Name: molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor
Uploaded: 2022-05-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor at JoVE.com

KitV558Δ/+ muizen werden genetisch gemanipuleerd en gedeeld door Dr. Peter Besmer10. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01 CA102613 en T32 CA251063.

Alle muizen werden gehuisvest onder pathogeenvrije omstandigheden aan de Universiteit van Pennsylvania volgens nih-richtlijnen en met goedkeuring van de Universiteit van Pennsylvania IACUC. Euthanasie werd uitgevoerd volgens de standaard operationele procedures van de University of Pennsylvania Laboratory Animal Resources.
1. KitV558Δ/+ muizen fokken
<ol><li>Steek de KitV558Δ/+ muizen meer dan 10 keer ter...

<ol>
	<li>Mastrangelo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+soft+tissue+sarcoma+and+beyond:+a+population-based+prospective+study+in+3+European+regions.">Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions.</a> Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).</li><li>Joensuu, H., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+management+of+gastrointestinal+stromal+tumors:+a+model+for+targeted+and+multidisciplinary+therapy+of+malignancy.">The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy.</a> Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).</li><li>Blanke, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+results+from+a+randomized+phase+II+trial+of+standard-+versus+higher-dose+imatinib+mesylate+for+patients+with+unresectable+or+metastatic+gastrointestinal+stromal+tumors+expressing+KIT.">Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).</li><li>Demetri, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+regorafenib+for+advanced+gastrointestinal+stromal+tumours+after+failure+of+imatinib+and+sunitinib+(GRID):+an+international,+multicentre,+randomised,+placebo-controlled,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial.</a> Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).</li><li>Gold, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcome+of+metastatic+GIST+in+the+era+before+tyrosine+kinase+inhibitors.">Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).</li><li>Huynh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib+induces+growth+suppression+in+mouse+models+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).</li><li>Na, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+xenografts+from+patients+with+gastrointestinal+stromal+tumors:+analysis+of+clinicopathological+characteristics+related+to+engraftment+success.">Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).</li><li>Balachandran, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+potentiates+antitumor+T+cell+responses+in+gastrointestinal+stromal+tumor+through+the+inhibition+of+Ido.">Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido.</a> Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).</li><li>Vitiello, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+immune+profiles+distinguish+the+mutational+subtypes+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).</li><li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase.">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).</li><li>Cavnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIT+oncogene+inhibition+drives+intratumoral+macrophage+M2+polarization.">KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).</li><li>Medina, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+kinase+inhibition+limits+Batf3-dependent+dendritic+cell+development+and+antitumor+immunity.">Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).</li><li>Zhang, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+CD8(+)+T+cells+mediate+the+antitumor+efficacy+of+combined+CD40+ligation+and+imatinib+therapy+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).</li><li>. General Protocol for Western Blotting Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf</a> (2022)</li><li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+formalin-fixed,+paraffin+embedded+blocks.">Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 253-268 (2019).</li><li>Sy, J., Ang, L. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtomy:+Cutting+formalin-fixed,+paraffin-embedded+sections.">Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 269-278 (2019).</li><li>Seifert, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1/PD-L1+blockade+enhances+T-cell+activity+and+antitumor+efficacy+of+imatinib+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors.</a> Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+KIT+modulates+Type+I+IFN-mediated+antitumor+immunity+in+GIST.">Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST.</a> Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).</li><li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Kit+signaling+and+therapeutic+intervention+in+a+mouse+model+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).</li></ol>

Het KitV558Δ/+ muismodel is een krachtig onderzoeksinstrument in de moleculaire en immunologische analyse van GIST. Hoewel de fokstrategie een enkele kruising vereist, vereist het gebruik van KitV558Δ / + muiscohorten in experimenten die de tumorrespons analyseren, uitgebreide fokkerij. Muizen moeten leeftijds- en geslachtsgematcht zijn om vergelijkbare tumorgewichten te garanderen, en 10% van de muizen sterft vóór de leeftijd van 8 weken wanneer tumoren worden vastgesteld. Min...

GIST is het meest voorkomende sarcoom bij mensen met een incidentie van ongeveer 6.000 gevallen in de Verenigde Staten van Amerika1. GIST lijkt afkomstig te zijn van de gastro-intestinale pacemakercellen die de interstitiële cellen van Cajal worden genoemd en wordt meestal aangedreven door een enkele mutatie in de tyrosinekinase KIT of PDGFRA2. Chirurgie is de steunpilaar van de behandeling voor GIST en kan curatief zijn, maar patiënten met een gevorderde ziekte kunnen worden behandeld met de tyrosinekinaseremmer (TKI), imatinib. Sinds de introductie meer dan 20 jaar geleden heeft imatinib het behandelingsparadigma in GIST getransformeerd, waardoor de overleving bij gevorderde ziekte is verbeterd van 1 naar meer dan 5 jaar 3,4,5. Helaas is imatinib zelden curatief vanwege verworven KIT-mutaties, dus nieuwe behandelingen zijn nodig voor deze tumor.
Muismodellen zijn een belangrijk onderzoeksinstrument bij het onderzoek naar nieuwe therapieën bij kanker. Meerdere subcutane xenograft- en patiënt-afgeleide xenograftmodellen zijn ontwikkeld en onderzocht in GIST 6,7. Immunodeficiënte muizen vertegenwoordigen echter niet volledig menselijke GIST, omdat GISTs differentiële immuunprofielen hebben, afhankelijk van hun oncogene mutatie, en het veranderen van de gastro-intestinale tumormicro-omgeving verbetert de effecten van TKI-therapie 8,9. De KitV558Δ/+ muis heeft een heterozygote kiembaandeletie in Kit exon 11, die codeert voor het juxtamembrane domein, de meest gemuteerde plaats in menselijke GIST10. KitV558Δ/+ muizen ontwikkelen een enkele cecale GIST met 100% penetrantie, en tumoren hebben vergelijkbare histologie, moleculaire signalering, immuuninfiltratie en respons op therapie als menselijke GIST 8,11,12,13. Hier beschrijven we het fokken, behandelen en isoleren en verwerken van monsters in KitV558Δ / + muizen voor gebruik in moleculair en immunologisch onderzoek in GIST.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x RBC lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mL syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody (C67E7)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini edta free protease inhibitor</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C852A34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Exel International</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C756V81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dog1 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab64085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C788U23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 850 Homogenizer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imatinib mesylate</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT antibody (D13A2)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KitV558&#916;/+ Genotyping</td>
			<td>Transnetyx</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1620145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9121673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody (S473)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-KIT antibody (Y719)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proeinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP170050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes</td>
			<td>Falcon/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS buffer (10x)</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (100mm2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Falcon</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisHCL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1757500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;vivaCT 80 platform</td>
			<td>Scanco medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor

Gastro-intestinale stromale tumor (GIST) is het meest voorkomende menselijke sarcoom en wordt meestal aangedreven door een enkele mutatie in de KIT-receptor. Voor alle tumortypen zijn talloze muismodellen ontwikkeld om de volgende generatie kankertherapieën te onderzoeken. In GIST gebruiken de meeste in vivo studies echter xenograft muismodellen die inherente beperkingen hebben. Hier beschrijven we een immunocompetent, genetisch gemanipuleerd muismodel van gastro-intestinale stromale tumor met een KitV558Δ / + -mutatie. In dit model wordt mutant KIT, het oncogen dat verantwoordelijk is voor de meeste GISTs, aangedreven door zijn endogene promotor die leidt tot een GIST die het histologische uiterlijk en immuuninfiltraat nabootst dat wordt gezien in menselijke GISTs. Bovendien is dit model met succes gebruikt om zowel gerichte moleculaire als immuuntherapieën te onderzoeken. Hier beschrijven we het fokken en onderhouden van een KitV558Δ/+ muizenkolonie. Daarnaast beschrijft dit artikel de behandeling en verkrijging van GIST, drainerende mesenteriale lymfeklier en aangrenzende blindedarm in KitV558Δ / + -muizen, evenals monstervoorbereiding voor moleculaire en immunologische analyses.

Het KitV558Δ/+ muismodel maakt het mogelijk om therapieën te onderzoeken in een immunocompetent muismodel. KitV558Δ/+ muizen hebben een gemiddelde levensduur van 8 maanden als gevolg van progressieve darmobstructie (figuur 4). Tumoren van KitV558Δ/+ muizen drukken canonieke markers van GIST uit, waaronder de tyrosinekinase KIT en het transmembraankanaal DOG1 (<strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor at JoVE.com

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

Het doel van dit manuscript is om het KitV558Δ/+ muismodel en technieken voor succesvolle dissectie en verwerking van muismonsters te beschrijven.

Moleculaire en immunologische technieken in een genetisch gemanipuleerd muismodel van gastro-intestinale stromale tumor

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

Ons protocol beschrijft de veredeling, het onderhoud, de dissectie en de monsterverwerking van het enige immunocompetente muismodel, GIST, dat momenteel in gebruik is. We hopen dat toekomstige onderzoekers dit muismodel kunnen gebruiken om translationeel onderzoek in GIST te bevorderen. Traditionele therapieën in GIST omvatten gerichte moleculaire therapie met tyrosinekinaseremmers.Dit model stelt onderzoekers in staat om immunotherapieën in GIST te testen. Om te beginnen, steriliseer alle instrumenten, draag handschoenen tijdens de procedure en onderhoud een steriel veld. Bereid het gebied van incisie voor met 70% ethanol.Maak met een schaar een verticale incisie van twee centimeter in de middellijn en ga de buikholte in. Lyseer scherp eventuele intra-abdominale verklevingen. Om de drainerende mesenteriale lymfeklier te verwijderen, identificeert u de blindedarm en tilt u het mesenterium superieur op.Ongeveer halverwege de basis van het colon mesenterium, identificeer de mesenteriale lymfeklier en ontleed deze scherp. Verdeel indien nodig lymfeklierweefsel in derden voor eiwitisolatie, histologie en eencellige suspensie. Plaats lymfeklierweefsel in 20 milliliter RPMI-medium voor eencellige suspensies en houd op ijs.De blindedarm wordt meestal vervangen door een GIST bij de Kit558 muizen. Voor isolatie van de GIST en blindedarm, deel de ileocolic junction zorgvuldig van de basis van de tumor. Deel vervolgens de blindedarm opnieuw, twee centimeter distaal naar de basis van de tumor.Bij 50 tot 60% van de Kit558-muizen bevat het hoofd van de tumor een dop van cecal-weefsel, dat meestal sereuze vloeistof bevat, maar zelden pus kan bevatten. Ontleed het dopweefsel scherp weg van het tumorweefsel. Verdeel het tumorweefsel en de blindedarm in drieën voor eiwitisolatie, histologie en eencellige suspensie.Plaats voor eencellige suspensies tumorweefsel of blindedarm in HBSS met 2% FCS, genoeg om het monster te bedekken en op ijs te houden. Giet RPMI-media met het lymfekliermonster over een filter van 100 micrometer. Verplaats het filter naar een nieuwe conische 50 milliliter en pureer de lymfeklier met het zachte uiteinde van een plastic spuit van drie milliliter.Wasfilter met 20 milliliter RPMI-media. Centrifugeer de monsters en zuig het supernatant aan. Resuspendeer de pellet in 20 milliliter kraalbuffer en giet over een filter van 40 micrometer.Verzamel het celfiltraat. Tel cellen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de monsters en gooi het supernatant weg.Resuspendeer vervolgens in kraalbuffer voor flowcytometrie. Bereid collagenasebuffer voor zoals beschreven in het tekstmanuscript. Doe GIST in een steriele schaal en voeg 2,5 milliliter collagenasebuffer toe.Gebruik een steriel scalpel en een schaar om de tumor te hakken totdat deze in fijne fragmenten zit. Gebruik een pipet met grote boring om de tumor en collagenase in een buis van 50 milliliter te zuigen. Incubeer het bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten met 100 rotaties per minuut en doof de reactie vervolgens met twee milliliter FBS.Giet collagenase met GIST-monster over een filter van 100 micrometer en pureer de tumor met het zachte uiteinde van een plastic spuit van drie milliliter en verzamel in een buis van 50 milliliter. Wasfilter met 20 milliliter HBSS. Centrifugeer het filtraat op 450 RCF gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant vervolgens weg.Resuspendeer de pellet in 20 milliliter kraalbuffer en giet over een filter van 40 micrometer Verzamel het filtraat en tel cellen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer en aspirateer het supernatant en resuspenseer vervolgens in kraalbuffer voor flowcytometrie. Splits met behulp van een schaar de blindedarm in de lengterichting om het binnenste slijmvlies bloot te leggen.Snijd het in secties van 0,5 centimeter en plaats het in een buis van 50 milliliter met vijf milliliter HBSS en 2% FBS. Schud krachtig gedurende 30 seconden en centrifugeer gedurende 20 seconden op 450 RCF. Gooi vervolgens het supernatant weg.Voeg vijf tot 20 milliliter HBSS toe met twee millimolaire EDTA. Incubeer het bij 37 graden Celsius bij 100 rotaties per minuut gedurende 15 minuten. Centrifugeer en gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet vervolgens in vijf tot 20 milliliter HBSS.Schud het mengsel krachtig gedurende 30 seconden, centrifugeer vervolgens op 450 RCF gedurende 20 seconden en gooi het supernatant weg. Herhaal dit proces nogmaals. Resuspendeer de pellet in vijf milliliter collagenasebuffer en incubeer deze vervolgens bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten met 100 rotaties per minuut.Schud krachtig om de 10 minuten en doof de reactie met twee milliliter FBS. Giet collagenase met blindedarmmonster over een filter van 100 micrometer en pureer met het zachte uiteinde van een plastic spuit van drie milliliter. Was het filter met 20 milliliter HBSS en vang het filtraat op.Centrifugeer en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de pellet in 20 milliliter kraalbuffer en giet over een filter van 40 micrometer. Verzamel filtraat en tel cellen met behulp van een hemocytometer.Herhaal het centrifugatieproces nogmaals en resuspenseer de pellet in kraalbuffer voor flowcytometrie. De Kit558-muizen hadden een gemiddelde levensduur van acht maanden als gevolg van progressieve darmobstructie. Tumoren van de Kit558-muizen brachten canonieke markers van GIST tot expressie, waaronder de tyrosinekinase KIT, het transmembraankanaal Dog1 en de transcriptiefactor ETV1.Tumoren werden bestudeerd voor veranderingen in de KIT-signaleringsroute zoals de downstream markers ERK en AKT of immuunmicro-omgeving, die de menselijke GIST nauw nabootsten. MRI of CT werd gebruikt om het tumorvolume te volgen als een nauwkeurige meting van de tumorrespons. Het ontleden van de tumor weg van de ileocolic junction en weg van de cecal cap is belangrijk om het werkelijke tumorgewicht en immuun- en moleculaire analyse vast te leggen.Binnen GIST heeft dit model het onderzoek van de micro-omgeving van de tumor mogelijk gemaakt, evenals immunotherapieën.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

De Colon-26 carcinoom Tumor-dragende Mouse als een model voor de studie van kankercachexia

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Een muizen orthotope Blaas Tumor Model en Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolatie van circulerende tumorcellen in een orthotopische muismodel van colorectale kanker

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Een genetisch ontwikkeld muis model van sporadische colorectale kanker

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Engraftment van de tumor in een muismodel van Xenograft van menselijke mantel cel lymfoom

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Utilizing High Resolution Ultrasound to Monitor Tumor Onset and Growth in Genetically Engineered Pancreatic Cancer Models

Met behulp van hoge resolutie echografie naar Monitor Tumor ontstaan en groei in genetisch gemanipuleerde alvleesklierkanker modellen

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

In vitro oprichting van een genetisch gemanipuleerde Muriene hoofd en nekkanker cellijn met behulp van een adeno-geassocieerde virus-Cas9 systeem

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Een nieuwe Stromal Fibroblast-Gemoduleerde 3D Tumor Sferoïde Model voor het bestuderen van Tumor-Stroma Interactie en Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Een muismodel om de rol van kanker-geassocieerde fibroblasten in tumorgroei te onderzoeken

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...