Name: mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes
Uploaded: 2022-08-31T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).

1. Myggprøvetaking og sortering
<ol><li>Fang de voksne myggene gjennom lysfellene MXA-02 eller karbondioksidmyggfeller i felt.</li>
	<li>Drep de oppsamlede myggene ved å dyppe i flytende nitrogen10,11. Transporter dem til laboratoriet med kjølekjedelogistikksystemet12. MERK: Tørris ble først og fremst brukt i kjølekjedelogistikksystemet.</li>
	<li>(Valgfritt) Hvis prøvestedene var i nærheten av laboratoriet, s...

<ol>
	<li>Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-associated+viruses+in+China.">Mosquito-associated viruses in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+distribution+and+diversity+of+mosquito-associated+viruses+and+their+mosquito+vectors+in+China.">A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China.</a> Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+global+distribution+of+novel+mosquito-associated+viruses+in+the+last+decade+(2007-2017).">The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017).</a> Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+metagenomic+profiling+of+viromes+associated+with+four+common+mosquito+species+in+China.">Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).</li><li>Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+viruses+and+non-human+vertebrates+in+Australia:+A+review.">Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review.</a> Viruses. 13 (2), 265 (2021).</li><li>Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+viruses-transmission+and+interaction.">Mosquito-specific viruses-transmission and interaction.</a> Viruses. 11 (9), 873 (2019).</li><li>Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+and+mosquito-borne+viruses:+evolution,+infection,+and+host+defense.">Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense.</a> Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).</li><li>Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+dynamics+of+an+insect-specific+flavivirus+in+a+naturally+infected+Culex+pipiens+laboratory+colony+and+effects+of+co-infection+on+vector+competence+for+West+Nile+virus.">Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus.</a> Virology. 427 (2), 90-97 (2012).</li><li>Baidaliuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-fusing+agent+virus+reduces+arbovirus+dissemination+in+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+vivo.">Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo.</a> Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+virome+analysis+of+Culex+mosquitoes+from+Kenya+and+China.">Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China.</a> Viruses. 10 (1), 30 (2018).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+isolation+and+characterization+of+a+group+C+Banna+virus+(BAV)+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Hubei,+China.">First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China.</a> Viruses. 10 (10), 555 (2018).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+the+virome+in+lab-+and+field-collected+Aedes+albopictus+mosquitoes+across+different+developmental+stages+and+possible+core+viruses+in+the+publicly+available+virome+data+of+Aedes+mosquitoes.">Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes.</a> mSystems. 5 (5), 00640 (2020).</li><li>Zhou, M., Chu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+main+mosquito+species+in+China+based+on+DNA+barcoding.">Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding.</a> Plos One. 7 (10), (2012).</li><li>Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bold:+The+Barcode+of+Life+Data+System+(www.barcodinglife.org).">Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org).</a> Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+new+strain+of+mosquito+Flavivirus+derived+from+Culicoides.">In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides.</a> Viruses. 14 (6), 1298 (2022).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+Tanay+virus+isolated+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Yunnan,+China.">Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).</li><li>Ren, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+reassortment+Tibet+orbivirus+isolated+from+Culicoides+spp.+in+Yunnan,+PR+China.">Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China.</a> Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).</li></ol>

Målet med denne metoden var å tilby en praktisk måte å isolere myggassosierte virus ved hjelp av forskjellige cellelinjer. Det er viktig å legge til antibiotika-antimykotisk (Penicillin-Streptomycin-Amphotericin) til supernatanter av mygghomogenatene for å unngå forurensning av bakterier eller sopp. Mygg og virale supernatanter oppnådd i felt må oppbevares i kjøleskap ved -80 °C for å unngå gjentatte fryse-tine-sykluser.
Et annet kritisk skritt i protokollen var sliping. Myggprøv...

Mygg er en gruppe viktige patogene leddyrvektorer. Det er ca. 3 500 myggarter i familien Culicidae 1,2. Utviklingen av høykapasitets sekvenseringsteknologier har ført til oppdagelsen av mange nye, viruslignende sekvenser i mygg fra forskjellige deler av verden3. Vanligvis kan disse myggassosierte virusene klassifiseres i to hovedgrupper: MBV og MSV.
MBV er en gruppe forskjellige virus som er årsaksmessige midler til mange sykdommer hos mennesker eller dyr, for eksempel gulfebervirus (YFV), denguevirus (DENV), japansk encefalittvirus (JEV), West Nile-virus (WNV) og Rift Valley febervirus (RVFV)4. De har alvorlig truet folkehelsen ved å forårsake alvorlig sykelighet og dødelighet hos både mennesker og dyr over hele verden. MBV-er opprettholder naturlig en livssyklus mellom ulike verter gjennom overføring fra en infisert mygg til en naiv vert, samt fra en virusinfisert vert og til en fôringsmygg5. Derfor kan disse virusene infisere både myggcellelinjer og virveldyrcellelinjer i laboratoriet1.
MSVer, som inkluderer Yichang-virus (YCN), Culex flavivirus (CxFV) og Chaoyang-virus (CHAOV), er en undergruppe av insektspesifikke virus 1,6,7. I de senere år har det vært en økning i oppdagelsen av nye muskel- og skjelettlidelser, og noen av disse muskel- og skjelettbedriftene har vist seg å ha innvirkning på overføringen av MBV. For eksempel kan CxFV, som kan være en vedvarende infeksjon i Culex pipiens, undertrykke WNV-replikasjon på et tidlig stadium8. Et annet insektspesifikt flavivirus, cellefusjonsmiddelvirus (CFAV), har vist seg å hemme forplantningen av DENV og Zika-virus (ZIKV) i Aedes aegypti-mygg 9. Dermed er denne protokollen en nyttig tilnærming for å isolere myggassosierte virus og kan bidra til videre forskning på fordelingen av patogener relatert til mygg og kontroll av myggbårne sykdommer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3524</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 flasks</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Instrument for centrifugation of mosquito samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s minimal essential medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>medium for vertebrate cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feta Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141C</td>
			<td> 
			 
			Provide nutrition for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-speed low-temperature tissue homogenizer</td>
			<td>servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (28 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15410-122</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute&#160; medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td>medium for mosiquto cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL)</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile pestles</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y004</td>
			<td>Consumables&#160; for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y30</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the light traps MXA-02</td>
			<td>Maxttrac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The QIAamp viral RNA mini kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes

Med den brede anvendelsen av sekvenseringsteknologier har mange nye viruslignende sekvenser blitt oppdaget i leddyr, inkludert mygg. De to hovedkategoriene av disse nye myggassosierte virusene er "myggbårne virus (MBV)" og "myggspesifikke virus (MSV)". Disse nye virusene kan være patogene for både vertebrater og mygg, eller de kan bare være symbiotiske med mygg. Entitetsvirus er avgjørende for å bekrefte de biologiske tegnene til disse virusene. Det er derfor beskrevet en detaljert protokoll her for virusisolering og amplifisering fra feltinnsamlet mygg. Først ble myggprøvene fremstilt som supernatanter av mygghomogenater. Etter sentrifugering to ganger ble supernatantene deretter inokulert i enten myggcellelinje C6/36 eller virveldyrcellelinje BHK-21 for virusforsterkning. Etter 7 dager ble supernatantene samlet som P1-supernatanter og lagret ved -80 °C. Deretter ble P1-supernatanter passert to ganger til i C6/36- eller BHK-21-celler mens cellestatusen ble sjekket daglig. Når cytopatogen effekt (CPE) på cellene ble oppdaget, ble disse supernatantene samlet og brukt til å identifisere virus. Denne protokollen tjener som grunnlag for fremtidig forskning på myggassosierte virus, inkludert MBV og MSV.

Etter inokulering med mygghomogenatenes supernatanter (P0) viste C6/36-cellene et bredt intercellulært rom, og eksfolierte celler ble observert ved 120 timer (figur 1A) sammenlignet med de ikke-inokulerte cellene (kontroll) samtidig (figur 1B). Etter å ha inkubert BHK-21-cellene med P3-supernatantene, ble synlig CPE observert i BHK-21-cellene ved 48 timer (figur 1C) i motsetning til kontrollcellene (figur 1D</...

Watch this Scientific Journal Video about Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes at JoVE.com

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

Tallrike nye viruslignende sekvenser har blitt funnet i mygg på grunn av den omfattende bruken av sekvenseringsteknologier. Vi tilbyr en effektiv prosedyre for å isolere og forsterke virus ved hjelp av virveldyr og myggcellelinjer, som kan tjene som grunnlag for fremtidige studier på myggassosierte virus, inkludert myggbårne og myggspesifikke virus.

Myggassosiert virusisolering fra feltinnsamlede mygg

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

Denne protokollen er en nyttig tilnærming for å isolere myggassosierte virus og kan bidra til videre forskning på fordelingen av patogener relatert til mygg og kontroll av myggbårne sykdommer. Bruk av tynne linjer for å isolere virus i Biosafety nivå 2 laboratorium er tryggere og mer effektivt. I motsetning til andre virusisolasjonsprosedyrer, for eksempel sykling rød inokulering med varierende væske, krever denne teknikken ikke dyreforsøk eller etisk vurdering.Forurensningen fra prøver og cellene som tegner under inkubasjonen kan føre til at forsøket mislykkes. Derfor er det nødvendig å legge til 2% Penicillin-Streptomycin-Amphotericin i mediet for å forhindre forurensning. Begynn med tilsetning av tre millimeter keramiske perler, 1, 5 ml RPMI-medium supplert med 2% Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution i et to-milliliter sterilt rør plassert på is og overfør deretter 50 mygg i den.Deretter homogeniserer myggene med en lavtemperaturvevshomogenisator ved sliping i 30 sekunder ved 70 hertz og 4 grader Celsius i 3 sykluser. Sentrifuge homogenatet ved 15.000 g i 30 minutter ved 4 grader Celsius og overfør supernatantene til de nye rørene. For å fjerne myggavfallet helt, sentrifuge supernatanten igjen ved 15.000 G i 10 minutter ved 4 grader Celsius.Aliquot de 200 mikroliter supernatant P0 i et to-milliliter skrukork lagringsrør, og lagre det ved minus 80 grader Celsius. For virusforsterkningen, bruk Aedes albopictus RNAi-mangelfull myggcellelinje C6/36 og en virveldyrcellelinje, baby hamsternyre eller BHK-21 fra en 75-centimeter firkantet kolbe og frø dem i 24 brønnplater separat. Plasser den sådde 24-brønnplaten over natten ved 28 eller 37 grader Celsius.Neste dag, observer cellene under mikroskopet for å bekrefte 80 til 90% sammenløp i hver brønn. Forbered 500 ml av vedlikeholdsmediet for cellekultur supplert med antibiotika. Fjern cellekulturmediet fra de 24 brønnplatene og tilsett 100 mikroliter av vedlikeholdsmediet for cellekultur til hver brønn.Deretter inokulerer cellene med 100 mikroliter av supernatanten av mygghomogenatet eller P0. Inkuber platene ved 28 eller 37 grader Celsius i 60 minutter og rist forsiktig platene etter hvert 15. minutt for å forhindre tørking av cellene. Når du er ferdig, fjern supernatanten og skyll hver brønn med 600 mikroliter vedlikeholdsmedium for cellekultur for å fjerne ruskene helt. Deretter tilsettes 800 mikroliter cellekulturvedlikeholdsmedium til hver brønn før platene plasseres i en 5% karbondioksidfuktet inkubator ved 28 eller 37 grader Celsius i 7 dager.Daglig overvåke tilstanden til cellene i hver brønn under mikroskopet. På den syvende dagen, samle supernatanten av celler kjent som P1 og lagre den ved minus 80 grader Celsius. Gjenta prosedyren for å samle P2 og P3 virale supernatanter.På grunn av den cytopatogene effekten, eller CPE, dør celler fra noen av brønnene og løsner fra overflaten. For å forsterke virusene sterkt: Samle 300 til 400 mikroliter av supernatanten fra brønner som viser CPE-effekten og overfør den til en ny seksbrønnsplate med 80 til 90% cellekonfluens av kulturceller. Til slutt samler og overfører du 500 mikroliter av supernatanten fra brønnene på seksbrønnsplaten til to milliliter skruehettlagringsrør før de lagres ved minus 80 grader Celsius.Inokuleringen av C6/36-celler med mygghomogenatene P0 viste et bredt intercellulært rom i eksfolierte celler 120 timer etter infeksjonsperioden sammenlignet med de ikke-inokulerte eller kontrollcellene. Inkubasjon av BHK21-celler med P3-virale supernatanter viste en synlig CPE 48 timer etter infeksjon, og viste cellens død og løsrivelse fra overflaten i motsetning til kontrollcellene. Kommersielt tilgjengelige universelle primere eller flavivirus, alfavirus og bunyavirus ble brukt til å generere PCR-produktene for viral supernatant.Et PCR-produkt for Bunyavirus, Ebinur Lake-viruset, ble satt som en positiv kontroll. PCR-amplifikasjonsforbudene i baner som tilhører Bunyavirus og den positive kontrollen fremhevet muligheten for tilstedeværelse av Bunyavirus i supernatantene. For å forbedre suksessraten for virusisolering, hold en lav temperatur under prøvetransport, isolering og sliping.Legg til antibiotika når homogenisering av myggene og selve kulturen. Og håndtere kulturen raskt under inkubasjon og fjerning av kulturmediet. I tillegg til denne prosedyren kan slipeløsningen injiseres i en syklende rotte eller kyllingembryo.Bekreftelsesprosedyren vil imidlertid øke etiske bekymringer og øke utgiftene til eksperimentet.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex produksjonsplattform på EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolering av myofibroblasts fra Mouse and Human Esophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

En Multi-deteksjon analysen for Malaria Sending Mygg

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protokoller for Testing toksisitet av romanen Insecticidal kjemikalier til mygg

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Tvunget spyttsekresjon som metode for å analysere vektor kompetanse med mygg

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolering av høykvalitets murine atrielle og ventrikulære myocytter for samtidige målinger av ca2+ transienter og L-type kalsiumstrøm

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...