Name: mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes
Uploaded: 2022-08-31T13:20:00
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Este trabajo fue apoyado por el Proyecto del Plan de Ciencia y Tecnología de Wuhan (2018201261638501).

1. Muestreo y clasificación de mosquitos
<ol><li>Atrape a los mosquitos adultos a través de las trampas de luz MXA-02 o trampas de mosquitos de dióxido de carbono en el campo.</li>
	<li>Mata a los mosquitos recolectados sumergiéndolos en nitrógeno líquido10,11. Transportarlos al laboratorio mediante el sistema logístico de cadena de frío12. NOTA: El hielo seco se utilizó principalmente en el sistema logístic...

<ol>
	<li>Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-associated+viruses+in+China.">Mosquito-associated viruses in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+distribution+and+diversity+of+mosquito-associated+viruses+and+their+mosquito+vectors+in+China.">A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China.</a> Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+global+distribution+of+novel+mosquito-associated+viruses+in+the+last+decade+(2007-2017).">The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017).</a> Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+metagenomic+profiling+of+viromes+associated+with+four+common+mosquito+species+in+China.">Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).</li><li>Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+viruses+and+non-human+vertebrates+in+Australia:+A+review.">Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review.</a> Viruses. 13 (2), 265 (2021).</li><li>Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+viruses-transmission+and+interaction.">Mosquito-specific viruses-transmission and interaction.</a> Viruses. 11 (9), 873 (2019).</li><li>Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+and+mosquito-borne+viruses:+evolution,+infection,+and+host+defense.">Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense.</a> Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).</li><li>Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+dynamics+of+an+insect-specific+flavivirus+in+a+naturally+infected+Culex+pipiens+laboratory+colony+and+effects+of+co-infection+on+vector+competence+for+West+Nile+virus.">Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus.</a> Virology. 427 (2), 90-97 (2012).</li><li>Baidaliuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-fusing+agent+virus+reduces+arbovirus+dissemination+in+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+vivo.">Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo.</a> Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+virome+analysis+of+Culex+mosquitoes+from+Kenya+and+China.">Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China.</a> Viruses. 10 (1), 30 (2018).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+isolation+and+characterization+of+a+group+C+Banna+virus+(BAV)+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Hubei,+China.">First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China.</a> Viruses. 10 (10), 555 (2018).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+the+virome+in+lab-+and+field-collected+Aedes+albopictus+mosquitoes+across+different+developmental+stages+and+possible+core+viruses+in+the+publicly+available+virome+data+of+Aedes+mosquitoes.">Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes.</a> mSystems. 5 (5), 00640 (2020).</li><li>Zhou, M., Chu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+main+mosquito+species+in+China+based+on+DNA+barcoding.">Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding.</a> Plos One. 7 (10), (2012).</li><li>Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bold:+The+Barcode+of+Life+Data+System+(www.barcodinglife.org).">Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org).</a> Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+new+strain+of+mosquito+Flavivirus+derived+from+Culicoides.">In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides.</a> Viruses. 14 (6), 1298 (2022).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+Tanay+virus+isolated+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Yunnan,+China.">Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).</li><li>Ren, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+reassortment+Tibet+orbivirus+isolated+from+Culicoides+spp.+in+Yunnan,+PR+China.">Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China.</a> Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).</li></ol>

El objetivo de este método era ofrecer una forma práctica de aislar virus asociados a mosquitos utilizando varias líneas celulares. Es fundamental añadir el antibiótico-antimicótico (penicilina-estreptomicina-anfotericina) a los sobrenadantes de los homogeneizados del mosquito para evitar la contaminación por bacterias u hongos. Los mosquitos y sobrenadantes virales obtenidos en el campo deben refrigerarse a -80 °C para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación.
Otro paso...

Los mosquitos son un grupo de importantes artrópodos patógenos vectores. Hay aproximadamente 3.500 especies de mosquitos en la familia Culicidae 1,2. El desarrollo de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento ha llevado al descubrimiento de muchas secuencias novedosas similares a virus en mosquitos de diferentes partes del mundo3. En general, estos virus asociados a mosquitos se pueden clasificar en dos grupos principales: MBV y MSV.
Los MBV son un grupo de virus diversos que son agentes causantes de muchas enfermedades humanas o animales, como el virus de la fiebre amarilla (YFV), el virus del dengue (DENV), el virus de la encefalitis japonesa (JEV), el virus del Nilo Occidental (WNV) y el virus de la fiebre del Valle del Rift (RVFV)4. Han amenazado gravemente la salud pública al causar morbilidad y mortalidad graves tanto en humanos como en animales en todo el mundo. Los MBV mantienen naturalmente un ciclo de vida entre diversos huéspedes a través de la transmisión de un mosquito infectado a un huésped ingenuo, así como de un huésped infectado por virus y a un mosquito que se alimenta5. Por lo tanto, estos virus pueden infectar tanto líneas celulares de mosquitos como líneas celulares de vertebrados en el laboratorio1.
Los MSV, que incluyen el virus Yichang (YCN), el flavivirus Culex (CxFV) y el virus Chaoyang (CHAOV), son un subgrupo de virus específicos de insectos 1,6,7. En los últimos años, ha habido un aumento en el descubrimiento de nuevos MSV, y se ha encontrado que algunos de estos MSV tienen un impacto en la transmisión de MBV. Por ejemplo, CxFV, que puede ser una infección persistente en Culex pipiens, podría suprimir la replicación del VNO en una etapa temprana8. Se ha encontrado que otro flavivirus específico de insectos, el virus del agente fusionador celular (CFAV), inhibe la propagación del virus DENV y Zika (ZIKV) en mosquitos Aedes aegypti 9. Por lo tanto, este protocolo es un enfoque útil para aislar los virus asociados a los mosquitos y puede ayudar en futuras investigaciones sobre la distribución de patógenos relacionados con los mosquitos y el control de las enfermedades transmitidas por mosquitos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3524</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 flasks</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Instrument for centrifugation of mosquito samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s minimal essential medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>medium for vertebrate cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feta Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141C</td>
			<td> 
			 
			Provide nutrition for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-speed low-temperature tissue homogenizer</td>
			<td>servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (28 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15410-122</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute&#160; medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td>medium for mosiquto cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL)</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile pestles</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y004</td>
			<td>Consumables&#160; for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y30</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the light traps MXA-02</td>
			<td>Maxttrac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The QIAamp viral RNA mini kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes

Con la amplia aplicación de tecnologías de secuenciación, se han descubierto muchas secuencias nuevas similares a virus en artrópodos, incluidos los mosquitos. Las dos categorías principales de estos nuevos virus asociados a mosquitos son "virus transmitidos por mosquitos (MBV)" y "virus específicos de mosquitos (MSV)". Estos nuevos virus podrían ser patógenos tanto para los vertebrados como para los mosquitos, o simplemente podrían ser simbióticos con los mosquitos. Los virus de entidad son esenciales para confirmar las características biológicas de estos virus. Por lo tanto, aquí se ha descrito un protocolo detallado para el aislamiento y la amplificación del virus de los mosquitos recolectados en el campo. Primero, las muestras de mosquitos se prepararon como sobrenadantes de homogeneizados de mosquitos. Después de la centrifugación dos veces, los sobrenadantes se inocularon en la línea celular de mosquito C6/36 o en la línea celular de vertebrados BHK-21 para la amplificación del virus. Después de 7 días, los sobrenadantes se recolectaron como sobrenadantes P1 y se almacenaron a -80 °C. A continuación, los sobrenadantes P1 se pasaron dos veces más en las células C6/36 o BHK-21 mientras se verificaba diariamente el estado de la célula. Cuando se descubrió el efecto citopatogénico (CPE) en las células, estos sobrenadantes se recolectaron y se utilizaron para identificar virus. Este protocolo sirve como base para futuras investigaciones sobre virus asociados a mosquitos, incluidos MBV y MSV.

Después de la inoculación con los sobrenadantes de los homogeneizados del mosquito (P0), las células C6/36 exhibieron un amplio espacio intercelular, y las células exfoliadas se observaron a las 120 h (Figura 1A) en comparación con las células no inoculadas (control) al mismo tiempo (Figura 1B). Después de incubar las células BHK-21 con los sobrenadantes P3, se observó CPE visible en las células BHK-21 a las 48 h (Figura 1C</strong...

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Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

Se han encontrado numerosas secuencias nuevas similares a virus en mosquitos debido al uso extensivo de tecnologías de secuenciación. Proporcionamos un procedimiento eficaz para aislar y amplificar virus utilizando líneas celulares de vertebrados y mosquitos, que podría servir como base para futuros estudios sobre virus asociados a mosquitos, incluidos los virus transmitidos por mosquitos y específicos de mosquitos.

Aislamiento de virus asociados a mosquitos de mosquitos recolectados en el campo

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

Este protocolo es un enfoque útil para aislar virus asociados a mosquitos y puede ayudar en futuras investigaciones sobre la distribución de patógenos relacionados con los mosquitos y el control de enfermedades transmitidas por mosquitos. El uso de líneas delgadas para aislar virus en el laboratorio de nivel 2 de bioseguridad es más seguro y eficiente. A diferencia de otros procedimientos de aislamiento del virus, como la inoculación roja ciclista con fluidos variables, esta técnica no requiere experimentación animal o evaluación ética.La contaminación de las muestras y la extracción de células durante la incubación puede llevar al fracaso del experimento. Por lo tanto, es necesario agregar 2% de penicilina-estreptomicina-anfotericina en el medio para evitar la contaminación. Comience con la adición de perlas de cerámica de tres milímetros, 1.5 mililitros de RPMI medio complementado con una solución de penicilina-estreptomicina-anfotericina B al 2% en un tubo estéril de dos mililitros colocado en hielo y luego transfiera 50 mosquitos en él.A continuación, homogeneice los mosquitos con un homogeneizador de tejido a baja temperatura moliendo durante 30 segundos a 70 hercios y 4 grados centígrados durante 3 ciclos. Centrifugar el homogeneizado a 15, 000 G durante 30 minutos a 4 grados centígrados y transferir los sobrenadantes a los nuevos tubos. Para eliminar los restos de mosquitos por completo, centrifugar el sobrenadante nuevamente a 15, 000 G durante 10 minutos a 4 grados centígrados.Alícuota los 200 microlitros de sobrenadante P0 en un tubo de almacenamiento de tapón de rosca de dos mililitros y guárdelo a menos 80 grados centígrados. Para la amplificación del virus, use la línea celular de mosquito deficiente en ARN C6/36 de Aedes albopictus y una línea celular de vertebrados, riñón de hámster bebé o BHK-21 de un matraz cuadrado de 75 centímetros y siembrarlos en placas de 24 pocillos por separado. Coloque la placa sembrada de 24 pozos durante la noche a 28 o 37 grados centígrados.Al día siguiente, observe las células bajo el microscopio para confirmar una confluencia del 80 al 90% en cada pocillo. Preparar 500 mililitros del medio de mantenimiento del cultivo celular suplementado con antibióticos. Retire el medio de cultivo celular de las placas de 24 pocillos y agregue 100 microlitros del medio de mantenimiento de cultivo celular a cada pocillo.Luego inocular las células con 100 microlitros del sobrenadante del mosquito homogeneizado o P0. Incubar las placas a 28 o 37 grados centígrados durante 60 minutos y agitar suavemente las placas después de cada 15 minutos para evitar el secado de las células. Una vez hecho esto, retire el sobrenadante y enjuague cada pozo con 600 microlitros de medio de mantenimiento de cultivo celular para eliminar los residuos por completo. A continuación, agregue 800 microlitros de medio de mantenimiento de cultivo celular a cada pocillo antes de colocar las placas en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5% a 28 o 37 grados centígrados durante 7 días.Monitoree diariamente el estado de las células de cada pocillo bajo el microscopio. En el séptimo día, recoja el sobrenadante de las células conocido como P1 y guárdelo a menos 80 grados centígrados. Repita el procedimiento para recolectar sobrenadantes virales P2 y P3.Debido al efecto citopatogénico, o CPE, las células de algunos de los pozos mueren y se desprenden de la superficie. Para amplificar en gran medida los virus, recolecte de 300 a 400 microlitros del sobrenadante de los pozos que muestran el efecto CPE y transfiéralo a una nueva placa de seis pocillos que tenga una confluencia celular del 80 al 90% de células de cultivo. Finalmente, recoja y transfiera 500 microlitros del sobrenadante de los pocillos de la placa de seis pocillos a los tubos de almacenamiento de tapón de rosca de dos mililitros antes de almacenarlos a menos 80 grados centígrados.La inoculación de células C6/36 con los homogeneizados de mosquitos P0 exhibió un amplio espacio intercelular en las células exfoliadas a las 120 horas después del período de infección en comparación con las células no inoculadas o control. La incubación de células BHK21 con los sobrenadantes virales P3 demostró un CPE visible a las 48 horas posteriores a la infección, mostrando la muerte de la célula y el desprendimiento de la superficie en contraste con las células de control. Se utilizaron cebadores universales disponibles comercialmente o Flavivirus, Alphaviruses y Bunyavirus para generar los productos de PCR para el sobrenadante viral.Un producto de PCR para el Bunyavirus, el virus Ebinur Lake, se estableció como un control positivo. Las prohibiciones de amplificación por PCR en carriles pertenecientes a Bunyavirus y el control positivo destacaron la posibilidad de la presencia de Bunyavirus en los sobrenadantes. Para mejorar la tasa de éxito del aislamiento del virus, mantenga una temperatura baja durante el transporte, aislamiento y molienda de la muestra.Agregue antibióticos al homogeneizar los mosquitos y el cultivo en sí. Y manejar el cultivo rápidamente durante la incubación y la eliminación del medio de cultivo. Además de este procedimiento, la solución de molienda se puede inyectar en un embrión de rata ciclista o pollo.Sin embargo, el procedimiento de afirmación planteará preocupaciones éticas y aumentará el costo del experimento.

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