barcode+of+Life+Data+System+(www.barcodinglife.org).">Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org).</a> Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+new+strain+of+mosquito+Flavivirus+derived+from+Culicoides.">In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides.</a> Viruses. 14 (6), 1298 (2022).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+Tanay+virus+isolated+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Yunnan,+China.">Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).</li><li>Ren, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+reassortment+Tibet+orbivirus+isolated+from+Culicoides+spp.+in+Yunnan,+PR+China.">Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China.</a> Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).</li></ol>

מטרת שיטה זו הייתה להציע דרך מעשית לבידוד נגיפים הקשורים ליתושים באמצעות קווי תאים שונים. חיוני להוסיף את האנטיביוטי-אנטי-מיקוטי (פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין) לסופרנאטנטים של ההומוגנטים של היתושים כדי למנוע זיהום על ידי חיידקים או פטריות. יתושים וסופרנאטנטים נגיפיים המתקבלים בשדה ח...

יתושים הם קבוצה של וקטורים פתוגניים חשובים של פרוקי רגליים. ישנם כ -3,500 מינים של יתושים במשפחה Culicidae 1,2. פיתוח טכנולוגיות ריצוף בתפוקה גבוהה הוביל לגילוי רצפים חדשים דמויי וירוסים רבים ביתושים ממקומות שונים בעולם3. באופן כללי, ניתן לסווג את הנגיפים הקשורים ליתושים אלה לשתי קבוצות עיקריות: MBVs ו- MSVs.
MBVs הם קבוצה של וירוסים מגוונים שהם גורמים סיבתיים למחלות רבות של בני אדם או בעלי חיים, כגון וירוס קדחת צהובה (YFV), נגיף דנגי (DENV), וירוס דלקת המוח היפנית (JEV), וירוס הנילוס המערבי (WNV) ונגיף קדחת עמק השבר הסורי אפריקאי (RVFV)4. הם איימו באופן חמור על בריאות הציבור בכך שגרמו לתחלואה ותמותה קשות הן בבני אדם והן בבעלי חיים ברחבי העולם. MBVs מקיימים באופן טבעי מחזור חיים בין פונדקאים מגוונים באמצעות העברה מיתוש נגוע לפונדקאי תמים, כמו גם מפונדקאי נגוע בנגיף ויתוש האכלה5. לכן, נגיפים אלה יכולים להדביק הן שורות תאי יתושים והן שורות תאים של בעלי חוליות במעבדה1.
MSVs, הכוללים וירוס Yichang (YCN), Culex flavivirus (CxFV) ווירוס Chaoyang (CHAOV), הם תת-קבוצה של וירוסים ספציפיים לחרקים 1,6,7. בשנים האחרונות, חלה עלייה בגילוי של MSV חדשים, וחלק MSV אלה נמצאו כבעלי השפעה על העברת MBVs. לדוגמה, CxFV, אשר יכול להיות זיהום מתמשך ב Culex pipiens, יכול לדכא שכפול WNV בשלב מוקדם8. נגיף פלבי ספציפי נוסף לחרקים, נגיף סוכן איחוי תאים (CFAV), נמצא כמעכב את התפשטות נגיף DENV וזיקה (ZIKV) ביתושים Aedes aegypti 9. לפיכך, פרוטוקול זה הוא גישה שימושית לבידוד וירוסים הקשורים ליתושים ויכול לסייע במחקר נוסף על התפלגות פתוגנים הקשורים ליתושים ושליטה במחלות המועברות על ידי יתושים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3524</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 flasks</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Instrument for centrifugation of mosquito samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s minimal essential medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>medium for vertebrate cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feta Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141C</td>
			<td> 
			 
			Provide nutrition for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-speed low-temperature tissue homogenizer</td>
			<td>servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (28 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15410-122</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute&#160; medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td>medium for mosiquto cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL)</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile pestles</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y004</td>
			<td>Consumables&#160; for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y30</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the light traps MXA-02</td>
			<td>Maxttrac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The QIAamp viral RNA mini kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes

עם היישום הרחב של טכנולוגיות ריצוף, רצפים חדשים רבים דמויי וירוסים התגלו בפרוקי רגליים, כולל יתושים. שתי הקטגוריות העיקריות של וירוסים חדשים אלה הקשורים ליתושים הם "וירוסים המועברים על ידי יתושים (MBVs)" ו"וירוסים ספציפיים ליתושים (MSVs)". נגיפים חדשים אלה עשויים להיות פתוגניים הן לבעלי חוליות והן ליתושים, או שהם יכולים פשוט להיות סימביוטיים עם יתושים. וירוסי ישויות חיוניים כדי לאשר את המאפיינים הביולוגיים של וירוסים אלה. לפיכך, תואר כאן פרוטוקול מפורט לבידוד והגברה של וירוסים מיתושים שנאספו בשטח. ראשית, דגימות היתושים הוכנו כסופרנאטים של הומוגנאטים של יתושים. לאחר צנטריפוגה פעמיים, הסופרנאטנטים חוסנו לקו תאי יתוש C6/36 או לקו תאי חוליות BHK-21 להגברת הנגיף. לאחר 7 ימים, הסופרנאטנטים נאספו כסופרנאטנטים P1 ואוחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, סופרנאטנטים P1 הועברו פעמיים נוספות בתאי C6/36 או BHK-21 בזמן שמצב התא נבדק מדי יום. כאשר התגלתה ההשפעה הציטופתוגנית (CPE) על התאים, סופרנאטנטים אלה נאספו ושימשו לזיהוי נגיפים. פרוטוקול זה משמש כבסיס למחקר עתידי על וירוסים הקשורים ליתושים, כולל MBV ו- MSVs.

לאחר שחוסנו עם הסופרנאטנטים של ההומוגנטים של היתושים (P0), תאי C6/36 הציגו מרחב בין-תאי רחב, ותאי פילינג נצפו בשעה 120 שעות (איור 1A) בהשוואה לתאים הלא מחוסנים (קבוצת ביקורת) באותו זמן (איור 1B). לאחר הדגירה על תאי BHK-21 עם סופרנאטנטים P3, CPE נראה בתאי BHK-21 לאחר 48 שעות (איור ...

Watch this Scientific Journal Video about Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes at JoVE.com

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

רצפים חדשים רבים דמויי וירוסים נמצאו ביתושים בשל השימוש הנרחב בטכנולוגיות ריצוף. אנו מספקים הליך יעיל לבידוד והגברה של וירוסים באמצעות קווי תאים של בעלי חוליות ויתושים, אשר עשוי לשמש בסיס למחקרים עתידיים על וירוסים הקשורים ליתושים, כולל וירוסים המועברים על ידי יתושים וספציפיים ליתושים.

בידוד וירוסים הקשורים ליתושים מיתושים שנאספו בשטח

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

פרוטוקול זה הוא גישה שימושית לבידוד וירוסים הקשורים ליתושים ויכול לסייע במחקר נוסף על התפלגות פתוגנים הקשורים ליתושים והדברת מחלות המועברות על ידי יתושים. שימוש בקווים דקים לבידוד וירוסים במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 הוא בטוח ויעיל יותר. שלא כמו הליכי בידוד וירוסים אחרים, כגון מחזור חיסון אדום עם נוזלים משתנים, טכניקה זו אינה מחייבת ניסויים בבעלי חיים או הערכה אתית.הזיהום מהדגימות והתאים הנשאבים במהלך הדגירה יכול להוביל לכישלון הניסוי. לפיכך, יש צורך להוסיף 2% פניצילין-סטרפטומיצין-Amphotericin לתוך המדיום כדי למנוע זיהום. התחל עם תוספת של חרוזים קרמיים שלושה מ"מ, 1.5 מיליליטר של מדיום RPMI בתוספת 2% פניצילין-סטרפטומיצין-Amphotericin B פתרון בצינור סטרילי שני מיליליטר מונח על קרח ולאחר מכן להעביר 50 יתושים בו.לאחר מכן, הומוגניזציה של יתושים עם הומוגנייזר רקמות בטמפרטורה נמוכה על ידי טחינה במשך 30 שניות ב 70 הרץ ו 4 מעלות צלזיוס במשך 3 מחזורים. צנטריפוגה הומוגנאט ב 15, 000 גרם במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהעביר את supernatants לצינורות החדשים. כדי להסיר את פסולת היתושים לחלוטין, צנטריפוגה את supernatant שוב ב 15, 000 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.יש להכניס את 200 המיקרוליטרים של Supernatant P0 לצינור אחסון של פקק בורג של שני מיליליטר, ולאחסן אותו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. להגברת הנגיף, השתמשו בקו תאי יתוש חסר Aedes albopictus RNAi C6/36 וקו תאי חולייתנים, כליה של אוגר תינוק, או BHK-21 מבקבוק מרובע של 75 סנטימטרים וזרעו אותם ב-24 צלחות באר בנפרד. מניחים את צלחת 24 הזרעים היטב לילה ב 28 או 37 מעלות צלזיוס.למחרת, התבוננו בתאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר מפגש של 80% עד 90% בכל באר. הכינו 500 מיליליטר של מדיום תחזוקת תרבית התא בתוספת אנטיביוטיקה. מוציאים את מדיום תרבית התאים מ-24 צלחות הבאר ומוסיפים 100 מיקרוליטר של מדיום תחזוקת תרבית התאים לכל באר.לאחר מכן לחסן את התאים עם 100 מיקרוליטר של supernatant של יתוש homogenate או P0. לדגור על הצלחות ב 28 או 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות ולנער בעדינות את הצלחות לאחר כל 15 דקות כדי למנוע את התייבשות התאים. לאחר שתסיים, הסר את הסופרנאטנט ושטוף כל באר עם 600 מיקרוליטר של אמצעי תחזוקה של תרבית תאים כדי להסיר את הפסולת לחלוטין. לאחר מכן, הוסיפו 800 מיקרוליטר של מדיום תחזוקת תרבית תאים לכל באר לפני שתניחו את הלוחות באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 28 או 37 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים.מדי יום לפקח על מצב התאים של כל באר מתחת למיקרוסקופ. ביום השביעי, אספו את הסופרנאטנט של התאים המכונה P1 ואחסנו אותו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. חזור על התהליך כדי לאסוף סופרנאטנטים נגיפיים P2 ו- P3.בשל ההשפעה הציטופתוגנית, או CPE, תאים מחלק מהבארות מתים ומתנתקים מפני השטח. כדי להגביר מאוד את הנגיפים, אספו 300 עד 400 מיקרוליטר של הסופרנאטנט מבארות המראות את אפקט ה-CPE והעבירו אותו לצלחת חדשה בעלת שש בארות בעלת מפגש תאים של 80% עד 90% תאי תרבית. לבסוף, אספו והעבירו 500 מיקרוליטר של הסופרנאטנט מהבארות של צלחת שש הקידוחים לצינורות אחסון של פקק בורג שני מיליליטר לפני אחסונם במינוס 80 מעלות צלזיוס.החיסון של תאי C6/36 עם יתוש homogenates P0 הציג חלל בין-תאי רחב בתאים exfoliated בתקופה של 120 שעות לאחר ההדבקה בהשוואה לתאים לא מחוסנים או ביקורת. דגירה של תאי BHK21 עם סופרנאטנטים נגיפיים P3 הדגימה CPE נראה לעין 48 שעות לאחר ההדבקה, והציגה את מות התא וניתוק מפני השטח בניגוד לתאי הביקורת. פריימרים אוניברסליים זמינים מסחרית או Flaviviruses, Alphaviruses ו Bunyaviruses שימשו כדי ליצור את מוצרי PCR עבור supernatant ויראלי.מוצר PCR עבור וירוס Bunyavirus, וירוס אגם אבינור, הוגדר כבקרה חיובית. איסורי הגברת ה-PCR בנתיבים השייכים ל-Bunyaviruses והשליטה החיובית הדגישו את האפשרות של נוכחות Bunyavirus בסופרנאטנטים. כדי לשפר את שיעור ההצלחה של בידוד הנגיף, יש לשמור על טמפרטורה נמוכה במהלך הובלת דגימות, בידוד וטחינה.מוסיפים אנטיביוטיקה כאשר הומוגניזציה של היתושים והתרבות עצמה. ולטפל בתרבות במהירות במהלך הדגירה והסרת מדיום התרבות. בנוסף להליך זה, ניתן להזריק את תמיסת הטחינה לחולדה מחזורית או לעובר תרנגולת.עם זאת, הליך האישור יעלה חששות אתיים ויגדיל את הוצאות הניסוי.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Dissection של בלוטות הרוק midgut ו מ AE. aegypti יתושים

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

בידוד של הדנ&quot;א הגנומי של זנבות עכבר

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

בידוד של תאים חיסוניים של גידולים ראשוניים

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

בידוד של myofibroblasts מעכבר והוושט אדם

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Assay Multi-זיהוי ליתושי מלריה העברה

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

פרוטוקולים לבדיקת הרעילות של הרומן בדיקות, חרקים הביוכימיה על היתושים

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

הכריחו ריור כשיטה לנתח מיומנות וקטור של יתושים

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...