Name: molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor
Uploaded: 2022-05-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor at JoVE.com

تم هندسة مجموعةV558Δ / + الفئران وراثيا ومشاركتها من قبل الدكتور بيتر بيسمر10. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01 CA102613 و T32 CA251063.

تم إيواء جميع الفئران في ظروف خالية من مسببات الأمراض في جامعة بنسلفانيا وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة وبموافقة جامعة بنسلفانيا IACUC. تم تنفيذ القتل الرحيم وفقا لإجراءات التشغيل القياسية للموارد الحيوانية في مختبر جامعة بنسلفانيا.
1. كيتV558Δ / +</...

<ol>
	<li>Mastrangelo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+soft+tissue+sarcoma+and+beyond:+a+population-based+prospective+study+in+3+European+regions.">Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions.</a> Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).</li><li>Joensuu, H., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+management+of+gastrointestinal+stromal+tumors:+a+model+for+targeted+and+multidisciplinary+therapy+of+malignancy.">The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy.</a> Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).</li><li>Blanke, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+results+from+a+randomized+phase+II+trial+of+standard-+versus+higher-dose+imatinib+mesylate+for+patients+with+unresectable+or+metastatic+gastrointestinal+stromal+tumors+expressing+KIT.">Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).</li><li>Demetri, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+regorafenib+for+advanced+gastrointestinal+stromal+tumours+after+failure+of+imatinib+and+sunitinib+(GRID):+an+international,+multicentre,+randomised,+placebo-controlled,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial.</a> Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).</li><li>Gold, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcome+of+metastatic+GIST+in+the+era+before+tyrosine+kinase+inhibitors.">Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).</li><li>Huynh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib+induces+growth+suppression+in+mouse+models+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).</li><li>Na, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+xenografts+from+patients+with+gastrointestinal+stromal+tumors:+analysis+of+clinicopathological+characteristics+related+to+engraftment+success.">Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).</li><li>Balachandran, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+potentiates+antitumor+T+cell+responses+in+gastrointestinal+stromal+tumor+through+the+inhibition+of+Ido.">Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido.</a> Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).</li><li>Vitiello, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+immune+profiles+distinguish+the+mutational+subtypes+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).</li><li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase.">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).</li><li>Cavnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIT+oncogene+inhibition+drives+intratumoral+macrophage+M2+polarization.">KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).</li><li>Medina, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+kinase+inhibition+limits+Batf3-dependent+dendritic+cell+development+and+antitumor+immunity.">Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).</li><li>Zhang, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+CD8(+)+T+cells+mediate+the+antitumor+efficacy+of+combined+CD40+ligation+and+imatinib+therapy+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).</li><li>. General Protocol for Western Blotting Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf</a> (2022)</li><li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+formalin-fixed,+paraffin+embedded+blocks.">Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 253-268 (2019).</li><li>Sy, J., Ang, L. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtomy:+Cutting+formalin-fixed,+paraffin-embedded+sections.">Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 269-278 (2019).</li><li>Seifert, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1/PD-L1+blockade+enhances+T-cell+activity+and+antitumor+efficacy+of+imatinib+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors.</a> Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+KIT+modulates+Type+I+IFN-mediated+antitumor+immunity+in+GIST.">Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST.</a> Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).</li><li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Kit+signaling+and+therapeutic+intervention+in+a+mouse+model+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).</li></ol>

يعد نموذج الماوس KitV558Δ/+ أداة بحث قوية في التحليل الجزيئي والمناعي ل GIST. على الرغم من أن استراتيجية التربية تتطلب صليبا واحدا ، إلا أن استخدام مجموعات الفئران Kit V558Δ / + في التجارب التي تحلل استجابة الورم يتطلب تربية واسعة النطاق. يجب أن تكون الفئران متطابقة مع العمر وال?...

GIST هو الساركوما الأكثر شيوعا في البشر مع حدوث حوالي 6000 حالة في الولايات المتحدة الأمريكية1. يبدو أن GIST ينشأ من خلايا تنظيم ضربات القلب المعدية المعوية المسماة الخلايا الخلالية في Cajal ، وعادة ما يكون مدفوعا بطفرة واحدة في مجموعة التيروزين كيناز أو PDGFRA2. الجراحة هي الدعامة الأساسية لعلاج GIST ويمكن أن تكون علاجية ، ولكن يمكن علاج المرضى الذين يعانون من مرض متقدم باستخدام مثبط التيروزين كيناز (TKI) ، إيماتينيب. منذ تقديمه منذ أكثر من 20 عاما ، قام imatinib بتحويل نموذج العلاج في GIST ، مما أدى إلى تحسين البقاء على قيد الحياة في الأمراض المتقدمة من 1 إلى أكثر من 5 سنوات 3,4,5. لسوء الحظ ، نادرا ما يكون إيماتينيب علاجيا بسبب طفرات KIT المكتسبة ، لذلك هناك حاجة إلى علاجات جديدة لهذا الورم.
نماذج الفئران هي أداة بحثية مهمة في التحقيق في العلاجات الجديدة في السرطان. تم تطوير العديد من نماذج xenograft تحت الجلد و xenograft المشتقة من المريض والتحقيق فيها في GIST 6,7. ومع ذلك ، فإن الفئران التي تعاني من نقص المناعة لا تمثل GIST البشري بشكل كامل لأن GISTs تؤوي ملفات تعريف مناعية تفاضلية اعتمادا على طفرتها الورمية ، وتغيير البيئة الدقيقة لورم الجهاز الهضمي يحسن من آثار العلاج TKI 8,9. يحتوي الماوس Kit V558Δ/+ على حذف خط جرثومي غير متجانس في Kit exon 11 ، والذي يشفر مجال juxtamembrane ، وهو الموقع الأكثر تحورا شيوعا في GIST10 البشري. تقوم الفئرانV558Δ / + بتطوير GIST سيكال واحد مع اختراق 100٪ ، والأورام لها أنسجة مماثلة ، وإشارات جزيئية ، وتسلل مناعي ، واستجابة للعلاج مثل GIST البشري 8,11,12,13. هنا ، نصف تربية وعلاج وعزل العينات ومعالجتها في الفئران KitV558Δ / + لاستخدامها في البحوث الجزيئية والمناعية في GIST.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x RBC lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mL syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody (C67E7)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini edta free protease inhibitor</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C852A34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Exel International</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C756V81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dog1 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab64085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C788U23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 850 Homogenizer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imatinib mesylate</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT antibody (D13A2)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KitV558&#916;/+ Genotyping</td>
			<td>Transnetyx</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1620145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9121673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody (S473)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-KIT antibody (Y719)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proeinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP170050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes</td>
			<td>Falcon/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS buffer (10x)</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (100mm2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Falcon</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisHCL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1757500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;vivaCT 80 platform</td>
			<td>Scanco medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor

الورم اللحمي المعدي المعوي (GIST) هو الساركوما البشرية الأكثر شيوعا وعادة ما يكون مدفوعا بطفرة واحدة في مستقبلات KIT. عبر أنواع الأورام ، تم تطوير العديد من نماذج الفئران من أجل التحقيق في الجيل التالي من علاجات السرطان. ومع ذلك ، في GIST ، تستخدم معظم الدراسات في الجسم الحي نماذج فأر xenograft التي لها قيود متأصلة. هنا ، نصف نموذجا للفأر المختص بالمناعة والمعدل وراثيا لورم لحمية الجهاز الهضمي يؤوي طفرة KitV558Δ / +. في هذا النموذج ، يتم دفع KIT المتحور ، وهو الجين الورمي المسؤول عن معظم GISTs ، بواسطة مروجه الداخلي مما يؤدي إلى GIST الذي يحاكي المظهر النسيجي والتسلل المناعي الذي شوهد في GISTs البشرية. علاوة على ذلك ، تم استخدام هذا النموذج بنجاح للتحقيق في كل من العلاجات الجزيئية والمناعية المستهدفة. هنا ، نصف تربية وصيانة مستعمرة الفأر KitV558Δ / +. بالإضافة إلى ذلك ، تفصل هذه الورقة علاج وشراء GIST ، وتصريف العقدة الليمفاوية المساريقية ، والأعور المجاور في الفئران KitV558Δ / + ، بالإضافة إلى إعداد العينات للتحليلات الجزيئية والمناعية.

يسمح نموذج الماوس KitV558Δ/+ بالتحقيق في العلاجات في نموذج الماوس المناعي. يبلغ متوسط عمر الفئران V558Δ/+ 8 أشهر بسبب انسداد الأمعاء التدريجي (الشكل 4). الأورام من KitV558Δ / + الفئران تعبر عن العلامات القانونية ل GIST بما في ذلك مجموعة ا...

Watch this Scientific Journal Video about Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor at JoVE.com

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

الهدف من هذه المخطوطة هو وصف نموذج الماوس KitV558Δ/+ وتقنيات التشريح والمعالجة الناجحة لعينات الماوس.

التقنيات الجزيئية والمناعية في نموذج فأر مهندس وراثيا لورم الجهاز الهضمي اللثوي

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

يصف بروتوكولنا تربية وصيانة وتشريح ومعالجة العينات لنموذج الماوس الوحيد المختص بالمناعة ، GIST ، المستخدم حاليا. نأمل أن يتمكن الباحثون في المستقبل من استخدام نموذج الماوس هذا من أجل إجراء مزيد من الأبحاث الانتقالية في GIST. تتضمن العلاجات التقليدية في GIST العلاج الجزيئي المستهدف بمثبطات التيروزين كيناز.يمكن هذا النموذج الباحثين من اختبار العلاجات المناعية في GIST. للبدء ، قم بتعقيم جميع الأدوات ، وارتداء القفازات طوال الإجراء ، والحفاظ على حقل معقم. تحضير منطقة شق مع 70 ٪ من الإيثانول.باستخدام المقص ، قم بعمل شق عمودي في خط الوسط بطول سنتيمترين وأدخل تجويف البطن. قم بتحليل أي التصاقات داخل البطن بشكل حاد. لإزالة العقدة الليمفاوية المساريقية المستنزفة ، حدد الأعور وارفع مساريقه بشكل فائق.في منتصف الطريق تقريبا إلى قاعدة المساريق القولون ، حدد العقدة الليمفاوية المساريقية وتشريحها بحدة. حسب الحاجة ، قسم أنسجة العقدة الليمفاوية إلى أثلاثين لعزل البروتين والأنسجة وتعليق الخلية الواحدة. ضع أنسجة العقدة الليمفاوية في 20 ملليلتر من وسط RPMI لتعليق خلية واحدة والحفاظ على الجليد.يتم استبدال الأعور في الغالب ب GIST في الفئران Kit558. لعزل GIST والأعور ، قم بتقسيم التقاطع اللفائفي بعناية من قاعدة الورم. ثم ، قسم الأعور مرة أخرى ، سنتيمترين بعيدين إلى قاعدة الورم.في 50 إلى 60٪ من الفئران Kit558 ، يحتوي رأس الورم على غطاء من الأنسجة الدائرية ، والتي تحتوي عادة على سائل مصلي ، ولكن نادرا ما تحتوي على القيح. تشريح أنسجة الغطاء بشكل حاد بعيدا عن أنسجة الورم. قسم أنسجة الورم والأعور إلى أثلاثين لعزل البروتين والأنسجة وتعليق الخلية الواحدة.بالنسبة للمعلقات أحادية الخلية ، ضع أنسجة الورم أو الأعور في HBSS مع 2٪ FCS ، وهو ما يكفي لتغطية العينة ، والحفاظ على الجليد. صب وسائط RPMI مع عينة العقدة الليمفاوية على مرشح 100 ميكرومتر. انقل الفلتر إلى مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر، وقم بهرس العقدة الليمفاوية بالطرف الناعم لمحقنة بلاستيكية سعة 3 ملليلترات.اغسل الفلتر ب 20 ملليلتر من وسائط RPMI. الطرد المركزي للعينات وشفط السوبرناتان. أعد تعليق الكريات في 20 ملليلتر من المخزن المؤقت للخرز واسكبها على مرشح 40 ميكرومتر.جمع ترشيح الخلية. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. الطرد المركزي للعينات والتخلص من supernatant.ثم ، أعد التعليق في المخزن المؤقت للخرزة لقياس التدفق الخلوي. قم بإعداد مخزن كولاجيناز مؤقت كما هو موضح في مخطوطة النص. ضع GIST في طبق معقم وأضف 2.5 ملليلتر من الكولاجيناز العازل.باستخدام مشرط ومقص معقمين ، قم بفرم الورم حتى يصبح في شظايا دقيقة. استخدم ماصة كبيرة التجويف لشفط الورم والكولاجيناز في أنبوب سعة 50 ملليلتر. احتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة بمعدل 100 دورة في الدقيقة ، ثم قم بإخماد التفاعل بملليلتر من FBS.صب الكولاجيناز مع عينة GIST على مرشح 100 ميكرومتر وهرس الورم مع نهاية ناعمة من حقنة بلاستيكية ثلاثة ملليلتر وجمعها في أنبوب 50 ملليلتر. اغسل الفلتر ب 20 ملليلتر من HBSS. قم بالطرد المركزي للترشيح عند 450 RCF لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، ثم تخلص من السوبرناتال.أعد تعليق الكريات في 20 ملليلتر من المخزن المؤقت للخرز واسكبه فوق مرشح 40 ميكرومتر اجمع خلايا الترشيح والعد باستخدام مقياس الدم. جهاز طرد مركزي وشفط السوبرنات ، ثم إعادة التعليق في المخزن المؤقت للخرز لقياس التدفق الخلوي. باستخدام المقص ، قم بتقسيم الأعور طوليا لفضح الغشاء المخاطي الداخلي.قطعها إلى أقسام 0.5 سم وضعها في أنبوب 50 ملليلتر مع خمسة ملليلتر من HBSS و 2٪ FBS. رج بقوة لمدة 30 ثانية وجهاز طرد مركزي على 450 RCF لمدة 20 ثانية. ثم ، تجاهل supernatant.أضف من خمسة إلى 20 ملليلتر من HBSS مع EDTA ثنائي المليمولار. احتضنه عند 37 درجة مئوية عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. جهاز طرد مركزي وتخلص من السوبرنات ، ثم أعد تعليق الكريات في خمسة إلى 20 ملليلتر من HBSS.رج الخليط بقوة لمدة 30 ثانية ، ثم قم بجهاز الطرد المركزي عند 450 RCF لمدة 20 ثانية وتخلص من supernatant. كرر هذه العملية مرة أخرى. أعد تعليق الكريات في خمسة ملليلترات من الكولاجيناز العازل ، ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة عند 100 دورة في الدقيقة.رجه بقوة كل 10 دقائق وقم بإخماد التفاعل باستخدام ملليلترين من FBS. صب الكولاجيناز مع عينة الأعور على مرشح 100 ميكرومتر وهرس مع نهاية ناعمة من حقنة بلاستيكية ثلاثة ملليلتر. اغسل الفلتر ب 20 ملليلتر من HBSS وجمع الترشيح.جهاز الطرد المركزي والتخلص من supernatant. أعد تعليق الكريات في 20 ملليلتر من المخزن المؤقت للخرز واسكبها على مرشح 40 ميكرومتر. جمع الخلايا المرشحة وعدها باستخدام مقياس الدم.كرر عملية الطرد المركزي مرة أخرى وأعد تعليق الكريات في المخزن المؤقت للخرز لقياس التدفق الخلوي. كان متوسط عمر الفئران Kit558 ثمانية أشهر بسبب انسداد الأمعاء التدريجي. عبرت الأورام من الفئران Kit558 عن العلامات الأساسية ل GIST ، بما في ذلك مجموعة التيروزين كيناز ، والقناة عبر الغشاء Dog1 ، وعامل النسخ ETV1.تمت دراسة الأورام بحثا عن تغييرات في مسار إشارات KIT مثل علامات المصب ERK و AKT أو البيئة الدقيقة المناعية ، والتي تحاكي عن كثب GIST البشري. تم استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير المقطعي المحوسب لتتبع حجم الورم كقياس دقيق لاستجابة الورم. يعد تشريح الورم بعيدا عن التقاطع اللفائفي وبعيدا عن غطاء الساق أمرا مهما لالتقاط وزن الورم الحقيقي والتحليل المناعي والجزيئي.داخل GIST ، سمح هذا النموذج بالتحقيق في البيئة الدقيقة للورم ، وكذلك العلاجات المناعية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ال<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تخيلي ورم القرص نموذج: التصور والكمي للالتعبير الجيني وغزو الورم عن طريق الفسيفساء الوراثية

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

كولون-26 سرطان الفأر نموذجا لدراسة سرطان دنف الحاملة للورم

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

والفئران مثلي المثانة نموذج ورم والورم نظام لكشف

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

عزل الخلايا السرطانية المتداولة في نموذج الفأر المثلي لسرطان القولون والمستقيم

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

نموذج الفأر المهندسة وراثيا لسرطان القولون والمستقيم المتفرقة

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

ورم انجرافتمينت في نموذج الفأر إكسينوجرافت من عباءة البشرية الخلية اللمفاوية

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Utilizing High Resolution Ultrasound to Monitor Tumor Onset and Growth in Genetically Engineered Pancreatic Cancer Models

استخدام الموجات فوق الصوتية عالية الدقة لرصد ظهور ورم والنمو في نماذج سرطان البنكرياس المهندسة وراثيا

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

في المختبر إنشاء خط الخلايا السرطانية للراس والرقبة المهندسة جينيا باستخدام نظام كاس 9 الفيروسات المرتبطة Adeno

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

رواية سترومال ليفيبليوم-تعديل 3D نموذج الورم كرويويد لدراسة الورم ستروما التفاعل واكتشاف المخدرات

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

نموذج فأر للتحقيق في دور الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان في نمو الورم

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...