Name: mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes
Uploaded: 2022-08-31T13:20:00
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Este trabalho foi apoiado pelo Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).

1. Amostragem e triagem de mosquitos
<ol><li>Prender os mosquitos adultos através das armadilhas de luz MXA-02 ou armadilhas de mosquitos de dióxido de carbono no campo.</li>
	<li>Matar os mosquitos coletados mergulhando em nitrogênio líquido10,11. Transportá-los para o laboratório pelo sistema logístico da cadeia de frio12. NOTA: O gelo seco foi usado principalmente no sistema logístico da cadeia fria.</li>
	...

<ol>
	<li>Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-associated+viruses+in+China.">Mosquito-associated viruses in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+distribution+and+diversity+of+mosquito-associated+viruses+and+their+mosquito+vectors+in+China.">A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China.</a> Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+global+distribution+of+novel+mosquito-associated+viruses+in+the+last+decade+(2007-2017).">The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017).</a> Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+metagenomic+profiling+of+viromes+associated+with+four+common+mosquito+species+in+China.">Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).</li><li>Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+viruses+and+non-human+vertebrates+in+Australia:+A+review.">Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review.</a> Viruses. 13 (2), 265 (2021).</li><li>Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+viruses-transmission+and+interaction.">Mosquito-specific viruses-transmission and interaction.</a> Viruses. 11 (9), 873 (2019).</li><li>Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+and+mosquito-borne+viruses:+evolution,+infection,+and+host+defense.">Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense.</a> Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).</li><li>Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+dynamics+of+an+insect-specific+flavivirus+in+a+naturally+infected+Culex+pipiens+laboratory+colony+and+effects+of+co-infection+on+vector+competence+for+West+Nile+virus.">Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus.</a> Virology. 427 (2), 90-97 (2012).</li><li>Baidaliuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-fusing+agent+virus+reduces+arbovirus+dissemination+in+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+vivo.">Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo.</a> Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+virome+analysis+of+Culex+mosquitoes+from+Kenya+and+China.">Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China.</a> Viruses. 10 (1), 30 (2018).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+isolation+and+characterization+of+a+group+C+Banna+virus+(BAV)+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Hubei,+China.">First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China.</a> Viruses. 10 (10), 555 (2018).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+the+virome+in+lab-+and+field-collected+Aedes+albopictus+mosquitoes+across+different+developmental+stages+and+possible+core+viruses+in+the+publicly+available+virome+data+of+Aedes+mosquitoes.">Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes.</a> mSystems. 5 (5), 00640 (2020).</li><li>Zhou, M., Chu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+main+mosquito+species+in+China+based+on+DNA+barcoding.">Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding.</a> Plos One. 7 (10), (2012).</li><li>Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bold:+The+Barcode+of+Life+Data+System+(www.barcodinglife.org).">Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org).</a> Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+new+strain+of+mosquito+Flavivirus+derived+from+Culicoides.">In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides.</a> Viruses. 14 (6), 1298 (2022).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+Tanay+virus+isolated+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Yunnan,+China.">Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).</li><li>Ren, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+reassortment+Tibet+orbivirus+isolated+from+Culicoides+spp.+in+Yunnan,+PR+China.">Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China.</a> Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).</li></ol>

O objetivo deste método foi oferecer uma maneira prática de isolar vírus associados a mosquitos usando várias linhagens celulares. É fundamental adicionar o Antibiotico-Antimicótico (Penicilina-Estreptomicina-Anfotericina) aos sobrenadantes dos homogeneizados do mosquito para evitar a contaminação por bactérias ou fungos. Os mosquitos e sobrenadantes virais obtidos no campo devem ser refrigerados a -80 °C para evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.
Outro passo crít...

Os mosquitos são um grupo de importantes artrópodes vetores patogênicos. Existem aproximadamente 3.500 espécies de mosquitos na família Culicidae 1,2. O desenvolvimento de tecnologias de sequenciamento de alto rendimento levou à descoberta de muitas sequências novas semelhantes a vírus em mosquitos de diferentes partes do mundo3. Geralmente, esses vírus associados a mosquitos podem ser classificados em dois grupos principais: MBVs e MSVs.
Os MBVs são um grupo de diversos vírus que são agentes causadores de muitas doenças humanas ou animais, como o vírus da febre amarela (YFV), o vírus da dengue (DENV), o vírus da encefalite japonesa (JEV), o vírus do Nilo Ocidental (WNV) e o vírus da febre do Vale do Rift (RVFV)4. Eles têm ameaçado seriamente a saúde pública, causando morbidade e mortalidade graves em humanos e animais em todo o mundo. Os MBVs sustentam naturalmente um ciclo de vida entre diversos hospedeiros através da transmissão de um mosquito infectado para um hospedeiro ingênuo, bem como de um hospedeiro infectado por vírus e para um mosquito alimentador5. Portanto, esses vírus podem infectar tanto linhagens celulares de mosquitos quanto linhagens de células de vertebrados em laboratório1.
Os MSVs, que incluem os vírus Yichang (YCN), Culex flavivirus (CxFV) e Chaoyang virus (CHAOV), constituem um subgrupo de vírus insetos-específicos 1,6,7. Nos últimos anos, houve um aumento na descoberta de novos MSVs, e alguns desses MSVs foram encontrados para ter um impacto na transmissão de MBVs. Por exemplo, o CxFV, que pode ser uma infecção persistente em Culex pipiens, poderia suprimir a replicação do WNV em um estágio inicial8. Outro flavivírus específico de um inseto, o vírus do agente de fusão celular (CFAV), inibiu a propagação do DENV e do vírus Zika (ZIKV) em mosquitos Aedes aegypti 9. Assim, este protocolo é uma abordagem útil para o isolamento de vírus associados a mosquitos e pode ajudar em futuras pesquisas sobre a distribuição de patógenos relacionados a mosquitos e o controle de doenças transmitidas por mosquitos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3524</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 flasks</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Instrument for centrifugation of mosquito samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s minimal essential medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>medium for vertebrate cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feta Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141C</td>
			<td> 
			 
			Provide nutrition for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-speed low-temperature tissue homogenizer</td>
			<td>servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (28 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15410-122</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute&#160; medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td>medium for mosiquto cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL)</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile pestles</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y004</td>
			<td>Consumables&#160; for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y30</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the light traps MXA-02</td>
			<td>Maxttrac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The QIAamp viral RNA mini kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes

Com a ampla aplicação de tecnologias de sequenciamento, muitas novas sequências semelhantes a vírus foram descobertas em artrópodes, incluindo mosquitos. As duas principais categorias desses novos vírus associados a mosquitos são "vírus transmitidos por mosquitos (MBVs)" e "vírus específicos de mosquitos (MSVs)". Esses novos vírus podem ser patogênicos para vertebrados e mosquitos, ou podem ser apenas simbióticos com mosquitos. Vírus de entidade são essenciais para confirmar os caracteres biológicos desses vírus. Assim, um protocolo detalhado foi descrito aqui para isolamento e amplificação de vírus a partir de mosquitos coletados em campo. Primeiramente, as amostras de mosquitos foram preparadas como sobrenadantes de homogeneizados de mosquitos. Após centrifugação duas vezes, os sobrenadantes foram inoculados na linhagem celular de mosquito C6/36 ou na linhagem celular de vertebrado BHK-21 para amplificação do vírus. Após 7 dias, os sobrenadantes foram coletados como sobrenadantes P1 e armazenados a -80 °C. Em seguida, os sobrenadantes P1 foram passados mais duas vezes em células C6/36 ou BHK-21 enquanto o status celular estava sendo verificado diariamente. Quando o efeito citopatogênico (CPE) sobre as células foi descoberto, esses sobrenadantes foram coletados e usados para identificar vírus. Este protocolo serve como base para pesquisas futuras sobre vírus associados a mosquitos, incluindo MBVs e MSVs.

Após a inoculação com os sobrenadantes dos homogeneizados do mosquito (P0), as células C6/36 exibiram um amplo espaço intercelular, e células esfoliadas foram observadas em 120 h (Figura 1A) em comparação com as células não inoculadas (controle) ao mesmo tempo (Figura 1B). Após incubação das células BHK-21 com o sobrenadante P3, observou-se CPE visível nas células BHK-21 em 48 h (Figura 1C), em contraste com as célu...

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Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

Numerosas novas sequências semelhantes a vírus foram encontradas em mosquitos devido ao uso extensivo de tecnologias de sequenciamento. Fornecemos um procedimento eficaz para isolar e amplificar vírus usando linhagens celulares de vertebrados e mosquitos, que pode servir de base para estudos futuros sobre vírus associados a mosquitos, incluindo vírus transmitidos por mosquitos e específicos por mosquitos.

Isolamento de vírus associados a mosquitos coletados em campo

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

Este protocolo é uma abordagem útil para o isolamento de vírus associados a mosquitos e pode ajudar em futuras pesquisas sobre a distribuição de patógenos relacionados a mosquitos e o controle de doenças transmitidas por mosquitos. Usar linhas finas para isolar vírus em laboratório de nível 2 de biossegurança é mais seguro e eficiente. Ao contrário de outros procedimentos de isolamento do vírus, como a inoculação ciclável vermelha com fluido variável, esta técnica não requer experimentação animal ou avaliação ética.A contaminação das amostras e da retirada das células durante a incubação pode levar ao fracasso do experimento. Assim, é necessário adicionar 2% Penicilina-Estreptomicina-Anfotericina no meio para evitar contaminação. Comece com a adição de esferas cerâmicas de três milímetros, 1,5 mililitros de meio RPMI suplementado com solução de 2% de penicilina-estreptomicina-anfotericina B em um tubo estéril de dois mililitros colocado no gelo e, em seguida, transfira 50 mosquitos nele.Em seguida, homogeneizar os mosquitos com um homogeneizador de tecido a baixa temperatura, triturando por 30 segundos a 70 hertz e 4 graus Celsius por 3 ciclos. Centrifugar o homogeneizado a 15.000 G por 30 minutos a 4 graus Celsius e transferir os sobrenadantes para os novos tubos. Para remover os detritos do mosquito completamente, centrifugar o sobrenadante novamente a 15.000 G por 10 minutos a 4 graus Celsius.Aliquot os 200 microlitros de sobrenadante P0 em um tubo de armazenamento de tampa de rosca de dois mililitros, e armazená-lo a menos 80 graus Celsius. Para a amplificação do vírus, use a linhagem C6/36 de células de mosquito Deficiente em RNAi de Aedes albopictus e uma linhagem de células de vertebrados, rim de hamster bebê ou BHK-21 de um frasco quadrado de 75 centímetros e semeá-los em placas de 24 poços separadamente. Coloque a placa de 24 poços semeada durante a noite a 28 ou 37 graus Celsius.No dia seguinte, observe as células ao microscópio para confirmar 80 a 90% de confluência em cada poço. Preparar 500 mililitros do meio de manutenção de cultura celular suplementado com antibióticos. Retirar o meio de cultura celular das placas de 24 poços e adicionar 100 microlitros do meio de manutenção de cultura celular a cada poço.Em seguida, inocular as células com 100 microlitros do sobrenadante do homogeneizado do mosquito ou P0. Incubar as placas a 28 ou 37 graus Celsius por 60 minutos e agitar suavemente as placas a cada 15 minutos para evitar o ressecamento das células. Uma vez feito, remova o sobrenadante e enxágue cada poço com 600 microlitros de meio de manutenção de cultura celular para remover os detritos completamente. Em seguida, adicione 800 microlitros de meio de manutenção de cultura celular a cada poço antes de colocar as placas em uma incubadora umidificada de dióxido de carbono a 5% a 28 ou 37 graus Celsius por 7 dias.Monitorar diariamente o estado das células de cada poço sob o microscópio. No sétimo dia, colete o sobrenadante das células conhecidas como P1 e armazene-o a 80 graus Celsius negativos. Repita o procedimento para coletar sobrenadantes virais P2 e P3.Devido ao efeito citopatogênico, ou CPE, as células de alguns dos poços morrem e se desprendem da superfície. Para amplificar grandemente os vírus: Coletar 300 a 400 microlitros do sobrenadante de poços mostrando o efeito CPE e transferi-lo para uma nova placa de seis poços com 80 a 90% de confluência celular de células de cultura. Finalmente, colete e transfira 500 microlitros do sobrenadante dos poços da placa de seis poços para tubos de armazenamento de tampa de rosca de dois mililitros antes de armazená-los a 80 graus Celsius negativos.A inoculação de células C6/36 com os homogeneizados de mosquito P0 exibiu um amplo espaço intercelular nas células esfoliadas no período de 120 horas pós-infecção em comparação com as células não inoculadas ou controle. A incubação das células BHK21 com o sobrenadante viral P3 demonstrou um ECP visível em 48 horas pós-infecção, mostrando a morte da célula e descolamento da superfície em contraste com as células controle. Iniciadores universais comercialmente disponíveis ou Flavivírus, Alphavírus e Bunyavírus foram usados para gerar os produtos de PCR para o sobrenadante viral.Um produto de PCR para o Bunyavirus, Ebinur Lake virus, foi definido como um controle positivo. A proibição de amplificação por PCR em pistas pertencentes a Bunyavirus e o controle positivo destacaram a possibilidade da presença de Bunyavirus nos sobrenadantes. Para melhorar a taxa de sucesso do isolamento do vírus, mantenha uma temperatura baixa durante o transporte, isolamento e moagem da amostra.Adicione antibióticos ao homogeneizar os mosquitos e a própria cultura. E manusear a cultura rapidamente durante a incubação e a remoção do meio de cultura. Além deste procedimento, a solução de moagem pode ser injetada em um embrião de rato ou galinha.No entanto, o procedimento de afirmação levantará preocupações éticas e aumentará o custo do experimento.

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