Name: mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes
Uploaded: 2022-08-31T13:20:00
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इस काम को वुहान विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना परियोजना (2018201261638501) द्वारा समर्थित किया गया था।

1. मच्छर ों का नमूना लेना और छंटाई
<ol><li>खेत में एमएक्सए -02 या कार्बन डाइऑक्साइड मच्छर जाल के प्रकाश जाल के माध्यम से वयस्क मच्छरों को फंसाएं।</li>
	<li>तरल नाइट्रोजन10,11 में डुबोकर एक?...

<ol>
	<li>Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-associated+viruses+in+China.">Mosquito-associated viruses in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+distribution+and+diversity+of+mosquito-associated+viruses+and+their+mosquito+vectors+in+China.">A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China.</a> Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+global+distribution+of+novel+mosquito-associated+viruses+in+the+last+decade+(2007-2017).">The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017).</a> Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+metagenomic+profiling+of+viromes+associated+with+four+common+mosquito+species+in+China.">Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).</li><li>Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+viruses+and+non-human+vertebrates+in+Australia:+A+review.">Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review.</a> Viruses. 13 (2), 265 (2021).</li><li>Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+viruses-transmission+and+interaction.">Mosquito-specific viruses-transmission and interaction.</a> Viruses. 11 (9), 873 (2019).</li><li>Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+and+mosquito-borne+viruses:+evolution,+infection,+and+host+defense.">Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense.</a> Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).</li><li>Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+dynamics+of+an+insect-specific+flavivirus+in+a+naturally+infected+Culex+pipiens+laboratory+colony+and+effects+of+co-infection+on+vector+competence+for+West+Nile+virus.">Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus.</a> Virology. 427 (2), 90-97 (2012).</li><li>Baidaliuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-fusing+agent+virus+reduces+arbovirus+dissemination+in+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+vivo.">Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo.</a> Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+virome+analysis+of+Culex+mosquitoes+from+Kenya+and+China.">Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China.</a> Viruses. 10 (1), 30 (2018).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+isolation+and+characterization+of+a+group+C+Banna+virus+(BAV)+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Hubei,+China.">First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China.</a> Viruses. 10 (10), 555 (2018).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+the+virome+in+lab-+and+field-collected+Aedes+albopictus+mosquitoes+across+different+developmental+stages+and+possible+core+viruses+in+the+publicly+available+virome+data+of+Aedes+mosquitoes.">Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes.</a> mSystems. 5 (5), 00640 (2020).</li><li>Zhou, M., Chu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+main+mosquito+species+in+China+based+on+DNA+barcoding.">Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding.</a> Plos One. 7 (10), (2012).</li><li>Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bold:+The+Barcode+of+Life+Data+System+(www.barcodinglife.org).">Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org).</a> Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+new+strain+of+mosquito+Flavivirus+derived+from+Culicoides.">In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides.</a> Viruses. 14 (6), 1298 (2022).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+Tanay+virus+isolated+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Yunnan,+China.">Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).</li><li>Ren, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+reassortment+Tibet+orbivirus+isolated+from+Culicoides+spp.+in+Yunnan,+PR+China.">Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China.</a> Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).</li></ol>

इस विधि का उद्देश्य विभिन्न सेल लाइनों का उपयोग करके मच्छर से जुड़े वायरस को अलग करने के लिए एक व्यावहारिक तरीका प्रदान करना था। बैक्टीरिया या कवक द्वारा संदूषण से बचने के लिए मच्छर होमोजेनेट्स के सुप...

मच्छर महत्वपूर्ण रोगजनक आर्थ्रोपोड वैक्टर का एक समूह है। क्यूलिसाइड 1,2 परिवार में मच्छरों की लगभग 3,500 प्रजातियां हैं। उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के विकासने दुनिया के विभिन्न हिस्सों से मच्छरों में कई नए, वायरस जैसे अनुक्रमों की खोज की है। आम तौर पर, इन मच्छर से जुड़े वायरस को दो मुख्य समूहों में वर्गीकृत किया जा सकता है: एमबीवी और एमएसवी।
एमबीवी विविध वायरस का एक समूह है जो कई मानव या पशु बीमारियों के प्रेरक एजेंट हैं, जैसे कि पीला बुखार वायरस (वाईएफवी), डेंगू वायरस (डीईएनवी), जापानी एन्सेफलाइटिस वायरस (जेईवी), वेस्ट नाइल वायरस (डब्ल्यूएनवी), और रिफ्ट वैली फीवर वायरस (आरवीएफवी)4। उन्होंने दुनिया भर में मनुष्यों और जानवरों दोनों में गंभीर रुग्णता और मृत्यु दर पैदा करके सार्वजनिक स्वास्थ्य को गंभीर रूप से खतरे में डाल दिया है। एमबीवी स्वाभाविक रूप से एक संक्रमित मच्छर से एक भोले मेजबान के साथ-साथ वायरस से संक्रमित मेजबान और एक खिलाने वाले मच्छर 5 तक संचरण के माध्यम से विभिन्न मेजबानों के बीच एक जीवन चक्र बनाए रखतेहैं। इसलिए, ये वायरस प्रयोगशाला1 में मच्छर सेल लाइनों और कशेरुक सेल लाइनों दोनों को संक्रमित कर सकते हैं।
एमएसवी, जिसमें यिचांग वायरस (वाईसीएन), क्यूलेक्स फ्लेविवायरस (सीएक्सएफवी), और चाओयांग वायरस (चाओवी) शामिल हैं, कीट-विशिष्ट वायरस 1,6,7 का एक उपसमूह हैं। हाल के वर्षों में, नए एमएसवी की खोज में वृद्धि हुई है, और इनमें से कुछ एमएसवी को एमबीवी के संचरण पर प्रभाव पाया गया है। उदाहरण के लिए, सीएक्सएफवी, जो क्यूलेक्स पिपियन्स में लगातार संक्रमण हो सकता है, प्रारंभिक चरण8 में डब्ल्यूएनवी प्रतिकृति को दबा सकता है। एक अन्य कीट-विशिष्ट फ्लेविवायरस, सेल-फ्यूजिंग एजेंट वायरस (सीएफएवी), एडीज एजिप्टी मच्छरों में डीईएनवी और जीका वायरस (जेडआईकेवी) के प्रसार को रोकने के लिए पाया गयाहै। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल मच्छर से जुड़े वायरस को अलग करने के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण है और मच्छरों से संबंधित रोगजनकों के वितरण और मच्छर जनित बीमारियों के नियंत्रण में आगे के शोध में मदद कर सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3524</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 flasks</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Instrument for centrifugation of mosquito samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s minimal essential medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>medium for vertebrate cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feta Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141C</td>
			<td> 
			 
			Provide nutrition for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-speed low-temperature tissue homogenizer</td>
			<td>servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (28 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15410-122</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute&#160; medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td>medium for mosiquto cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL)</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile pestles</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y004</td>
			<td>Consumables&#160; for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y30</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the light traps MXA-02</td>
			<td>Maxttrac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The QIAamp viral RNA mini kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes

अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के व्यापक अनुप्रयोग के साथ, मच्छरों सहित आर्थ्रोपोड में कई नया वायरस जैसे अनुक्रमों की खोज की गई है। इन नए मच्छर से जुड़े वायरस की दो मुख्य श्रेणियां "मच्छर-जनित वायरस (एमबीवी)" और "मच्छर-विशिष्ट वायरस (एमएसवी)" हैं। ये नए वायरस कशेरुक और मच्छरों दोनों के लिए रोगजनक हो सकते हैं, या वे मच्छरों के साथ सहजीवी हो सकते हैं। इन वायरस के जैविक पात्रों की पुष्टि करने के लिए इकाई वायरस आवश्यक हैं। इस प्रकार, क्षेत्र-एकत्रित मच्छरों से वायरस अलगाव और प्रवर्धन के लिए यहां एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। सबसे पहले, मच्छर के नमूने मच्छर होमोजेनेट्स के सुपरनैटेंट के रूप में तैयार किए गए थे। दो बार सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सुपरनैटेंट को वायरस प्रवर्धन के लिए या तो मच्छर सेल लाइन सी 6/36 या कशेरुक सेल लाइन बीएचके -21 में टीका लगाया गया था। 7 दिनों के बाद, सतह पर तैरने वालों को पी 1 सुपरनैटेंट के रूप में एकत्र किया गया और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया। इसके बाद, पी 1 सुपरनैटेंट को सी 6/36 या बीएचके -21 कोशिकाओं में दो बार पारित किया गया था, जबकि सेल की स्थिति की दैनिक जांच की जा रही थी। जब कोशिकाओं पर साइटोपैथोजेनिक प्रभाव (सीपीई) की खोज की गई, तो इन सुपरनैटेंट को एकत्र किया गया और वायरस की पहचान करने के लिए उपयोग किया गया। यह प्रोटोकॉल मच्छर से जुड़े वायरस पर भविष्य के शोध के लिए नींव के रूप में कार्य करता है, जिसमें एमबीवी और एमएसवी शामिल हैं।

मच्छर होमोजेनेट्स (पी 0) के सुपरनैटेंट के साथ टीकाकरण के बाद, सी 6/36 कोशिकाओं ने एक विस्तृत अंतरकोशिकीय स्थान का प्रदर्शन किया, और एक्सफोलिएटेड कोशिकाओं को एक ही समय में बिना टीकाकरण वाली कोशिकाओं (नियंत?...

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Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के व्यापक उपयोग के कारण मच्छरों में कई नया वायरस जैसे अनुक्रम पाए गए हैं। हम कशेरुक और मच्छर सेल लाइनों का उपयोग करके वायरस को अलग करने और बढ़ाने के लिए एक प्रभावी प्रक्रिया प्रदान करते हैं, जो मच्छर जनित और मच्छर-विशिष्ट वायरस सहित मच्छर से जुड़े वायरस पर भविष्य के अध्ययन के आधार के रूप में काम कर सकता है।

फील्ड-एकत्रित मच्छरों से मच्छर से जुड़े वायरस अलगाव

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

यह प्रोटोकॉल मच्छर से जुड़े वायरस को अलग करने के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण है और मच्छरों से संबंधित रोगजनकों के वितरण और मच्छर जनित बीमारियों के नियंत्रण में आगे के शोध में मदद कर सकता है। जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रयोगशाला में वायरस को अलग करने के लिए पतली लाइनों का उपयोग करना सुरक्षित और अधिक कुशल है। अन्य वायरस अलगाव प्रक्रियाओं के विपरीत, जैसे कि अलग-अलग तरल पदार्थ के साथ लाल टीकाकरण चलाना, इस तकनीक को पशु प्रयोग या नैतिक मूल्यांकन की आवश्यकता नहीं है।इनक्यूबेशन के दौरान नमूने और खींचने वाली कोशिकाओं से संदूषण प्रयोग की विफलता का कारण बन सकता है। इसलिए, संदूषण को रोकने के लिए माध्यम में 2% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-एम्फोटेरिसिन जोड़ना आवश्यक है। बर्फ पर रखी दो-मिलीलीटर बाँझ ट्यूब में 2% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-एम्फोटेरिसिन बी समाधान के साथ पूरक तीन मिलीमीटर सिरेमिक मोती, 1.5 मिलीलीटर आरपीएमआई माध्यम को जोड़ने के साथ शुरू करें और फिर इसमें 50 मच्छरों को स्थानांतरित करें।इसके बाद, मच्छरों को कम तापमान वाले ऊतक होमोजिनाइज़र के साथ 70 हर्ट्ज पर 30 सेकंड और 3 चक्रों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीसकर समरूप करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 15,000 जी पर होमोजेनेट को सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को नई ट्यूबों में स्थानांतरित करें। मच्छर के मलबे को पूरी तरह से हटाने के लिए, सतह पर तैरनेवाले को फिर से 15,000 जी पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।सुपरनैटेंट पी 0 के 200 माइक्रोलीटर को दो-मिलीलीटर स्क्रू कैप स्टोरेज ट्यूब में डालें, और इसे माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। वायरस प्रवर्धन के लिए, एडीज एल्बोपिक्टस आरएनएआई की कमी वाले मच्छर सेल लाइन सी 6/36 और एक कशेरुक सेल लाइन, बेबी हैम्स्टर किडनी, या बीएचके -21 का उपयोग 75 सेंटीमीटर वर्ग फ्लास्क से करें और उन्हें अलग से 24 वेल प्लेटों में बीज दें। बीज वाले 24 कुएं की प्लेट को 28 या 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखें।अगले दिन, प्रत्येक कुएं में 80 से 90% कंफ्लुएंसी की पुष्टि करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें। एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक सेल कल्चर रखरखाव माध्यम के 500 मिलीलीटर तैयार करें। 24 कुएं प्लेटों से सेल कल्चर माध्यम को हटा दें और प्रत्येक कुएं में सेल कल्चर रखरखाव माध्यम के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।फिर कोशिकाओं को मच्छर होमोजेनेट या पी 0 के सुपरनैटेंट के 100 माइक्रोलीटर के साथ टीका लगाया जाता है। 60 मिनट के लिए प्लेटों को 28 या 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और कोशिकाओं के सूखने को रोकने के लिए हर 15 मिनट के बाद प्लेटों को धीरे से हिलाएं। एक बार ऐसा करने के बाद, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और मलबे को पूरी तरह से हटाने के लिए 600 माइक्रोलीटर सेल कल्चर रखरखाव माध्यम के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से कुल्ला करें। इसके बाद, प्लेटों को 7 दिनों के लिए 28 या 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% कार्बन डाइऑक्साइड ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में रखने से पहले प्रत्येक कुएं में 800 माइक्रोलीटर सेल कल्चर रखरखाव माध्यम जोड़ें।माइक्रोस्कोप के तहत प्रत्येक कुएं की कोशिकाओं की स्थिति की दैनिक निगरानी करें। सातवें दिन, पी 1 के रूप में जानी जाने वाली कोशिकाओं के सुपरनैटेंट को इकट्ठा करें और इसे शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस नीचे स्टोर करें। पी 2 और पी 3 वायरल सुपरनैटेंट एकत्र करने के लिए प्रक्रिया को दोहराएं।साइटोपैथोजेनिक प्रभाव, या सीपीई के कारण, कुछ कुओं से कोशिकाएं मर जाती हैं और सतह से अलग हो जाती हैं। वायरस को बढ़ाने के लिए सीपीई प्रभाव दिखाने वाले कुओं से 300 से 400 माइक्रोलीटर सुपरनैटेंट एकत्र करें और इसे एक नई छह-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें जिसमें संस्कृति कोशिकाओं के 80 से 90% सेल प्रवाह हों। अंत में, छह-वेल प्लेट के कुओं से 500 माइक्रोलीटर सुपरनैटेंट को शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने से पहले दो-मिलीलीटर स्क्रू कैप स्टोरेज ट्यूबों में इकट्ठा और स्थानांतरित करें।मच्छर होमोजेनेट्स पी0 के साथ सी6/36 कोशिकाओं के टीकाकरण ने बिना टीकाकरण या नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में संक्रमण के बाद 120 घंटे की अवधि में एक्सफोलिएटेड कोशिकाओं में एक विस्तृत अंतरकोशिकीय स्थान प्रदर्शित किया। पी 3 वायरल सुपरनैटेंट के साथ बीएचके 21 कोशिकाओं के इनक्यूबेशन ने संक्रमण के 48 घंटे बाद एक दृश्यमान सीपीई का प्रदर्शन किया, जो नियंत्रण कोशिकाओं के विपरीत कोशिका की मृत्यु और सतह से अलगाव को प्रदर्शित करता है। वायरल सुपरनैटेंट के लिए पीसीआर उत्पादों को उत्पन्न करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सार्वभौमिक प्राइमर या फ्लेविवायरस, अल्फावायरस और बुनियावायरस का उपयोग किया गया था।बुनियावायरस के लिए एक पीसीआर उत्पाद, एबिनुर झील वायरस, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेट किया गया था। बुनियावायरस से संबंधित गलियों में पीसीआर प्रवर्धन प्रतिबंध और सकारात्मक नियंत्रण ने सुपरनैटेंट में बुनियावायरस की उपस्थिति की संभावना पर प्रकाश डाला। वायरस अलगाव की सफलता दर में सुधार करने के लिए, नमूना परिवहन, अलगाव और पीसने के दौरान कम तापमान रखें।मच्छरों और संस्कृति को समरूप करते समय एंटीबायोटिक्स जोड़ें। और इनक्यूबेशन के दौरान संस्कृति को तेजी से संभालें और संस्कृति माध्यम को हटा दें। इस प्रक्रिया के अलावा, पीसने के घोल को साइक्लिंग चूहे या चिकन भ्रूण में इंजेक्ट किया जा सकता है।हालांकि, पुष्टि प्रक्रिया नैतिक चिंताओं को बढ़ाएगी और प्रयोग के खर्च को बढ़ाएगी।

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Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

माउस और मानव घुटकी से myofibroblasts का अलगाव

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

मलेरिया हस्तांतरित मच्छरों के लिए एक बहु-खोज परख

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

उपंयास कीटनाशक Chemistries मच्छरों के विषाक्तता के परीक्षण के लिए प्रोटोकॉल

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

एक विधि के रूप में मजबूर लार मच्छरों की वेक्टर क्षमता का विश्लेषण करने के लिए

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

सीए2 + क्षणिक और एल-प्रकार कैल्शियम करंट के एक साथ माप के लिए उच्च गुणवत्ता वाले मुराइन एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स का अलगाव

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...