Name: molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor
Uploaded: 2022-05-02T15:00:00
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Les souris kitV558Δ/+ ont été génétiquement modifiées et partagées par le Dr Peter Besmer10. Ce travail a été soutenu par les subventions R01 CA102613 et T32 CA251063 des NIH.

Toutes les souris ont été hébergées dans des conditions exemptes d’agents pathogènes à l’Université de Pennsylvanie conformément aux directives des NIH et avec l’approbation de l’IACUC de l’Université de Pennsylvanie. L’euthanasie a été effectuée conformément aux procédures opérationnelles normalisées des ressources pour animaux de laboratoire de l’Université de Pennsylvanie.
1. KitV558Δ/+ élevage de souris...

<ol>
	<li>Mastrangelo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+soft+tissue+sarcoma+and+beyond:+a+population-based+prospective+study+in+3+European+regions.">Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions.</a> Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).</li><li>Joensuu, H., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+management+of+gastrointestinal+stromal+tumors:+a+model+for+targeted+and+multidisciplinary+therapy+of+malignancy.">The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy.</a> Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).</li><li>Blanke, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+results+from+a+randomized+phase+II+trial+of+standard-+versus+higher-dose+imatinib+mesylate+for+patients+with+unresectable+or+metastatic+gastrointestinal+stromal+tumors+expressing+KIT.">Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).</li><li>Demetri, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+regorafenib+for+advanced+gastrointestinal+stromal+tumours+after+failure+of+imatinib+and+sunitinib+(GRID):+an+international,+multicentre,+randomised,+placebo-controlled,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial.</a> Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).</li><li>Gold, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcome+of+metastatic+GIST+in+the+era+before+tyrosine+kinase+inhibitors.">Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).</li><li>Huynh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib+induces+growth+suppression+in+mouse+models+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).</li><li>Na, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+xenografts+from+patients+with+gastrointestinal+stromal+tumors:+analysis+of+clinicopathological+characteristics+related+to+engraftment+success.">Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).</li><li>Balachandran, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+potentiates+antitumor+T+cell+responses+in+gastrointestinal+stromal+tumor+through+the+inhibition+of+Ido.">Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido.</a> Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).</li><li>Vitiello, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+immune+profiles+distinguish+the+mutational+subtypes+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).</li><li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase.">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).</li><li>Cavnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIT+oncogene+inhibition+drives+intratumoral+macrophage+M2+polarization.">KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).</li><li>Medina, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+kinase+inhibition+limits+Batf3-dependent+dendritic+cell+development+and+antitumor+immunity.">Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).</li><li>Zhang, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+CD8(+)+T+cells+mediate+the+antitumor+efficacy+of+combined+CD40+ligation+and+imatinib+therapy+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).</li><li>. General Protocol for Western Blotting Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf</a> (2022)</li><li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+formalin-fixed,+paraffin+embedded+blocks.">Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 253-268 (2019).</li><li>Sy, J., Ang, L. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtomy:+Cutting+formalin-fixed,+paraffin-embedded+sections.">Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 269-278 (2019).</li><li>Seifert, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1/PD-L1+blockade+enhances+T-cell+activity+and+antitumor+efficacy+of+imatinib+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors.</a> Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+KIT+modulates+Type+I+IFN-mediated+antitumor+immunity+in+GIST.">Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST.</a> Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).</li><li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Kit+signaling+and+therapeutic+intervention+in+a+mouse+model+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).</li></ol>

Le modèle murin Kit V558Δ/+ est un puissant outil de recherche dans l’analyse moléculaire et immunologique du GIST. Bien que la stratégie de sélection nécessite un seul croisement, l’utilisation de cohortes de souris KitV558Δ / + dans des expériences analysant la réponse tumorale nécessite une reproduction approfondie. Les souris doivent être appariées selon l’âge et le sexe pour assurer des poids tumoraux similaires, et 10% des souris meurent avant l’âge de 8...

GIST est le sarcome le plus fréquent chez l’homme avec une incidence d’environ 6 000 cas aux États-Unis d’Amérique1. GIST semble provenir des cellules du stimulateur cardiaque gastro-intestinal appelées cellules interstitielles de Cajal, et est généralement entraîné par une seule mutation dans la tyrosine kinase KIT ou PDGFRA2. La chirurgie est le pilier du traitement de la GIST et peut être curative, mais les patients atteints d’une maladie avancée peuvent être traités avec l’inhibiteur de la tyrosine kinase (ITK), l’imatinib. Depuis son introduction il y a plus de 20 ans, l’imatinib a transformé le paradigme de traitement dans GIST, améliorant la survie dans les maladies avancées de 1 à plus de 5 ans 3,4,5. Malheureusement, l’imatinib est rarement curatif en raison de mutations KIT acquises, de sorte que de nouveaux traitements sont nécessaires pour cette tumeur.
Les modèles murins sont un outil de recherche important dans la recherche de nouvelles thérapies contre le cancer. Plusieurs modèles de xénogreffe sous-cutanée et de xénogreffe dérivés du patient ont été développés et étudiés dans GIST 6,7. Cependant, les souris immunodéficientes ne représentent pas entièrement les GIST humains, car les TIST présentent des profils immunitaires différentiels en fonction de leur mutation oncogène, et la modification du microenvironnement tumoral gastro-intestinal améliore les effets du traitement par TKI 8,9. La souris KitV558Δ/+ a une délétion germinale hétérozygote dans l’exon 11 du Kit, qui code le domaine juxtamembranaire, le site le plus fréquemment muté dans le GIST10 humain. Les souris KitV558Δ / + développent un seul GIST cæcal avec une pénétrance de 100%, et les tumeurs ont une histologie, une signalisation moléculaire, une infiltration immunitaire et une réponse au traitement similaires à celles de la GISThumaine 8,11,12,13. Ici, nous décrivons la sélection, le traitement et l’isolement et le traitement des échantillons chez des souris KitV558Δ / + pour une utilisation dans la recherche moléculaire et immunologique dans GIST.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x RBC lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mL syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody (C67E7)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini edta free protease inhibitor</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C852A34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Exel International</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C756V81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dog1 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab64085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C788U23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 850 Homogenizer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imatinib mesylate</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT antibody (D13A2)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KitV558&#916;/+ Genotyping</td>
			<td>Transnetyx</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1620145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9121673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody (S473)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-KIT antibody (Y719)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proeinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP170050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes</td>
			<td>Falcon/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS buffer (10x)</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (100mm2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Falcon</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisHCL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1757500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;vivaCT 80 platform</td>
			<td>Scanco medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor

La tumeur stromale gastro-intestinale (GIST) est le sarcome humain le plus courant et est généralement entraînée par une seule mutation du récepteur KIT. Parmi les types de tumeurs, de nombreux modèles murins ont été développés afin d’étudier la prochaine génération de thérapies contre le cancer. Cependant, dans GIST, la plupart des études in vivo utilisent des modèles murins de xénogreffe qui ont des limites inhérentes. Ici, nous décrivons un modèle murin immunocompétent et génétiquement modifié de tumeur stromale gastro-intestinale hébergeant une mutation KitV558Δ / +. Dans ce modèle, le KIT mutant, l’oncogène responsable de la plupart des TIST, est entraîné par son promoteur endogène conduisant à un GIST qui imite l’apparence histologique et l’infiltrat immunitaire observés dans les GIST humains. En outre, ce modèle a été utilisé avec succès pour étudier à la fois des thérapies moléculaires et immunitaires ciblées. Nous décrivons ici l’élevage et l’entretien d’une colonie de souris KitV558Δ/+ . De plus, cet article détaille le traitement et l’approvisionnement du GIST, du ganglion lymphatique mésentérique drainant et du caecum adjacent chez les souris kitV558Δ/+ , ainsi que la préparation des échantillons pour les analyses moléculaires et immunologiques.

Le modèle murin Kit V558Δ/+ permet d’étudier des traitements dans un modèle murin immunocompétent. Les souris kitV558Δ/+ ont une durée de vie moyenne de 8 mois en raison d’une occlusion intestinale progressive (Figure 4). Les tumeurs des souris KitV558Δ/+ expriment des marqueurs canoniques de GIST, y compris la tyrosine kinase KIT et le canal transmembranaire DOG1 (<stro...

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Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

L’objectif de ce manuscrit est de décrire le modèle de souris KitV558Δ/+ et les techniques de dissection et de traitement réussis des spécimens de souris.

Techniques moléculaires et immunologiques dans un modèle murin génétiquement modifié de tumeur stromale gastro-intestinale

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

Notre protocole décrit la reproduction, l’entretien, la dissection et le traitement des échantillons du seul modèle de souris immunocompétent, GIST, actuellement utilisé. Nous espérons que les futurs chercheurs seront en mesure d’utiliser ce modèle murin afin de poursuivre la recherche translationnelle dans GIST. Les thérapies traditionnelles dans GIST impliquent une thérapie moléculaire ciblée avec des inhibiteurs de la tyrosine kinase.Ce modèle permet aux chercheurs de tester des immunothérapies dans le GIST. Pour commencer, stérilisez tous les instruments, portez des gants tout au long de la procédure et maintenez un champ stérile. Préparez la zone d’incision avec de l’éthanol à 70%.À l’aide de ciseaux, faites une incision verticale médiane de deux centimètres et entrez dans la cavité abdominale. Lyser brusquement toutes les adhérences intra-abdominales. Pour enlever le ganglion lymphatique mésentérique drainant, identifiez le caecum et soulevez son mésentère de manière supérieure.Environ à mi-chemin de la base du mésentère du côlon, identifiez le ganglion lymphatique mésentérique et disséquez-le brusquement. Au besoin, divisez le tissu ganglionnaire en tiers pour l’isolement des protéines, l’histologie et la suspension unicellulaire. Placer le tissu ganglionnaire dans 20 millilitres de milieu RPMI pour les suspensions unicellulaires et garder sur la glace.Le caecum est principalement remplacé par un GIST chez les souris Kit558. Pour isoler le GIST et le caecum, divisez soigneusement la jonction iléocolique de la base de la tumeur. Ensuite, divisez à nouveau le caecum, deux centimètres distaux à la base de la tumeur.Chez 50 à 60% des souris Kit558, la tête de la tumeur contient un capuchon de tissu cæcal, qui contient généralement du liquide séreux, mais peut rarement contenir du pus. Disséquez brusquement le tissu de la calotte loin du tissu tumoral. Divisez le tissu tumoral et le caecum en tiers pour l’isolement des protéines, l’histologie et la suspension unicellulaire.Pour les suspensions unicellulaires, placez le tissu tumoral ou le caecum dans HBSS avec 2% FCS, assez pour couvrir l’échantillon et le garder sur la glace. Versez le milieu RPMI avec l’échantillon de ganglions lymphatiques sur un filtre de 100 micromètres. Déplacez le filtre vers un nouveau conique de 50 millilitres et écrasez le ganglion lymphatique avec l’extrémité souple d’une seringue en plastique de trois millilitres.Filtre de lavage avec 20 millilitres de média RPMI. Centrifugez les échantillons et aspirez le surnageant. Remettez en suspension la pastille dans 20 millilitres de tampon de billes et versez sur un filtre de 40 micromètres.Recueillir le filtrat cellulaire. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifugez les échantillons et jetez le surnageant.Ensuite, remettez en suspension dans un tampon de billes pour la cytométrie en flux. Préparez un tampon de collagénase comme décrit dans le manuscrit textuel. Placez GIST dans un plat stérile et ajoutez 2,5 millilitres de tampon de collagénase.À l’aide d’un scalpel stérile et de ciseaux, hachez la tumeur jusqu’à ce qu’elle soit en fragments fins. Utilisez une pipette de gros calibre pour aspirer la tumeur et la collagénase dans un tube de 50 millilitres. Incubez-le à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes à 100 rotations par minute, puis éteignez la réaction avec deux millilitres de FBS.Versez la collagénase avec un échantillon GIST sur un filtre de 100 micromètres et écrasez la tumeur avec l’extrémité molle d’une seringue en plastique de trois millilitres et collectez dans un tube de 50 millilitres. Filtre de lavage avec 20 millilitres de HBSS. Centrifuger le filtrat à 450 RCF pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, puis éliminer le surnageant.Remettre la pastille dans 20 millilitres de tampon de billes et verser sur un filtre de 40 micromètres Recueillir le filtrat et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifugez et aspirez le surnageant, puis remettez-le en suspension dans un tampon de billes pour la cytométrie en flux. À l’aide de ciseaux, fendez le caecum longitudinalement pour exposer la muqueuse interne.Coupez-le en sections de 0,5 centimètre et placez-le dans un tube de 50 millilitres avec cinq millilitres de HBSS et 2% de FBS. Agiter vigoureusement pendant 30 secondes et centrifuger à 450 RCF pendant 20 secondes. Ensuite, jetez le surnageant.Ajouter cinq à 20 millilitres de HBSS avec de l’EDTA de deux millimolaires. Incubez-le à 37 degrés Celsius à 100 rotations par minute pendant 15 minutes. Centrifuger et jeter le surnageant, puis remettre la pastille en suspension dans cinq à 20 millilitres de HBSS.Agiter vigoureusement le mélange pendant 30 secondes, puis centrifuger à 450 FCR pendant 20 secondes et jeter le surnageant. Répétez ce processus une fois de plus. Remettez la pastille dans cinq millilitres de tampon de collagénase, puis incuvrez-la à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes à 100 rotations par minute.Agiter vigoureusement toutes les 10 minutes et éteindre la réaction avec deux millilitres de FBS. Versez la collagénase avec un échantillon de cæcum sur un filtre de 100 micromètres et écrasez-la avec l’extrémité souple d’une seringue en plastique de trois millilitres. Lavez le filtre avec 20 millilitres de HBSS et collectez le filtrat.Centrifuger et jeter le surnageant. Remettez en suspension la pastille dans 20 millilitres de tampon de billes et versez sur un filtre de 40 micromètres. Recueillir le filtrat et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.Répétez le processus de centrifugation une fois de plus et remettez en suspension la pastille dans un tampon de billes pour la cytométrie en flux. Les souris Kit558 avaient une durée de vie moyenne de huit mois en raison d’une occlusion intestinale progressive. Les tumeurs des souris Kit558 ont exprimé des marqueurs canoniques de GIST, y compris la tyrosine kinase KIT, le canal transmembranaire Dog1 et le facteur de transcription ETV1.Les tumeurs ont été étudiées pour des changements dans la voie de signalisation KIT tels que les marqueurs en aval ERK et AKT ou le microenvironnement immunitaire, qui imitait étroitement le GIST humain. L’IRM ou la tomodensitométrie a été utilisée pour suivre le volume tumoral en tant que mesure précise de la réponse tumorale. Disséquer la tumeur loin de la jonction iléocolique et loin du capuchon cæcal est important pour capturer le poids réel de la tumeur et l’analyse immunitaire et moléculaire.Au sein du GIST, ce modèle a permis d’étudier le microenvironnement tumoral, ainsi que les immunothérapies.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

le<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Tumor Disc Modèle: Visualisation et quantification de l&#39;expression génique et de tumeurs invasives utilisant Mosaïques génétique

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Recherche

Recherche en cancérologie

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Le Colon-26 Carcinome portant une tumeur de la souris comme modèle pour l&#39;étude du cancer cachexie

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Un système de détection de tumeur modèle et tumeur murine Orthotopique vessie

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolation des cellules tumorales circulantes dans un modèle de souris orthotopique du cancer colorectal

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Un modèle de souris génétiquement modifiée de cancer colorectal sporadique

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Greffe de la tumeur dans un modèle murin de xénogreffe de lymphome du manteau homme

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Utilizing High Resolution Ultrasound to Monitor Tumor Onset and Growth in Genetically Engineered Pancreatic Cancer Models

Utilisant des ultrasons de haute résolution à l’apparition de tumeur de moniteur et de la croissance dans les modèles issus du génie génétique du cancer du pancréas

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Un nouveau modèle 3D de Sphéroïde de tumeur de Stromal-Modulé pour étudier l’interaction de tumeur-Stroma et la découverte de drogue

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Un modèle murin pour étudier le rôle des fibroblastes associés au cancer dans la croissance tumorale

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...