Name: mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes
Uploaded: 2022-08-31T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes at JoVE.com

이 작업은 우한 과학 기술 계획 프로젝트 (2018201261638501)의 지원을 받았습니다.

1. 모기 샘플링 및 분류
<ol><li>가벼운 함정 MXA-02 또는 현장의 이산화탄소 모기 함정을 통해 성인 모기를 잡으십시오.</li>
	<li>액체 질소10,11에 담궈 수집 된 모기를 죽입니다. 콜드 체인 물류 시스템12에 의해 실험실로 운송합니다. 참고: 드라이아이스는 주로 콜드체인 물류 시스템에 사용되었습니다.</li>
	<li>(선택 사항) ?...

<ol>
	<li>Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-associated+viruses+in+China.">Mosquito-associated viruses in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+distribution+and+diversity+of+mosquito-associated+viruses+and+their+mosquito+vectors+in+China.">A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China.</a> Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+global+distribution+of+novel+mosquito-associated+viruses+in+the+last+decade+(2007-2017).">The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017).</a> Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+metagenomic+profiling+of+viromes+associated+with+four+common+mosquito+species+in+China.">Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).</li><li>Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+viruses+and+non-human+vertebrates+in+Australia:+A+review.">Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review.</a> Viruses. 13 (2), 265 (2021).</li><li>Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+viruses-transmission+and+interaction.">Mosquito-specific viruses-transmission and interaction.</a> Viruses. 11 (9), 873 (2019).</li><li>Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+and+mosquito-borne+viruses:+evolution,+infection,+and+host+defense.">Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense.</a> Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).</li><li>Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+dynamics+of+an+insect-specific+flavivirus+in+a+naturally+infected+Culex+pipiens+laboratory+colony+and+effects+of+co-infection+on+vector+competence+for+West+Nile+virus.">Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus.</a> Virology. 427 (2), 90-97 (2012).</li><li>Baidaliuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-fusing+agent+virus+reduces+arbovirus+dissemination+in+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+vivo.">Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo.</a> Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+virome+analysis+of+Culex+mosquitoes+from+Kenya+and+China.">Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China.</a> Viruses. 10 (1), 30 (2018).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+isolation+and+characterization+of+a+group+C+Banna+virus+(BAV)+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Hubei,+China.">First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China.</a> Viruses. 10 (10), 555 (2018).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+the+virome+in+lab-+and+field-collected+Aedes+albopictus+mosquitoes+across+different+developmental+stages+and+possible+core+viruses+in+the+publicly+available+virome+data+of+Aedes+mosquitoes.">Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes.</a> mSystems. 5 (5), 00640 (2020).</li><li>Zhou, M., Chu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+main+mosquito+species+in+China+based+on+DNA+barcoding.">Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding.</a> Plos One. 7 (10), (2012).</li><li>Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bold:+The+Barcode+of+Life+Data+System+(www.barcodinglife.org).">Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org).</a> Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+new+strain+of+mosquito+Flavivirus+derived+from+Culicoides.">In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides.</a> Viruses. 14 (6), 1298 (2022).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+Tanay+virus+isolated+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Yunnan,+China.">Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).</li><li>Ren, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+reassortment+Tibet+orbivirus+isolated+from+Culicoides+spp.+in+Yunnan,+PR+China.">Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China.</a> Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).</li></ol>

이 방법의 목적은 다양한 세포주를 사용하여 모기 관련 바이러스를 분리하는 실용적인 방법을 제공하는 것이었습니다. 박테리아나 곰팡이에 의한 오염을 피하기 위해 모기 균질액의 상층액에 항생제-항진균제(페니실린-스트렙토마이신-암포테리신)를 첨가하는 것이 중요합니다. 현장에서 얻은 모기와 바이러스 상층액은 반복되는 동결-해동 주기를 피하기 위해 -80°C에서 냉장 보관해야 합니다.</p...

모기는 중요한 병원성 절지 동물 벡터 그룹입니다. Culicidae 1,2과에는 약 3,500 종의 모기가 있습니다. 고처리량 염기서열 분석 기술의 개발로 인해 세계 여러 지역의 모기에서 바이러스와 유사한 새로운 염기서열이 많이 발견되었습니다3. 일반적으로 이러한 모기 관련 바이러스는 MBV와 MSV의 두 가지 주요 그룹으로 분류할 수 있습니다.
MBV는 황열병 바이러스(YFV), 뎅기열 바이러스(DENV), 일본 뇌염 바이러스(JEV), 웨스트 나일 바이러스(WNV) 및 리프트 밸리 열병 바이러스(RVFV)와 같은 많은 인간 또는 동물 질병의 원인 물질인 다양한 바이러스 그룹입니다4. 그들은 전 세계의 인간과 동물 모두에게 심각한 이환율과 사망률을 유발하여 공중 보건을 심각하게 위협했습니다. MBV는 감염된 모기에서 순진한 숙주로, 바이러스에 감염된 숙주와 먹이를 먹는 모기로 전염됨으로써 다양한 숙주 간의 수명 주기를 자연적으로 유지한다5. 따라서 이러한 바이러스는 실험실에서 모기 세포주와 척추동물 세포주를 모두 감염시킬 수 있다1.
이창 바이러스(Yichang virus, YCN), 쿨렉스 플라비바이러스(Culex flavivirus, CxFV) 및 차오양 바이러스(Chaoyang virus, CHAOV)를 포함하는 MSV는 곤충 특이적 바이러스의 하위군이다 1,6,7. 최근 몇 년 동안 새로운 MSV의 발견이 증가했으며 이러한 MSV 중 일부는 MBV의 전송에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌습니다. 예를 들어, Culex pipiens에서 지속적인 감염이 될 수 있는 CxFV는 초기 단계에서 WNV 복제를 억제할 수 있다8. 또 다른 곤충 특이적 플라비바이러스인 세포융합제 바이러스(cell-fusing agent virus, CFAV)는 이집트숲모기에서 DENV와 지카 바이러스(Zika virus, ZIKV)의 번식을 억제하는 것으로 밝혀졌다9. 따라서 이 프로토콜은 모기 관련 바이러스를 분리하는 데 유용한 접근 방식이며 모기와 관련된 병원체의 분포 및 모기 매개 질병의 통제에 대한 추가 연구에 도움이 될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3524</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 flasks</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Instrument for centrifugation of mosquito samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s minimal essential medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>medium for vertebrate cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feta Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141C</td>
			<td> 
			 
			Provide nutrition for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-speed low-temperature tissue homogenizer</td>
			<td>servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (28 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15410-122</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute&#160; medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td>medium for mosiquto cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL)</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile pestles</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y004</td>
			<td>Consumables&#160; for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y30</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the light traps MXA-02</td>
			<td>Maxttrac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The QIAamp viral RNA mini kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes

시퀀싱 기술의 광범위한 적용으로 모기를 포함한 절지동물에서 많은 새로운 바이러스 유사 서열이 발견되었습니다. 이러한 새로운 모기 관련 바이러스의 두 가지 주요 범주는 "모기 매개 바이러스(MBV)"와 "모기 특이 바이러스(MSV)"입니다. 이 새로운 바이러스는 척추동물과 모기 모두에 병원성일 수도 있고 모기와 공생할 수도 있습니다. 엔티티 바이러스는 이러한 바이러스의 생물학적 특성을 확인하는 데 필수적입니다. 따라서, 현장에서 채취한 모기로부터 바이러스 분리 및 증폭을 위한 상세한 프로토콜이 여기에 설명되었다. 먼저, 모기 샘플을 모기 균질액의 상청액으로 제조하였다. 2회 원심분리 후, 상층액을 바이러스 증폭을 위해 모기 세포주 C6/36 또는 척추동물 세포주 BHK-21에 접종하였다. 7일 후, 상청액을 P1 상청액으로서 수집하고, -80°C에서 보관하였다. 다음으로, P1 상청액을 C6/36 또는 BHK-21 세포에 2회 더 계대배양하면서 세포 상태를 매일 확인했습니다. 세포에 대한 세포병리학적 효과(CPE)가 발견되었을 때, 이러한 상청액을 수집하여 바이러스를 식별하는 데 사용했습니다. 이 프로토콜은 MBV 및 MSV를 포함한 모기 관련 바이러스에 대한 향후 연구의 기초 역할을 합니다.

모기 균질액(P0)의 상층액을 접종한 후, C6/36 세포는 넓은 세포간 공간을 나타내었고, 박리된 세포는 접종되지 않은 세포(대조군)에 비해 120시간(그림 1A)에서 동시에 관찰되었습니다(그림 1B). BHK-21 세포를 P3 상층액과 함께 배양한 후, 대조군 세포(도 1D)와 대조적으로 48시간(그림 1C)에 BHK-21 세포에서 가시적인 ...

Watch this Scientific Journal Video about Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes at JoVE.com

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

수많은 새로운 바이러스 유사 서열이 시퀀싱 기술의 광범위한 사용으로 인해 모기에서 발견되었습니다. 우리는 척추동물 및 모기 세포주를 사용하여 바이러스를 분리하고 증폭하는 효과적인 절차를 제공하며, 이는 모기 매개 및 모기 특이적 바이러스를 포함한 모기 관련 바이러스에 대한 향후 연구의 기초가 될 수 있습니다.

현장에서 채취한 모기로부터 모기 관련 바이러스 분리

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

이 프로토콜은 모기 관련 바이러스를 분리하는 데 유용한 접근 방식이며 모기와 관련된 병원체의 분포 및 모기 매개 질병의 통제에 대한 추가 연구에 도움이 될 수 있습니다. 생물 안전 레벨 2 실험실에서 바이러스를 분리하기 위해 가는 선을 사용하는 것이 더 안전하고 효율적입니다. 다양한 액체로 적색 접종을 순환시키는 것과 같은 다른 바이러스 분리 절차와 달리 이 기술은 동물 실험이나 윤리적 평가가 필요하지 않습니다.배양 중 시료 및 세포 채취로 인한 오염은 실험 실패로 이어질 수 있습니다. 그러므로, 오염을 방지하기 위하여 2%페니실린-스트렙토마이신-암포테리신을 배지에 첨가하는 것이 필요합니다. 얼음 위에 놓인 2 밀리리터 멸균 튜브에 2 % 페니실린-스트렙토 마이신-암포 테리 신 B 용액이 보충 된 RPMI 배지 1.5 밀리리터의 3 밀리미터 세라믹 비드를 첨가 한 다음 50 마리의 모기를 옮깁니다.다음으로, 모기를 저온 조직 균질기로 70헤르츠, 섭씨 4도에서 3사이클 동안 30초 동안 분쇄하여 균질화한다. 섭씨 4도에서 30 분 동안 15, 000 G에서 균질 액을 원심 분리하고 상청액을 새로운 튜브로 옮깁니다. 모기 파편을 완전히 제거하려면 섭씨 4도에서 10 분 동안 15, 000G에서 상청액을 다시 원심 분리하십시오.200마이크로리터의 상등액 P0을 2밀리리터 스크류 캡 저장 튜브에 분취하여 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 바이러스 증폭을 위해 Aedes albopictus RNAi 결핍 모기 세포주 C6/36과 척추동물 세포주, 베이비 햄스터 신장 또는 BHK-21을 75cm 정사각형 플라스크에서 사용하여 24웰 플레이트에 별도로 시드합니다. 시드된 24웰 플레이트를 섭씨 28도 또는 37도에서 밤새 놓습니다.다음날, 현미경으로 세포를 관찰하여 각 웰에서 80 내지 90%의 밀도를 확인하였다. 항생제가 보충된 세포 배양 유지 배지 500밀리리터를 준비합니다. 24 웰 플레이트로부터 세포 배양 배지를 제거하고, 100 마이크로리터의 세포 배양 유지 배지를 각 웰에 첨가한다.그런 다음 모기 균질액 또는 P0의 상청액 100 마이크로 리터로 세포를 접종합니다. 플레이트를 섭씨 28도 또는 37도에서 60분 동안 배양하고 세포의 건조를 방지하기 위해 15분마다 플레이트를 부드럽게 흔든다. 완료되면 상층액을 제거하고 600마이크로리터의 세포 배양 유지 배지로 각 웰을 헹구어 파편을 완전히 제거합니다. 다음으로, 800 마이크로 리터의 세포 배양 유지 배지를 각 웰에 첨가 한 후 플레이트를 섭씨 28도 또는 37 도의 5 % 이산화탄소 가습 인큐베이터에 7 일 동안 넣는다.매일 현미경으로 각 웰의 세포 상태를 모니터링하십시오. 일곱째 날에는 P1으로 알려진 세포의 상층액을 채취하여 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 절차를 반복하여 P2 및 P3 바이러스 상청액을 수집합니다.세포 병원성 효과 (CPE)로 인해 일부 우물의 세포가 죽어 표면에서 분리됩니다. 바이러스를 크게 증폭시키기 위해 CPE 효과를 나타내는 웰에서 300 내지 400 마이크로리터의 상청액을 수집하고, 이를 배양 세포의 80 내지 90% 세포 밀도를 갖는 새로운 6-웰 플레이트로 옮긴다. 마지막으로, 섭씨 영하 80도에서 보관하기 전에 6웰 플레이트의 웰에서 500마이크로리터의 상청액을 수집하여 2밀리리터 스크류 캡 저장 튜브로 옮깁니다.모기 균질액 P0로 C6/36 세포를 접종한 결과, 접종되지 않은 세포 또는 대조군 세포에 비해 감염 후 120시간에 박리된 세포에서 넓은 세포간 공간을 나타내었다. P3 바이러스 상청액과 함께 BHK21 세포를 배양한 결과 감염 후 48시간에 가시적인 CPE가 나타났으며, 대조군 세포와 달리 세포의 사멸과 표면으로부터의 박리를 나타냈습니다. 상업적으로 이용가능한 유니버셜 프라이머 또는 플라비바이러스, 알파바이러스 및 부냐바이러스를 바이러스 상청액에 대한 PCR 산물을 생성하는데 사용하였다.Bunyavirus에 대한 PCR 산물인 Ebinur Lake 바이러스를 양성 대조군으로 설정했습니다. Bunyaviruses에 속하는 레인에서의 PCR 증폭 금지 및 양성 대조군은 상청액에 Bunyavirus가 존재할 가능성을 강조했습니다. 바이러스 분리의 성공률을 높이려면 샘플 운송, 분리 및 분쇄 중에 낮은 온도를 유지하십시오.모기와 배양 자체를 균질화 할 때 항생제를 추가하십시오. 배양 중에 배양액을 신속하게 처리하고 배양액을 제거한다. 이 절차 외에도, 분쇄 용액은 사이클링 쥐 또는 닭 배아에 주입 될 수있다.그러나 확인 절차는 윤리적 문제를 제기하고 실험 비용을 증가시킵니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

애에서 Midgut과 침샘의 해부. aegypti 모기

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

연구

생물학

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

마우스 뒷면에서 게놈 DNA의 분리

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

골격근에서 Mitochondrial 절연

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

일차 종양에서 면역 세포의 분리

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

마우스 및 인간의 식도에서 근섬유 아세포의 분리

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

말라리아 모기 전송하기위한 다중 탐지 분석

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

모기에 소설 Insecticidal 화학 물질의 독성을 테스트 하기 위한 프로토콜

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

모기의 벡터 역량을 분석 하는 방법으로 타 액 분 비를 강제

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...