Name: mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes
Uploaded: 2022-08-31T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).

1. Campionamento e selezione delle zanzare
<ol><li>Intrappola le zanzare adulte attraverso le trappole luminose MXA-02 o le trappole per zanzare ad anidride carbonica sul campo.</li>
	<li>Uccidere le zanzare raccolte immergendo nell'azoto liquido10,11. Trasportarli in laboratorio con il sistema logistico della catena del freddo12. NOTA: il ghiaccio secco è stato utilizzato principalmente nel sistema logistico della c...

<ol>
	<li>Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-associated+viruses+in+China.">Mosquito-associated viruses in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+distribution+and+diversity+of+mosquito-associated+viruses+and+their+mosquito+vectors+in+China.">A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China.</a> Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+global+distribution+of+novel+mosquito-associated+viruses+in+the+last+decade+(2007-2017).">The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017).</a> Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+metagenomic+profiling+of+viromes+associated+with+four+common+mosquito+species+in+China.">Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).</li><li>Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+viruses+and+non-human+vertebrates+in+Australia:+A+review.">Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review.</a> Viruses. 13 (2), 265 (2021).</li><li>Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+viruses-transmission+and+interaction.">Mosquito-specific viruses-transmission and interaction.</a> Viruses. 11 (9), 873 (2019).</li><li>Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+and+mosquito-borne+viruses:+evolution,+infection,+and+host+defense.">Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense.</a> Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).</li><li>Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+dynamics+of+an+insect-specific+flavivirus+in+a+naturally+infected+Culex+pipiens+laboratory+colony+and+effects+of+co-infection+on+vector+competence+for+West+Nile+virus.">Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus.</a> Virology. 427 (2), 90-97 (2012).</li><li>Baidaliuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-fusing+agent+virus+reduces+arbovirus+dissemination+in+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+vivo.">Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo.</a> Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+virome+analysis+of+Culex+mosquitoes+from+Kenya+and+China.">Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China.</a> Viruses. 10 (1), 30 (2018).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+isolation+and+characterization+of+a+group+C+Banna+virus+(BAV)+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Hubei,+China.">First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China.</a> Viruses. 10 (10), 555 (2018).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+the+virome+in+lab-+and+field-collected+Aedes+albopictus+mosquitoes+across+different+developmental+stages+and+possible+core+viruses+in+the+publicly+available+virome+data+of+Aedes+mosquitoes.">Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes.</a> mSystems. 5 (5), 00640 (2020).</li><li>Zhou, M., Chu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+main+mosquito+species+in+China+based+on+DNA+barcoding.">Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding.</a> Plos One. 7 (10), (2012).</li><li>Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bold:+The+Barcode+of+Life+Data+System+(www.barcodinglife.org).">Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org).</a> Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+new+strain+of+mosquito+Flavivirus+derived+from+Culicoides.">In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides.</a> Viruses. 14 (6), 1298 (2022).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+Tanay+virus+isolated+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Yunnan,+China.">Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).</li><li>Ren, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+reassortment+Tibet+orbivirus+isolated+from+Culicoides+spp.+in+Yunnan,+PR+China.">Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China.</a> Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).</li></ol>

L'obiettivo di questo metodo era quello di offrire un modo pratico per isolare i virus associati alle zanzare utilizzando varie linee cellulari. È fondamentale aggiungere l'antibiotico-antimicotico (penicillina-streptomicina-amfotericina) ai surnatanti degli omogenati di zanzara per evitare la contaminazione da batteri o funghi. Le zanzare e i supernatanti virali ottenuti sul campo devono essere refrigerati a -80 °C per evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo.
Un altro passo fondamentale nel ...

Le zanzare sono un gruppo di importanti vettori di artropodi patogeni. Ci sono circa 3.500 specie di zanzare nella famiglia Culicidae 1,2. Lo sviluppo di tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento ha portato alla scoperta di molte nuove sequenze simili a virus nelle zanzare provenienti da diverse parti del mondo3. Generalmente, questi virus associati alle zanzare possono essere classificati in due gruppi principali: MBV e MSV.
Gli MBV sono un gruppo di virus diversi che sono agenti causali di molte malattie umane o animali, come il virus della febbre gialla (YFV), il virus della dengue (DENV), il virus dell'encefalite giapponese (JEV), il virus del Nilo occidentale (WNV) e il virus della febbre della Rift Valley (RVFV)4. Hanno seriamente minacciato la salute pubblica causando gravi morbilità e mortalità sia negli esseri umani che negli animali in tutto il mondo. Gli MBV sostengono naturalmente un ciclo di vita tra diversi ospiti attraverso la trasmissione da una zanzara infetta a un ospite ingenuo, nonché da un ospite infetto da virus e da una zanzara nutriente5. Pertanto, questi virus possono infettare sia le linee cellulari di zanzara che le linee cellulari di vertebrati nel laboratorio1.
Gli MSV, che includono il virus Yichang (YCN), il flavivirus Culex (CxFV) e il virus Chaoyang (CHAOV), sono un sottogruppo di virus specifici per insetti 1,6,7. Negli ultimi anni, c'è stato un aumento nella scoperta di nuovi MSV e alcuni di questi MSV hanno avuto un impatto sulla trasmissione di MBV. Ad esempio, CxFV, che può essere un'infezione persistente in Culex pipiens, potrebbe sopprimere la replicazione WNV in una fase iniziale8. Un altro flavivirus specifico per insetti, il virus dell'agente di fusione cellulare (CFAV), è stato trovato per inibire la propagazione del virus DENV e Zika (ZIKV) nelle zanzare Aedes aegypti 9. Pertanto, questo protocollo è un approccio utile per isolare i virus associati alle zanzare e può aiutare in ulteriori ricerche sulla distribuzione di agenti patogeni legati alle zanzare e sul controllo delle malattie trasmesse dalle zanzare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3524</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 flasks</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Instrument for centrifugation of mosquito samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s minimal essential medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>medium for vertebrate cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feta Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141C</td>
			<td> 
			 
			Provide nutrition for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-speed low-temperature tissue homogenizer</td>
			<td>servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (28 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15410-122</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute&#160; medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td>medium for mosiquto cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL)</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile pestles</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y004</td>
			<td>Consumables&#160; for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y30</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the light traps MXA-02</td>
			<td>Maxttrac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The QIAamp viral RNA mini kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes

Con l'ampia applicazione delle tecnologie di sequenziamento, molte nuove sequenze simili a virus sono state scoperte negli artropodi, comprese le zanzare. Le due categorie principali di questi nuovi virus associati alle zanzare sono "virus trasmessi dalle zanzare (MBV)" e "virus specifici delle zanzare (MSV)". Questi nuovi virus potrebbero essere patogeni sia per i vertebrati che per le zanzare, o potrebbero semplicemente essere simbiotici con le zanzare. I virus entità sono essenziali per confermare i caratteri biologici di questi virus. Pertanto, qui è stato descritto un protocollo dettagliato per l'isolamento e l'amplificazione del virus dalle zanzare raccolte sul campo. In primo luogo, i campioni di zanzara sono stati preparati come surnatanti di omogenati di zanzare. Dopo due centrifugazioni, i surnatanti sono stati poi inoculati nella linea cellulare di zanzara C6/36 o nella linea cellulare di vertebrati BHK-21 per l'amplificazione del virus. Dopo 7 giorni, i surnatanti sono stati raccolti come supernatanti P1 e conservati a -80 °C. Successivamente, i supernatanti P1 sono stati fatti passare altre due volte nelle cellule C6/36 o BHK-21 mentre lo stato della cellula veniva controllato quotidianamente. Quando è stato scoperto l'effetto citopatogeno (CPE) sulle cellule, questi surnatanti sono stati raccolti e utilizzati per identificare i virus. Questo protocollo serve come base per la ricerca futura sui virus associati alle zanzare, inclusi MBV e MSV.

Dopo l'inoculazione con i surnatanti degli omogenati di zanzara (P0), le cellule C6/36 hanno mostrato un ampio spazio intercellulare e le cellule esfoliate sono state osservate a 120 ore (Figura 1A) rispetto alle cellule non inoculate (controllo) allo stesso tempo (Figura 1B). Dopo aver incubato le cellule BHK-21 con i supernatanti P3, è stato osservato CPE visibile nelle cellule BHK-21 a 48 ore (Figura 1C) in contrasto con le cell...

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Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

Numerose nuove sequenze simili a virus sono state trovate nelle zanzare a causa dell'ampio uso di tecnologie di sequenziamento. Forniamo una procedura efficace per isolare e amplificare i virus utilizzando linee cellulari di vertebrati e zanzare, che potrebbero servire come base per studi futuri sui virus associati alle zanzare, compresi i virus trasmessi dalle zanzare e specifici per le zanzare.

Isolamento del virus associato alle zanzare dalle zanzare raccolte sul campo

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

Questo protocollo è un approccio utile per isolare i virus associati alle zanzare e può aiutare in ulteriori ricerche sulla distribuzione degli agenti patogeni legati alle zanzare e sul controllo delle malattie trasmesse dalle zanzare. L'utilizzo di linee sottili per isolare i virus nel laboratorio di livello 2 di biosicurezza è più sicuro ed efficiente. A differenza di altre procedure di isolamento del virus, come l'inoculazione rossa ciclica con fluido variabile, questa tecnica non richiede la sperimentazione animale o la valutazione etica.La contaminazione da campioni e dalle cellule prelevate durante l'incubazione può portare al fallimento dell'esperimento. Quindi, è necessario aggiungere 2% Penicillina-streptomicina-amfotericina nel mezzo per prevenire la contaminazione. Iniziare con l'aggiunta di perle di ceramica da tre millimetri, 1,5 millilitri di mezzo RPMI integrato con una soluzione di penicillina-streptomicina-amfotericina B al 2% in un tubo sterile da due millilitri posto sul ghiaccio e quindi trasferire 50 zanzare in esso.Quindi, omogeneizzare le zanzare con un omogeneizzatore tissutale a bassa temperatura macinando per 30 secondi a 70 hertz e 4 gradi Celsius per 3 cicli. Centrifugare l'omogenato a 15.000 G per 30 minuti a 4 gradi Celsius e trasferire i surnatanti nei nuovi tubi. Per rimuovere completamente i detriti di zanzara, centrifugare nuovamente il surnatante a 15.000 G per 10 minuti a 4 gradi Celsius.Aliquot i 200 microlitri di surnatante P0 in un tubo di stoccaggio con tappo a vite da due millilitri e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Per l'amplificazione del virus, utilizzare la linea cellulare di zanzara carente di RNAi Aedes albopictus C6/36 e una linea cellulare di vertebrati, rene di criceto o BHK-21 da un pallone quadrato di 75 centimetri e seminarli separatamente in 24 piastre di pozzetto. Posizionare il piatto a 24 pozzetti seminato durante la notte a 28 o 37 gradi Celsius.Il giorno successivo, osservare le cellule al microscopio per confermare l'80-90% di confluenza in ciascun pozzetto. Preparare 500 millilitri del terreno di mantenimento della coltura cellulare integrato con antibiotici. Rimuovere il terreno di coltura cellulare dalle piastre da 24 pozzetti e aggiungere 100 microlitri del terreno di mantenimento della coltura cellulare a ciascun pozzetto.Quindi inoculare le cellule con 100 microlitri del surnatante dell'omogenato di zanzara o P0. Incubare le piastre a 28 o 37 gradi Celsius per 60 minuti e agitare delicatamente le piastre dopo ogni 15 minuti per evitare l'essiccazione delle cellule. Una volta fatto, rimuovere il surnatante e sciacquare ogni pozzetto con 600 microlitri di terreno di mantenimento della coltura cellulare per rimuovere completamente i detriti. Quindi, aggiungere 800 microlitri di terreno di mantenimento della coltura cellulare a ciascun pozzetto prima di posizionare le piastre in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica a 28 o 37 gradi Celsius per 7 giorni.Monitorare quotidianamente lo stato delle cellule di ciascun pozzetto al microscopio. Il settimo giorno, raccogliere il surnatante di cellule noto come P1 e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Ripetere la procedura per raccogliere i supernatanti virali P2 e P3.A causa dell'effetto citopatogeno, o CPE, le cellule di alcuni pozzetti muoiono e si staccano dalla superficie. Per amplificare notevolmente i virus raccogliere da 300 a 400 microlitri di surnatante dai pozzetti che mostrano l'effetto CPE e trasferirlo in una nuova piastra a sei pozzetti con confluenza cellulare dall'80 al 90% delle cellule di coltura. Infine, raccogliere e trasferire 500 microlitri di surnatante dai pozzetti della piastra a sei pozzetti ai tubi di stoccaggio con tappo a vite da due millilitri prima di conservarli a meno 80 gradi Celsius.L'inoculazione delle cellule C6/36 con gli omogenati di zanzara P0 ha mostrato un ampio spazio intercellulare nelle cellule esfoliate a 120 ore dopo il periodo di infezione rispetto alle cellule non inoculate o di controllo. L'incubazione delle cellule BHK21 con i supernatanti virali P3 ha dimostrato una CPE visibile a 48 ore dopo l'infezione, mostrando la morte della cellula e il distacco dalla superficie in contrasto con le cellule di controllo. Primer universali disponibili in commercio o Flavivirus, Alphavirus e Bunyavirus sono stati utilizzati per generare i prodotti PCR per il surnatante virale.Un prodotto PCR per il Bunyavirus, il virus del lago Ebinur, è stato impostato come controllo positivo. I divieti di amplificazione della PCR nelle corsie appartenenti ai Bunyavirus e il controllo positivo hanno evidenziato la possibilità della presenza di Bunyavirus nei surnatanti . Per migliorare il tasso di successo dell'isolamento del virus, mantenere una temperatura bassa durante il trasporto, l'isolamento e la macinazione del campione.Aggiungi antibiotici quando omogeneizzi le zanzare e la cultura stessa. E gestire rapidamente la coltura durante l'incubazione e la rimozione del terreno di coltura. Oltre a questa procedura, la soluzione di macinazione può essere iniettata in un ratto ciclico o in un embrione di pollo.Tuttavia, la procedura di affermazione solleverà preoccupazioni etiche e aumenterà le spese dell'esperimento.

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