Name: molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor
Uploaded: 2022-05-02T15:00:00
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KitV558Δ/+ Mäuse wurden gentechnisch verändert und von Dr. Peter Besmer10 geteilt. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01 CA102613 und T32 CA251063 unterstützt.

Alle Mäuse wurden unter pathogenfreien Bedingungen an der University of Pennsylvania nach NIH-Richtlinien und mit Genehmigung der University of Pennsylvania IAUC untergebracht. Euthanasie wurde nach den Standardarbeitsanweisungen der University of Pennsylvania Laboratory Animal Resources durchgeführt.
1. KitV558Δ/+ Mauszucht
<ol><li>Überqueren Sie die KitV558Δ/+ Mäuse mehr als 10 Mal auf einem C57BL/6...

<ol>
	<li>Mastrangelo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+soft+tissue+sarcoma+and+beyond:+a+population-based+prospective+study+in+3+European+regions.">Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions.</a> Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).</li><li>Joensuu, H., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+management+of+gastrointestinal+stromal+tumors:+a+model+for+targeted+and+multidisciplinary+therapy+of+malignancy.">The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy.</a> Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).</li><li>Blanke, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+results+from+a+randomized+phase+II+trial+of+standard-+versus+higher-dose+imatinib+mesylate+for+patients+with+unresectable+or+metastatic+gastrointestinal+stromal+tumors+expressing+KIT.">Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).</li><li>Demetri, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+regorafenib+for+advanced+gastrointestinal+stromal+tumours+after+failure+of+imatinib+and+sunitinib+(GRID):+an+international,+multicentre,+randomised,+placebo-controlled,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial.</a> Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).</li><li>Gold, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcome+of+metastatic+GIST+in+the+era+before+tyrosine+kinase+inhibitors.">Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).</li><li>Huynh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib+induces+growth+suppression+in+mouse+models+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).</li><li>Na, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+xenografts+from+patients+with+gastrointestinal+stromal+tumors:+analysis+of+clinicopathological+characteristics+related+to+engraftment+success.">Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).</li><li>Balachandran, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+potentiates+antitumor+T+cell+responses+in+gastrointestinal+stromal+tumor+through+the+inhibition+of+Ido.">Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido.</a> Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).</li><li>Vitiello, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+immune+profiles+distinguish+the+mutational+subtypes+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).</li><li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase.">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).</li><li>Cavnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIT+oncogene+inhibition+drives+intratumoral+macrophage+M2+polarization.">KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).</li><li>Medina, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+kinase+inhibition+limits+Batf3-dependent+dendritic+cell+development+and+antitumor+immunity.">Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).</li><li>Zhang, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+CD8(+)+T+cells+mediate+the+antitumor+efficacy+of+combined+CD40+ligation+and+imatinib+therapy+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).</li><li>. General Protocol for Western Blotting Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf</a> (2022)</li><li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+formalin-fixed,+paraffin+embedded+blocks.">Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 253-268 (2019).</li><li>Sy, J., Ang, L. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtomy:+Cutting+formalin-fixed,+paraffin-embedded+sections.">Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 269-278 (2019).</li><li>Seifert, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1/PD-L1+blockade+enhances+T-cell+activity+and+antitumor+efficacy+of+imatinib+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors.</a> Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+KIT+modulates+Type+I+IFN-mediated+antitumor+immunity+in+GIST.">Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST.</a> Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).</li><li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Kit+signaling+and+therapeutic+intervention+in+a+mouse+model+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).</li></ol>

Das Mausmodell KitV558Δ/+ ist ein leistungsfähiges Forschungswerkzeug in der molekularen und immunologischen Analyse von GIST. Obwohl die Züchtungsstrategie eine einzige Kreuzung erfordert, erfordert die Verwendung von KitV558Δ/+ Mauskohorten in Experimenten, die die Tumorreaktion analysieren, eine umfangreiche Zucht. Mäuse sollten alters- und geschlechtsgerecht sein, um ähnliche Tumorgewichte zu gewährleisten, und 10% der Mäuse sterben vor dem Alter von 8 Wochen, wenn Tumo...

GIST ist das häufigste Sarkom beim Menschen mit einer Inzidenz von etwa 6.000 Fällen in den Vereinigten Staaten von Amerika1. GIST scheint von den gastrointestinalen Schrittmacherzellen zu stammen, die als interstitielle Zellen von Cajal bezeichnet werden, und wird typischerweise durch eine einzige Mutation in der Tyrosinkinase KIT oder PDGFRA2 angetrieben. Chirurgie ist die Hauptstütze der Behandlung von GIST und kann kurativ sein, aber Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung können mit dem Tyrosinkinase-Inhibitor (TKI), Imatinib, behandelt werden. Seit seiner Einführung vor über 20 Jahren hat Imatinib das Behandlungsparadigma in GIST verändert und das Überleben bei fortgeschrittenen Erkrankungen von 1 auf über 5 Jahreverbessert 3,4,5. Leider ist Imatinib aufgrund erworbener KIT-Mutationen selten kurativ, so dass neue Behandlungen für diesen Tumor erforderlich sind.
Mausmodelle sind ein wichtiges Forschungsinstrument bei der Erforschung neuartiger Therapien bei Krebserkrankungen. Mehrere subkutane Xenotransplantat- und patientenabgeleitete Xenograft-Modelle wurden in GIST 6,7 entwickelt und untersucht. Immundefiziente Mäuse repräsentieren jedoch nicht vollständig die menschliche GIST, da GISTs je nach onkogener Mutation unterschiedliche Immunprofile aufweisen und die Veränderung der gastrointestinalen Tumormikroumgebung die Wirkung der TKI-Therapie verbessert 8,9. Die Kit V558Δ/+ Maus hat eine heterozygote Keimbahndeletion in Kit Exon 11, die die Juxtamembrandomäne kodiert, die am häufigsten mutierte Stelle im menschlichen GIST10. KitV558Δ/+ Mäuse entwickeln ein einzelnes CECAL GIST mit 100% Penetranz, und Tumore haben eine ähnliche Histologie, molekulare Signalgebung, Immuninfiltration und Reaktion auf die Therapie wie menschliche GIST 8,11,12,13. Hier beschreiben wir die Züchtung, Behandlung und Probenisolierung und -verarbeitung in KitV558Δ/+-Mäusen für den Einsatz in der molekularen und immunologischen Forschung in GIST.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x RBC lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mL syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody (C67E7)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini edta free protease inhibitor</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C852A34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Exel International</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C756V81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dog1 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab64085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C788U23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 850 Homogenizer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imatinib mesylate</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT antibody (D13A2)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KitV558&#916;/+ Genotyping</td>
			<td>Transnetyx</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1620145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9121673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody (S473)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-KIT antibody (Y719)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proeinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP170050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes</td>
			<td>Falcon/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS buffer (10x)</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (100mm2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Falcon</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisHCL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1757500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;vivaCT 80 platform</td>
			<td>Scanco medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor

Der gastrointestinale Stromatumor (GIST) ist das häufigste menschliche Sarkom und wird typischerweise durch eine einzige Mutation im KIT-Rezeptor verursacht. Über alle Tumorarten hinweg wurden zahlreiche Mausmodelle entwickelt, um die nächste Generation von Krebstherapien zu untersuchen. In GIST verwenden die meisten In-vivo-Studien jedoch Xenograft-Mausmodelle, die inhärente Einschränkungen aufweisen. Hier beschreiben wir ein immunkompetentes, gentechnisch verändertes Mausmodell eines gastrointestinalen Stromatumors, der eine KitV558Δ/+ Mutation beherbergt. In diesem Modell wird das mutierte KIT, das für die meisten GISTs verantwortliche Onkogen, von seinem endogenen Promotor angetrieben, was zu einem GIST führt, der das histologische Erscheinungsbild und das Immuninfiltrat in menschlichen GISTs nachahmt. Darüber hinaus wurde dieses Modell erfolgreich eingesetzt, um sowohl gezielte molekulare als auch Immuntherapien zu untersuchen. Hier beschreiben wir die Zucht und Pflege einer KitV558Δ/+ Mauskolonie. Darüber hinaus beschreibt dieses Papier die Behandlung und Beschaffung von GIST, drainierendem mesenterialen Lymphknoten und angrenzendem Blinddarm in KitV558Δ / + -Mäusen sowie die Probenvorbereitung für molekulare und immunologische Analysen.

Das Mausmodell KitV558Δ/+ ermöglicht die Untersuchung von Therapeutika in einem immunkompetenten Mausmodell. KitV558Δ/+ Mäuse haben aufgrund einer fortschreitenden Darmobstruktion eine durchschnittliche Lebensdauer von 8 Monaten (Abbildung 4). Tumore von KitV558Δ/+-Mäusen exprimieren kanonische Marker von GIST, einschließlich der Tyrosinkinase KIT und des Transmembrankanals DOG1 (<strong clas...

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Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

Das Ziel dieses Manuskripts ist es, das KitV558Δ/+ Mausmodell und Techniken für die erfolgreiche Dissektion und Verarbeitung von Mausproben zu beschreiben.

Molekulare und immunologische Techniken in einem gentechnisch veränderten Mausmodell des gastrointestinalen Stromatumors

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

Unser Protokoll beschreibt die Zucht, Wartung, Dissektion und Probenverarbeitung des einzigen immunkompetenten Mausmodells, GIST, das derzeit verwendet wird. Wir hoffen, dass zukünftige Forscher in der Lage sein werden, dieses Mausmodell zu nutzen, um die translationale Forschung in GIST voranzutreiben. Traditionelle Therapien in GIST beinhalten eine gezielte molekulare Therapie mit Tyrosinkinase-Inhibitoren.Dieses Modell ermöglicht es Forschern, Immuntherapien in GIST zu testen. Sterilisieren Sie zunächst alle Instrumente, tragen Sie während des gesamten Eingriffs Handschuhe und pflegen Sie ein steriles Feld. Bereiten Sie den Bereich des Einschnitts mit 70% Ethanol vor.Machen Sie mit einer Schere einen vertikalen Schnitt in der Mitte von zwei Zentimetern und betreten Sie die Bauchhöhle. Lyse alle intraabdominalen Adhäsionen scharf. Um den drainierenden mesenterialen Lymphknoten zu entfernen, identifizieren Sie den Blinddarm und heben Sie sein Mesenterium überlegen an.Ungefähr in der Mitte der Basis des Dickdarmmesenteriums identifizieren Sie den mesenterialen Lymphknoten und sezieren Sie ihn scharf. Teilen Sie das Lymphknotengewebe bei Bedarf in Drittel für Proteinisolierung, Histologie und Einzelzellsuspension auf. Legen Sie Lymphknotengewebe in 20 Milliliter RPMI-Medium für Einzelzellsuspensionen und halten Sie es auf Eis.Der Blinddarm wird bei den Kit558-Mäusen meist durch einen GIST ersetzt. Zur Isolierung von GIST und Blinddarm trennen Sie vorsichtig die ileokolische Verbindung von der Basis des Tumors. Dann teilen Sie den Blinddarm wieder, zwei Zentimeter distal zur Basis des Tumors.Bei 50 bis 60% der Kit558-Mäuse enthält der Kopf des Tumors eine Kappe aus cecal tissue, die typischerweise seröse Flüssigkeit enthält, aber selten Eiter enthalten kann. Sezieren Sie das Kappengewebe scharf vom Tumorgewebe weg. Teilen Sie das Tumorgewebe und den Blinddarm in Drittel für Proteinisolierung, Histologie und Einzelzellsuspension.Für Einzelzellsuspensionen legen Sie Tumorgewebe oder Blinddarm in HBSS mit 2% FCS, genug, um die Probe zu bedecken, und halten Sie es auf Eis. Gießen Sie RPMI-Medien mit der Lymphknotenprobe über einen 100-Mikrometer-Filter. Bewegen Sie den Filter auf ein neues 50-Milliliter-Konikum und zerdrücken Sie den Lymphknoten mit dem weichen Ende einer Drei-Milliliter-Kunststoffspritze.Waschfilter mit 20 Millilitern RPMI-Medien. Zentrifugieren Sie die Proben und aspirieren Sie den Überstand. Schwebe das Pellet in 20 Milliliter Perlenpuffer und gieße es über einen 40-Mikrometer-Filter.Sammeln Sie das Zellfiltrat. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer. Zentrifugieren Sie die Proben und entsorgen Sie den Überstand.Dann resuspendieren Sie in Perlenpuffer für die Durchflusszytometrie. Bereiten Sie den Kollagenasepuffer wie im Textmanuskript beschrieben vor. Geben Sie GIST in eine sterile Schale und fügen Sie 2,5 Milliliter Kollagenasepuffer hinzu.Zerkleinern Sie den Tumor mit einem sterilen Skalpell und einer Schere, bis er sich in feinen Fragmenten befindet. Verwenden Sie eine großkalibrige Pipette, um den Tumor und die Kollagenase in ein 50-Milliliter-Rohr zu aspirieren. Inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten mit 100 Umdrehungen pro Minute und löschen Sie dann die Reaktion mit zwei Millilitern FBS.Gießen Sie Kollagenase mit GIST-Probe über einen 100-Mikrometer-Filter und zerdrücken Sie den Tumor mit dem weichen Ende einer Drei-Milliliter-Kunststoffspritze und sammeln Sie ihn in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Waschfilter mit 20 Millilitern HBSS. Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 450 RCF fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie dann den Überstand.Schwebe das Pellet in 20 Milliliter Perlenpuffer und gieße es über einen 40-Mikrometer-Filter Sammeln Sie das Filtrat und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Zentrifugieren und aspirieren Sie den Überstand, dann resuspendieren Sie ihn im Perlenpuffer für die Durchflusszytometrie. Spalten Sie den Blinddarm mit einer Schere in Längsrichtung, um die innere Schleimhaut freizulegen.Schneiden Sie es in 0,5-Zentimeter-Abschnitte und legen Sie es in ein 50-Milliliter-Rohr mit fünf Millilitern HBSS und 2% FBS. 30 Sekunden lang kräftig schütteln und 20 Sekunden bei 450 RCF zentrifugieren. Verwerfen Sie dann den Überstand.Fügen Sie fünf bis 20 Milliliter HBSS mit zwei-millimolärem EDTA hinzu. Inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius bei 100 Umdrehungen pro Minute für 15 Minuten. Zentrifugieren und entsorgen Sie den Überstand, dann suspendieren Sie das Pellet in fünf bis 20 Millilitern HBSS.Schütteln Sie die Mischung 30 Sekunden lang kräftig, zentrifugieren Sie dann bei 450 RCF für 20 Sekunden und entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal. Schwebe das Pellet in fünf Milliliter Kollagenasepuffer und inkubiere es dann bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten mit 100 Umdrehungen pro Minute.Schütteln Sie alle 10 Minuten kräftig und löschen Sie die Reaktion mit zwei Millilitern FBS. Gießen Sie Kollagenase mit Blinddarmprobe über einen 100-Mikrometer-Filter und zerdrücken Sie sie mit dem weichen Ende einer Drei-Milliliter-Kunststoffspritze. Waschen Sie den Filter mit 20 Millilitern HBSS und sammeln Sie das Filtrat.Zentrieren und verwerfen Sie den Überstand. Schwebe das Pellet in 20 Milliliter Perlenpuffer und gieße es über einen 40-Mikrometer-Filter. Sammeln Sie Filtrat und zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer.Wiederholen Sie den Zentrifugationsprozess noch einmal und suspendieren Sie das Pellet in einem Perlenpuffer für die Durchflusszytometrie. Die Kit558-Mäuse hatten aufgrund eines fortschreitenden Darmverschlusses eine durchschnittliche Lebensdauer von acht Monaten. Tumore der Kit558-Mäuse exprimierten kanonische Marker von GIST, einschließlich der Tyrosinkinase KIT, des Transmembrankanals Dog1 und des Transkriptionsfaktors ETV1.Tumore wurden auf Veränderungen im KIT-Signalweg untersucht, wie die nachgeschalteten Marker ERK und AKT oder die Immunmikroumgebung, die das menschliche GIST genau nachahmt. MRT oder CT wurde verwendet, um das Tumorvolumen als genaue Messung der Tumorreaktion zu verfolgen. Die Sezierung des Tumors weg von der ileokolischen Verbindung und weg von der Cecal-Kappe ist wichtig, um das wahre Tumorgewicht und die Immun- und Molekularanalyse zu erfassen.Innerhalb von GIST hat dieses Modell die Untersuchung der Tumormikroumgebung sowie Immuntherapien ermöglicht.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Forschung

Krebsforschung

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Die Colon-26-Karzinom Tumor-tragenden Maus als Modell für die Untersuchung von Krebs Kachexie

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Ein Murine Orthotopische Blasentumormodell und Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen in einem orthotopischen Mausmodell des Darmkrebses

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Ein genetisch manipuliertes Mausmodell des sporadischen Darmkrebses

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Tumor Engraftment in einem Xenograft-Maus-Modell der menschlichen Mantel-Zell-Lymphom

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Utilizing High Resolution Ultrasound to Monitor Tumor Onset and Growth in Genetically Engineered Pancreatic Cancer Models

Verwendung von hochauflösendem Ultraschall zu Monitor Tumor auftreten und Wachstum in gentechnisch Bauchspeicheldrüsenkrebs Modelle

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

In Vitro Einrichtung einer gentechnisch veränderten Murine Kopf- und Halskrebszelllinie mit einem Adeno-assoziierten Virus-Cas9-System

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Ein neuartiges Stromal Fibroblast-moduliertes 3D-Tumor-Sphäroid-Modell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Interaktion und der Arzneimittelforschung

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Ein Mausmodell zur Untersuchung der Rolle krebsassoziierter Fibroblasten beim Tumorwachstum

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...