Name: molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor
Uploaded: 2022-05-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor at JoVE.com

KitV558Δ/+ mus blev genetisk manipuleret og delt af Dr. Peter Besmer10. Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud R01 CA102613 og T32 CA251063.

Alle mus blev anbragt under patogenfrie forhold ved University of Pennsylvania i henhold til NIH-retningslinjer og med godkendelse fra University of Pennsylvania IACUC. Eutanasi blev udført efter University of Pennsylvania Laboratory Animal Resources standardoperationsprocedurer.
1. KitV558Δ/+ museavl
<ol><li>Kryds kitV558Δ/+ musene mere end 10 gange på en C57BL/6J-baggrund ved hjælp af C57BL/6J-mus. F...

<ol>
	<li>Mastrangelo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+soft+tissue+sarcoma+and+beyond:+a+population-based+prospective+study+in+3+European+regions.">Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions.</a> Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).</li><li>Joensuu, H., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+management+of+gastrointestinal+stromal+tumors:+a+model+for+targeted+and+multidisciplinary+therapy+of+malignancy.">The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy.</a> Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).</li><li>Blanke, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+results+from+a+randomized+phase+II+trial+of+standard-+versus+higher-dose+imatinib+mesylate+for+patients+with+unresectable+or+metastatic+gastrointestinal+stromal+tumors+expressing+KIT.">Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).</li><li>Demetri, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+regorafenib+for+advanced+gastrointestinal+stromal+tumours+after+failure+of+imatinib+and+sunitinib+(GRID):+an+international,+multicentre,+randomised,+placebo-controlled,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial.</a> Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).</li><li>Gold, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcome+of+metastatic+GIST+in+the+era+before+tyrosine+kinase+inhibitors.">Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).</li><li>Huynh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib+induces+growth+suppression+in+mouse+models+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).</li><li>Na, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+xenografts+from+patients+with+gastrointestinal+stromal+tumors:+analysis+of+clinicopathological+characteristics+related+to+engraftment+success.">Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).</li><li>Balachandran, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+potentiates+antitumor+T+cell+responses+in+gastrointestinal+stromal+tumor+through+the+inhibition+of+Ido.">Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido.</a> Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).</li><li>Vitiello, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+immune+profiles+distinguish+the+mutational+subtypes+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).</li><li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase.">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).</li><li>Cavnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIT+oncogene+inhibition+drives+intratumoral+macrophage+M2+polarization.">KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).</li><li>Medina, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+kinase+inhibition+limits+Batf3-dependent+dendritic+cell+development+and+antitumor+immunity.">Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).</li><li>Zhang, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+CD8(+)+T+cells+mediate+the+antitumor+efficacy+of+combined+CD40+ligation+and+imatinib+therapy+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).</li><li>. General Protocol for Western Blotting Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf</a> (2022)</li><li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+formalin-fixed,+paraffin+embedded+blocks.">Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 253-268 (2019).</li><li>Sy, J., Ang, L. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtomy:+Cutting+formalin-fixed,+paraffin-embedded+sections.">Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 269-278 (2019).</li><li>Seifert, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1/PD-L1+blockade+enhances+T-cell+activity+and+antitumor+efficacy+of+imatinib+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors.</a> Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+KIT+modulates+Type+I+IFN-mediated+antitumor+immunity+in+GIST.">Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST.</a> Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).</li><li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Kit+signaling+and+therapeutic+intervention+in+a+mouse+model+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).</li></ol>

KitV558Δ/+ musemodellen er et kraftfuldt forskningsværktøj i den molekylære og immunologiske analyse af GIST. Selvom avlsstrategien kræver et enkelt kryds, kræver brug af KitV558Δ/+ musekohorter i eksperimenter, der analyserer tumorrespons, omfattende avl. Mus bør alders- og kønsmatches for at sikre lignende tumorvægte, og 10% af musene dør inden 8 ugers alderen, når tumorer er etableret. Mindre omfattende avlsstrategier er mulige, hvis man bruger avancerede billeddanne...

GIST er det mest almindelige sarkom hos mennesker med en forekomst på ca. 6.000 tilfælde i USA1. GIST ser ud til at stamme fra de gastrointestinale pacemakerceller, der hedder de interstitielle celler i Cajal, og er typisk drevet af en enkelt mutation i tyrosinkinase KIT eller PDGFRA2. Kirurgi er grundpillen i behandling for GIST og kan være helbredende, men patienter med avanceret sygdom kan behandles med tyrosinkinasehæmmeren (TKI), imatinib. Siden introduktionen for over 20 år siden har imatinib transformeret behandlingsparadigmet i GIST og forbedret overlevelsen i avanceret sygdom fra 1 til over 5 år 3,4,5. Desværre er imatinib sjældent helbredende på grund af erhvervede KIT-mutationer, så der er behov for nye behandlinger for denne tumor.
Musemodeller er et vigtigt forskningsværktøj i undersøgelsen af nye terapier i kræft. Flere subkutane xenograft- og patientafledte xenograftmodeller er blevet udviklet og undersøgt i GIST 6,7. Immundefekte mus repræsenterer imidlertid ikke fuldt ud human GIST, da GIST'er har forskellige immunprofiler afhængigt af deres onkogene mutation, og ændring af det gastrointestinale tumormikromiljø forbedrer virkningerne af TKI-terapi 8,9. KitV558Δ/+ musen har en heterozygot kimlinje sletning i Kit exon 11, som koder for juxtamembrane domænet, det mest almindeligt muterede sted i human GIST10. KitV558Δ/+ mus udvikler en enkelt cecal GIST med 100% penetrans, og tumorer har lignende histologi, molekylær signalering, immuninfiltration og respons på terapi som human GIST 8,11,12,13. Her beskriver vi avl, behandling og prøveisolering og -behandling i KitV558Δ/+ mus til brug i molekylær og immunologisk forskning i GIST.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x RBC lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mL syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody (C67E7)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini edta free protease inhibitor</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C852A34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Exel International</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C756V81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dog1 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab64085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C788U23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 850 Homogenizer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imatinib mesylate</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT antibody (D13A2)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KitV558&#916;/+ Genotyping</td>
			<td>Transnetyx</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1620145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9121673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody (S473)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-KIT antibody (Y719)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proeinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP170050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes</td>
			<td>Falcon/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS buffer (10x)</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (100mm2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Falcon</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisHCL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1757500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;vivaCT 80 platform</td>
			<td>Scanco medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) er den mest almindelige humane sarkom og er typisk drevet af en enkelt mutation i KIT-receptoren. På tværs af tumortyper er der udviklet adskillige musemodeller for at undersøge den næste generation af kræftbehandlinger. I GIST bruger de fleste in vivo-undersøgelser imidlertid xenograft-musemodeller, der har iboende begrænsninger. Her beskriver vi en immunkompetent, genetisk manipuleret musemodel af gastrointestinal stromal tumor, der huser en KitV558Δ/+ mutation. I denne model drives mutant KIT, onkogenet, der er ansvarlig for de fleste GIST'er, af dets endogene promotor, hvilket fører til en GIST, der efterligner det histologiske udseende og immuninfiltration, der ses i humane GIST'er. Desuden er denne model blevet brugt med succes til at undersøge både målrettede molekylære og immunterapier. Her beskriver vi opdræt og vedligeholdelse af en KitV558Δ/+ musekoloni. Derudover beskriver dette papir behandling og indkøb af GIST, dræning af mesenterisk lymfeknude og tilstødende cecum i KitV558Δ /+ mus samt prøveforberedelse til molekylære og immunologiske analyser.

KitV558Δ/+ musemodellen giver mulighed for undersøgelse af terapi i en immunkompetent musemodel. KitV558Δ/+ mus har en gennemsnitlig levetid på 8 måneder på grund af progressiv tarmobstruktion (figur 4). Tumorer fra KitV558Δ/+ mus udtrykker kanoniske markører for GIST, herunder tyrosinkinase KIT og transmembrankanalen DOG1 (figur 5)</str...

Watch this Scientific Journal Video about Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor at JoVE.com

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

Målet med dette manuskript er at beskrive KitV558Δ/+ musemodellen og teknikker til vellykket dissektion og behandling af museprøver.

Molekylære og immunologiske teknikker i en genetisk manipuleret musemodel af gastrointestinal stromal tumor

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

Vores protokol beskriver avl, vedligeholdelse, dissektion og prøvebehandling af den eneste immunkompetente musemodel, GIST, der i øjeblikket er i brug. Vi håber, at fremtidige forskere vil være i stand til at udnytte denne musemodel til yderligere translationel forskning i GIST. Traditionelle terapier i GIST involverer målrettet molekylær terapi med tyrosinkinasehæmmere.Denne model gør det muligt for forskere at teste immunterapier i GIST. Til at begynde med skal du sterilisere alle instrumenter, bære handsker under hele proceduren og opretholde et sterilt felt. Forbered snitområdet med 70% ethanol.Brug en saks til at lave et lodret snit på to centimeter midterlinje og komme ind i bukhulen. Skarpt lyse eventuelle intra-abdominale adhæsioner. For at fjerne den drænende mesenteriske lymfeknude skal du identificere cecum og løfte dens mesenteri overlegent.Ca. midtvejs til bunden af colonic mesentery, identificer den mesenteriske lymfeknude og disseker den skarpt. Efter behov opdeles lymfeknudevæv i tredjedele til proteinisolering, histologi og enkeltcellesuspension. Anbring lymfeknudevæv i 20 ml RPMI-medium til enkeltcellesuspensioner og hold på is.Cecum er for det meste erstattet af en GIST i Kit558 musene. Til isolering af GIST og cecum skal du forsigtigt opdele det ileokolic kryds fra tumorens bund. Derefter opdeles cecum igen, to centimeter distal til bunden af tumoren.I 50 til 60% af Kit558-musene indeholder tumorhovedet en hætte af cecalvæv, som typisk indeholder serøs væske, men kan sjældent indeholde pus. Disseker hættevævet skarpt væk fra tumorvævet. Opdel tumorvævet og cecum i tredjedele til proteinisolering, histologi og enkeltcellesuspension.For enkeltcellesuspensioner skal tumorvæv eller cecum placeres i HBSS med 2% FCS, nok til at dække prøven, og opbevares på is. Hæld RPMI-mediet med lymfeknudeprøven over et 100 mikrometer filter. Flyt filteret til en ny 50 ml konisk, og mos lymfeknuden med den bløde ende af en tre milliliter plastsprøjte.Vask filter med 20 ml RPMI-medier. Prøverne centrifugeres, og supernatanten opsuges. Resuspend pelleten i 20 ml perlebuffer og hæld over et 40 mikrometer filter.Saml cellefiltratet. Tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer. Prøverne centrifugeres, og supernatanten kasseres.Derefter resuspend i perlebuffer til flowcytometri. Forbered collagenasebuffer som beskrevet i tekstmanuskriptet. Anbring GIST i en steril skål og tilsæt 2,5 ml collagenasebuffer.Brug en steril skalpel og saks, hak tumoren, indtil den er i fine fragmenter. Brug en pipette med stor boring til at aspirere tumoren og collagenasen i et 50 ml rør. Inkuber det ved 37 grader Celsius i 30 minutter ved 100 rotationer i minuttet, og sluk derefter reaktionen med to milliliter FBS.Hæld collagenase med GIST-prøve over et 100 mikrometer filter og mos tumoren med den bløde ende af en tre milliliter plastsprøjte og saml i et 50 ml rør. Vask filter med 20 ml HBSS. Filtratet centrifugeres ved 450 RCF i fem minutter ved fire grader Celsius, og supernatanten kasseres derefter.Resuspend pelleten i 20 ml perlebuffer og hæld over et 40 mikrometer filter Saml filtratet og tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer. Centrifuger og aspirerer supernatanten, og resuspend derefter i perlebuffer til flowcytometri. Brug saks til at opdele cecum i længderetningen for at udsætte den indre slimhinde.Skær det i sektioner på 0,5 centimeter og læg det i et 50 ml rør med fem milliliter HBSS og 2% FBS. Omryst kraftigt i 30 sekunder, og centrifuger ved 450 RCF i 20 sekunder. Kassér derefter supernatanten.Tilsæt fem til 20 ml HBSS med to-millimolar EDTA. Inkuber det ved 37 grader Celsius ved 100 rotationer i minuttet i 15 minutter. Centrifuger og kassér supernatanten, og resuspender derefter pelleten i fem til 20 ml HBSS.Omryst blandingen kraftigt i 30 sekunder, centrifuger derefter ved 450 RCF i 20 sekunder, og supernatanten kasseres. Gentag denne proces endnu en gang. Resuspend pelleten i fem milliliter collagenasebuffer, og inkuber den derefter ved 37 grader Celsius i 30 minutter ved 100 rotationer pr. Minut.Ryst kraftigt hvert 10. minut og sluk reaktionen med to milliliter FBS. Hæld collagenase med cecumprøve over et 100 mikrometer filter og mos med den bløde ende af en tre milliliter plastsprøjte. Vask filteret med 20 ml HBSS og saml filtratet.Centrifuger og kassér supernatanten. Resuspend pelleten i 20 ml perlebuffer og hæld over et 40 mikrometer filter. Saml filtrat og tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer.Centrifugeringsprocessen gentages endnu en gang, og pelleten sættes igen i perlebuffer til flowcytometri. Kit558-musene havde en gennemsnitlig levetid på otte måneder på grund af progressiv tarmobstruktion. Tumorer fra Kit558-musene udtrykte kanoniske markører for GIST, herunder tyrosinkinase KIT, transmembrankanalen Dog1 og transkriptionsfaktoren ETV1.Tumorer blev undersøgt for ændringer i KIT-signalvejen, såsom nedstrømsmarkørerne ERK og AKT eller immunmikromiljø, som nøje efterlignede human GIST. MR eller CT blev brugt til at spore tumorvolumen som en nøjagtig måling af tumorrespons. Dissekering af tumoren væk fra det ileokolic kryds og væk fra cecal cap er vigtigt for at fange ægte tumorvægt og immun- og molekylær analyse.Inden for GIST har denne model muliggjort undersøgelse af tumormikromiljøet såvel som immunterapier.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Det<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginære Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantificering af genekspression og tumorindtrængen Brug Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Den Colon-26 Carcinoma Tumor-bærende mus som en model for Studiet af Cancer Kakeksi

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

En Muse ortotopisk Blære Tumor Model og Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolering af cirkulerende tumorceller i en ortotopisk musemodel af kolorektal cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

En genetisk manipuleret musemodel af sporadisk kolorektal cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Tumor Engraftment i en Xenograft musemodel af menneskelige Mantle celle lymfom

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Utilizing High Resolution Ultrasound to Monitor Tumor Onset and Growth in Genetically Engineered Pancreatic Cancer Models

Udnytte høj opløsning ultralyd skærm Tumor indsættende og vækst i gensplejsede bugspytkirtelkræft modeller

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

In vitro etablering af en genetisk manipuleret murine hoved og hals Cancer cellelinje ved hjælp af en adeno-associeret virus-Cas9 system

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

En roman Stromal Fibroblast-Moduleret 3D Tumor Spheroid Model for at studere Tumor-Stroma Interaktion og Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

En musemodel til at undersøge rollen som kræftassocierede fibroblaster i tumorvækst

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...