Name: mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes
Uploaded: 2022-08-31T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes at JoVE.com

Bu çalışma Wuhan Bilim ve Teknoloji Planı Projesi (2018201261638501) tarafından desteklenmiştir.

1. Sivrisinek örnekleme ve sıralama
<ol><li>Yetişkin sivrisinekleri ışık tuzakları MXA-02 veya sahadaki karbondioksit sivrisinek tuzaklarından yakalayın.</li>
	<li>Toplanan sivrisinekleri sıvı azot10,11'e batırarak öldürün. Soğuk zincir lojistik sistemi ile laboratuvara taşınması12. NOT: Kuru buz öncelikle soğuk zincir lojistik sisteminde kullanılmıştır.</li>
	<li>(İsteğe bağlı) Numune ala...

<ol>
	<li>Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-associated+viruses+in+China.">Mosquito-associated viruses in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+distribution+and+diversity+of+mosquito-associated+viruses+and+their+mosquito+vectors+in+China.">A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China.</a> Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+and+global+distribution+of+novel+mosquito-associated+viruses+in+the+last+decade+(2007-2017).">The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017).</a> Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+metagenomic+profiling+of+viromes+associated+with+four+common+mosquito+species+in+China.">Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).</li><li>Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+viruses+and+non-human+vertebrates+in+Australia:+A+review.">Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review.</a> Viruses. 13 (2), 265 (2021).</li><li>Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+viruses-transmission+and+interaction.">Mosquito-specific viruses-transmission and interaction.</a> Viruses. 11 (9), 873 (2019).</li><li>Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-specific+and+mosquito-borne+viruses:+evolution,+infection,+and+host+defense.">Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense.</a> Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).</li><li>Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+dynamics+of+an+insect-specific+flavivirus+in+a+naturally+infected+Culex+pipiens+laboratory+colony+and+effects+of+co-infection+on+vector+competence+for+West+Nile+virus.">Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus.</a> Virology. 427 (2), 90-97 (2012).</li><li>Baidaliuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-fusing+agent+virus+reduces+arbovirus+dissemination+in+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+vivo.">Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo.</a> Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).</li><li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+virome+analysis+of+Culex+mosquitoes+from+Kenya+and+China.">Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China.</a> Viruses. 10 (1), 30 (2018).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+isolation+and+characterization+of+a+group+C+Banna+virus+(BAV)+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Hubei,+China.">First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China.</a> Viruses. 10 (10), 555 (2018).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+the+virome+in+lab-+and+field-collected+Aedes+albopictus+mosquitoes+across+different+developmental+stages+and+possible+core+viruses+in+the+publicly+available+virome+data+of+Aedes+mosquitoes.">Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes.</a> mSystems. 5 (5), 00640 (2020).</li><li>Zhou, M., Chu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+main+mosquito+species+in+China+based+on+DNA+barcoding.">Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding.</a> Plos One. 7 (10), (2012).</li><li>Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bold:+The+Barcode+of+Life+Data+System+(www.barcodinglife.org).">Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org).</a> Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+new+strain+of+mosquito+Flavivirus+derived+from+Culicoides.">In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides.</a> Viruses. 14 (6), 1298 (2022).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+Tanay+virus+isolated+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Yunnan,+China.">Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).</li><li>Ren, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+reassortment+Tibet+orbivirus+isolated+from+Culicoides+spp.+in+Yunnan,+PR+China.">Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China.</a> Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).</li></ol>

Bu yöntemin amacı, çeşitli hücre hatlarını kullanarak sivrisinek ile ilişkili virüsleri izole etmek için pratik bir yol sunmaktı. Bakteri veya mantarların kontaminasyonunu önlemek için sivrisinek homojenatlarının süpernatantlarına Antibiyotik-Antimikotik (Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin) eklemek çok önemlidir. Sahada elde edilen sivrisinekler ve viral süpernatantlar, tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için -80 ° C'de soğutulmalıdır.
Protokoldeki bi...

Sivrisinekler, önemli patojenik eklembacaklı vektörlerin bir grubudur. Culicidae 1,2 familyasında yaklaşık 3.500 sivrisinek türü vardır. Yüksek verimli dizileme teknolojilerinin geliştirilmesi, dünyanın farklı yerlerinden gelen sivrisineklerde birçok yeni, virüs benzeri dizinin keşfedilmesine yol açmıştır3. Genel olarak, bu sivrisinek ile ilişkili virüsler iki ana gruba ayrılabilir: MBV'ler ve MSV'ler.
MBV'ler, sarı humma virüsü (YFV), dang virüsü (DENV), Japon ensefalit virüsü (JEV), Batı Nil virüsü (WNV) ve Rift Vadisi ateş virüsü (RVFV)4 gibi birçok insan veya hayvan hastalığının etken maddeleri olan çeşitli virüslerden oluşan bir gruptur. Tüm dünyada hem insanlarda hem de hayvanlarda ciddi morbidite ve mortaliteye neden olarak halk sağlığını ciddi şekilde tehdit etmişlerdir. MBV'ler, enfekte bir sivrisinekten naif bir konakçıya, ayrıca virüs bulaşmış bir konakçıdan ve beslenen bir sivrisineğe bulaşma yoluyla çeşitli konakçılar arasında doğal olarak bir yaşam döngüsünü sürdürür5. Bu nedenle, bu virüsler laboratuar1'de hem sivrisinek hücre hatlarını hem de omurgalı hücre hatlarını enfekte edebilir.
Yichang virüsü (YCN), Culex flavivirüsü (CxFV) ve Chaoyang virüsü (CHAOV) içeren MSV'ler, böceklere özgü virüslerin bir alt grubudur 1,6,7. Son yıllarda, yeni MSV'lerin keşfinde bir artış olmuştur ve bu MSV'lerin bazılarının MBV'lerin iletimi üzerinde bir etkisi olduğu bulunmuştur. Örneğin, Culex pipiens'te kalıcı bir enfeksiyon olabilen CxFV, WNV replikasyonunu erken bir aşama8'de baskılayabilir. Başka bir böceğe özgü flavivirüs, hücre kaynaştırıcı ajan virüsü (CFAV), Aedes aegypti sivrisineklerinde DENV ve Zika virüsünün (ZIKV) yayılmasını inhibe ettiği bulunmuştur9. Bu nedenle, bu protokol sivrisinek ile ilişkili virüsleri izole etmek için yararlı bir yaklaşımdır ve sivrisineklerle ilgili patojenlerin dağılımı ve sivrisinek kaynaklı hastalıkların kontrolü konusunda daha fazla araştırmada yardımcı olabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3524</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 flasks</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>Containers for cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated nucleic acid extraction system</td>
			<td>NanoMagBio</td>
			<td>S-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6/36 cells</td>
			<td>National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal machine</td>
			<td>Himac</td>
			<td>CF16RN</td>
			<td>Instrument for centrifugation of mosquito samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s minimal essential medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>medium for vertebrate cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebinur Lake virus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cu20-XJ isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feta Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141C</td>
			<td> 
			 
			Provide nutrition for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-speed low-temperature tissue homogenizer</td>
			<td>servicebio</td>
			<td>KZ-III-F</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (28 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator (37 &#176;C)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td>Instrument for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15410-122</td>
			<td>Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator (-80 &#176;C)</td>
			<td>sanyo</td>
			<td>MDF-U54V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute&#160; medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td>medium for mosiquto cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap storage tubes (2 mL)</td>
			<td>biofil</td>
			<td>&#160;FCT010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile pestles</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y004</td>
			<td>Consumables&#160; for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y30</td>
			<td>Instrument for grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The dissecting microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the light traps MXA-02</td>
			<td>Maxttrac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The mosquito absorbing machine</td>
			<td>Ningbo Bangning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The pipette tips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The QIAamp viral RNA mini kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mosquito-associated virus isolation from field-collected mosquitoes

Dizileme teknolojilerinin geniş uygulamasıyla, sivrisinekler de dahil olmak üzere eklembacaklılarda birçok yeni virüs benzeri dizi keşfedilmiştir. Bu yeni sivrisinek ilişkili virüslerin iki ana kategorisi "sivrisinek kaynaklı virüsler (MBV'ler)" ve "sivrisineğe özgü virüsler (MSV'ler)" dir. Bu yeni virüsler hem omurgalılar hem de sivrisinekler için patojenik olabilir veya sadece sivrisineklerle simbiyotik olabilirler. Varlık virüsleri, bu virüslerin biyolojik karakterlerini doğrulamak için gereklidir. Bu nedenle, burada virüs izolasyonu ve sahada toplanan sivrisineklerden amplifikasyon için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. İlk olarak, sivrisinek örnekleri sivrisinek homojenatlarının süpernatantları olarak hazırlandı. İki kez santrifüjlemeden sonra, süpernatanlar daha sonra virüs amplifikasyonu için sivrisinek hücre hattı C6/36 veya omurgalı hücre hattı BHK-21'e aşılandı. 7 gün sonra, süpernatantlar P1 süpernatantları olarak toplandı ve -80 ° C'de depolandı. Daha sonra, hücre durumu günlük olarak kontrol edilirken, P1 süpernatantları C6/36 veya BHK-21 hücrelerinde iki kez daha geçirildi. Hücreler üzerindeki sitopatojenik etki (CPE) keşfedildiğinde, bu süpernatanlar toplandı ve virüsleri tanımlamak için kullanıldı. Bu protokol, MBV'ler ve MSV'ler de dahil olmak üzere sivrisinek ile ilişkili virüsler hakkında gelecekteki araştırmaların temelini oluşturur.

Sivrisinek homojenatlarının süpernatantları (P0) ile aşılamadan sonra, C6/36 hücreleri geniş bir hücreler arası boşluk sergiledi ve pul pul dökülmüş hücreler 120 saatte (Şekil 1A) aynı anda aşılanmamış hücrelere (kontrol) kıyasla gözlendi (Şekil 1B). BHK-21 hücrelerini P3 süpernatantları ile inkübe ettikten sonra, BHK-21 hücrelerinde kontrol hücrelerinin aksine 48 saatte (Şekil 1C) görünür CPE gö...

Watch this Scientific Journal Video about Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes at JoVE.com

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

Dizileme teknolojilerinin yaygın kullanımı nedeniyle sivrisineklerde çok sayıda yeni virüs benzeri sekans bulunmuştur. Omurgalı ve sivrisinek hücre hatlarını kullanarak virüsleri izole etmek ve büyütmek için etkili bir prosedür sunuyoruz; bu, sivrisinek kaynaklı ve sivrisineğe özgü virüsler de dahil olmak üzere sivrisinekle ilişkili virüsler üzerine gelecekteki çalışmaların temelini oluşturabilir.

Sahada Toplanan Sivrisineklerden Sivrisinek İlişkili Virüs İzolasyonu

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

Bu protokol, sivrisineklerle ilişkili virüsleri izole etmek için yararlı bir yaklaşımdır ve sivrisineklerle ilgili patojenlerin dağılımı ve sivrisinek tarafından taşınan hastalıkların kontrolü konusunda daha fazla araştırmaya yardımcı olabilir. Biyogüvenlik seviye 2 laboratuvarında virüsleri izole etmek için ince çizgiler kullanmak daha güvenli ve daha verimlidir. Kırmızı aşılamayı değişen sıvı ile döngülemek gibi diğer virüs izolasyon prosedürlerinin aksine, bu teknik hayvan deneyleri veya etik değerlendirme gerektirmez.Numunelerden ve inkübasyon sırasında çizilen hücrelerden kaynaklanan kontaminasyon, deneyin başarısızlığına neden olabilir. Bu nedenle, kontaminasyonu önlemek için ortama% 2 Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin ilave etmek gerekir. Üç milimetrelik seramik boncukların, buzun üzerine yerleştirilmiş iki mililitrelik steril bir tüpe % 2 Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin B Çözeltisi ile desteklenmiş 1.5 mililitre RPMI ortamının eklenmesiyle başlayın ve ardından içine 50 sivrisinek aktarın.Daha sonra, sivrisinekleri düşük sıcaklıklı bir doku homojenizatörü ile 70 hertz'de 30 saniye ve 3 döngü boyunca 4 santigrat derecede öğüterek homojenize edin. Homojenatı 15.000 G'de 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantları yeni tüplere aktarın. Sivrisinek kalıntılarını tamamen çıkarmak için, süpernatantı 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 15.000 G'de tekrar santrifüj edin.200 mikrolitre süpernatant P0'ı iki mililitrelik bir vidalı kapak depolama tüpüne alın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Virüs amplifikasyonu için, Aedes albopictus RNAi eksikliği olan sivrisinek hücre hattı C6/36 ve omurgalı hücre hattı, bebek hamster böbreği veya BHK-21'i 75 santimetrekarelik bir şişeden kullanın ve bunları ayrı ayrı 24 kuyucuk plakasına yerleştirin. Tohumlanmış 24 kuyu plakasını gece boyunca 28 veya 37 santigrat dereceye yerleştirin.Ertesi gün, her bir kuyucukta% 80 ila% 90 akıcılığı doğrulamak için mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin. Antibiyotiklerle desteklenmiş 500 mililitre hücre kültürü bakım ortamı hazırlayın. Hücre kültürü ortamını 24 kuyucuk plakasından çıkarın ve her bir kuyucuğa 100 mikrolitre hücre kültürü bakım ortamı ekleyin.Daha sonra hücreleri sivrisinek homojenatının veya P0'ın süpernatantının 100 mikrolitresi ile aşılayın. Plakaları 60 dakika boyunca 28 veya 37 santigrat derecede inkübe edin ve hücrelerin kurumasını önlemek için her 15 dakikada bir plakaları hafifçe sallayın. Tamamlandığında, süpernatantı çıkarın ve kalıntıları tamamen gidermek için her bir kuyucuğu 600 mikrolitre hücre kültürü bakım ortamı ile durulayın. Daha sonra, plakaları 7 gün boyunca 28 veya 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirmeden önce her bir oyuğa 800 mikrolitre hücre kültürü bakım ortamı ekleyin.Günlük olarak mikroskop altında her bir kuyucuğun hücrelerinin durumunu izleyin. Yedinci günde, P1 olarak bilinen hücrelerin süpernatantını toplayın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. P2 ve P3 viral süpernatantları toplamak için prosedürü tekrarlayın.Sitopatojenik etki veya CPE nedeniyle, bazı kuyucuklardan hücreler ölür ve yüzeyden ayrılır. Virüsleri büyük ölçüde büyütmek için: CPE etkisini gösteren kuyucuklardan 300 ila 400 mikrolitre süpernatant toplayın ve kültür hücrelerinin% 80 ila% 90 hücre akıcılığına sahip yeni bir altı delikli plakaya aktarın. Son olarak, eksi 80 santigrat derecede saklamadan önce, altı delikli plakanın kuyucuklarından 500 mikrolitre süpernatant toplayın ve iki mililitrelik vidalı kapak depolama tüplerine aktarın.C6/36 hücrelerinin sivrisinek homojenatları P0 ile aşılanması, aşılanmamış veya kontrol hücrelerine kıyasla, enfeksiyondan 120 saat sonra pul pul dökülmüş hücrelerde geniş bir hücreler arası boşluk sergilemiştir. BHK21 hücrelerinin P3 viral süpernatantlarla inkübasyonu, enfeksiyondan 48 saat sonra görünür bir CPE gösterdi ve kontrol hücrelerinin aksine hücrenin ölümünü ve yüzeyden ayrılmasını gösterdi. Ticari olarak temin edilebilen evrensel primerler veya Flavivirüsler, Alfavirüsler ve Bunyavirüsler, viral süpernatan için PCR ürünlerini üretmek için kullanılmıştır.Bunyavirüs için bir PCR ürünü olan Ebinur Lake virüsü, pozitif bir kontrol olarak ayarlandı. Bunyavirüslere ait şeritlerde PCR amplifikasyon yasakları ve pozitif kontrol, süpernatantlarda Bunyavirüs varlığının olasılığını vurguladı. Virüs izolasyonunun başarı oranını artırmak için numune taşıma, izolasyon ve öğütme sırasında sıcaklığı düşük tutun.Sivrisinekleri ve kültürün kendisini homojenize ederken antibiyotik ekleyin. Ve inkübasyon sırasında kültürü hızlı bir şekilde ele alın ve kültür ortamını kaldırın. Bu prosedüre ek olarak, öğütme çözeltisi bir döngüsel sıçan veya tavuk embriyosuna enjekte edilebilir.Bununla birlikte, onaylama prosedürü etik kaygıları artıracak ve deneyin maliyetini artıracaktır.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Ae midgut ve Tükürük Bezlerinin Diseksiyon. aegypti Sivrisinekler

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Fare Tails Genomik DNA izolasyonu

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Primer Tümörler gelen Bağışıklık Hücre İzolasyonu

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Fare ve İnsan Özofagus gelen miyofibroblastların izolasyonu

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Sıtma verici Sivrisinekler için bir çok algılama Deneyi

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Sivrisinekler için roman böcek kimyaları toksisite testleri için iletişim kuralları

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Salya vektör yetkinlik sivrisinek analiz etmek için bir yöntem olarak zorla

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...