Name: molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor
Uploaded: 2022-05-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor at JoVE.com

עכברי קיטV558Δ/+ הונדסו גנטית ושותפו על ידי ד"ר פיטר בסמר10. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01 CA102613 ו- T32 CA251063.

כל העכברים שוכנו בתנאים נטולי פתוגנים באוניברסיטת פנסילבניה על פי הנחיות NIH ובאישור אוניברסיטת פנסילבניה IACUC. המתת חסד בוצעה בעקבות נהלי ההפעלה הסטנדרטיים של משאבי בעלי חיים במעבדה של אוניברסיטת פנסילבניה.
1. ערכהV558Δ/+ גידול עכברים
<ol><li>?...

<ol>
	<li>Mastrangelo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+soft+tissue+sarcoma+and+beyond:+a+population-based+prospective+study+in+3+European+regions.">Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions.</a> Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).</li><li>Joensuu, H., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+management+of+gastrointestinal+stromal+tumors:+a+model+for+targeted+and+multidisciplinary+therapy+of+malignancy.">The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy.</a> Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).</li><li>Blanke, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+results+from+a+randomized+phase+II+trial+of+standard-+versus+higher-dose+imatinib+mesylate+for+patients+with+unresectable+or+metastatic+gastrointestinal+stromal+tumors+expressing+KIT.">Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).</li><li>Demetri, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+regorafenib+for+advanced+gastrointestinal+stromal+tumours+after+failure+of+imatinib+and+sunitinib+(GRID):+an+international,+multicentre,+randomised,+placebo-controlled,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial.</a> Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).</li><li>Gold, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcome+of+metastatic+GIST+in+the+era+before+tyrosine+kinase+inhibitors.">Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).</li><li>Huynh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib+induces+growth+suppression+in+mouse+models+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).</li><li>Na, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+xenografts+from+patients+with+gastrointestinal+stromal+tumors:+analysis+of+clinicopathological+characteristics+related+to+engraftment+success.">Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).</li><li>Balachandran, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+potentiates+antitumor+T+cell+responses+in+gastrointestinal+stromal+tumor+through+the+inhibition+of+Ido.">Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido.</a> Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).</li><li>Vitiello, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+immune+profiles+distinguish+the+mutational+subtypes+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).</li><li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase.">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).</li><li>Cavnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIT+oncogene+inhibition+drives+intratumoral+macrophage+M2+polarization.">KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).</li><li>Medina, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+kinase+inhibition+limits+Batf3-dependent+dendritic+cell+development+and+antitumor+immunity.">Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).</li><li>Zhang, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+CD8(+)+T+cells+mediate+the+antitumor+efficacy+of+combined+CD40+ligation+and+imatinib+therapy+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).</li><li>. General Protocol for Western Blotting Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf</a> (2022)</li><li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+formalin-fixed,+paraffin+embedded+blocks.">Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 253-268 (2019).</li><li>Sy, J., Ang, L. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtomy:+Cutting+formalin-fixed,+paraffin-embedded+sections.">Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 269-278 (2019).</li><li>Seifert, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1/PD-L1+blockade+enhances+T-cell+activity+and+antitumor+efficacy+of+imatinib+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors.</a> Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+KIT+modulates+Type+I+IFN-mediated+antitumor+immunity+in+GIST.">Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST.</a> Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).</li><li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Kit+signaling+and+therapeutic+intervention+in+a+mouse+model+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).</li></ol>

מודל העכבר Kit V558Δ/+ הוא כלי מחקר רב עוצמה בניתוח מולקולרי ואימונולוגי של GIST. למרות שאסטרטגיית הרבייה דורשת צלב יחיד, שימוש בקבוצת עכברים Kit V558Δ/+ בניסויים המנתחים את תגובת הגידול דורש רבייה נרחבת. עכברים צריכים להיות מותאמי גיל ומין כדי להבטיח משקל גידול דומה, ו -10% מהעכב...

GIST היא הסרקומה הנפוצה ביותר בבני אדם עם שכיחות של כ -6,000 מקרים בארצות הברית של אמריקה1. נראה כי מקורו של GIST בתאי קוצב הלב במערכת העיכול הנקראים תאי הביניים של קאג'אל, והוא מונע בדרך כלל על ידי מוטציה בודדת בטירוזין קינאז KIT או PDGFRA2. ניתוח הוא עמוד התווך של הטיפול ב- GIST ויכול להיות מרפא, אך חולים עם מחלה מתקדמת עשויים להיות מטופלים עם מעכב טירוזין קינאז (TKI), imatinib. מאז הצגתו לפני למעלה מ-20 שנה, אימטיניב שינתה את פרדיגמת הטיפול ב-GIST, ושיפרה את ההישרדות במחלות מתקדמות מ-1 ליותר מ-5 שנים 3,4,5. למרבה הצער, imatinib הוא רק לעתים רחוקות מרפא בשל מוטציות KIT נרכש, ולכן יש צורך בטיפולים חדשים עבור גידול זה.
מודלים של עכברים הם כלי מחקרי חשוב בחקר טיפולים חדשניים בסרטן. מספר מודלים תת עוריים של קסנוגרפט וקסנוגרפט שמקורם בחולה פותחו ונחקרו ב-GIST 6,7. עם זאת, עכברים אימונו-יעילים אינם מייצגים באופן מלא את ה-GIST האנושי מכיוון ש-GISTs הם בעלי פרופיל חיסוני דיפרנציאלי בהתאם למוטציה האונקוגנית שלהם, ושינוי המיקרו-סביבה של הגידול במערכת העיכול משפר את ההשפעות של טיפול TKI 8,9. לעכבר KitV558Δ/+ יש מחיקה של חיידק הטרוזיגוטי ב-Kit exon 11, המקודדת את תחום ה-juxtamembrane, האתר בעל המוטציה הנפוצה ביותר ב-GIST10 האנושי. עכברי KitV558Δ/+ מפתחים GIST סקאל יחיד עם 100% חדירה, ולגידולים יש היסטולוגיה דומה, איתות מולקולרי, חדירה חיסונית ותגובה לטיפול כמו GIST 8,11,12,13 אנושי. כאן, אנו מתארים רבייה, טיפול ובידוד ועיבוד דגימות בעכברי KitV558Δ/+ לשימוש במחקר מולקולרי ואימונולוגי ב- GIST.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x RBC lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mL syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody (C67E7)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini edta free protease inhibitor</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C852A34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Exel International</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C756V81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dog1 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab64085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C788U23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 850 Homogenizer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imatinib mesylate</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT antibody (D13A2)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KitV558&#916;/+ Genotyping</td>
			<td>Transnetyx</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1620145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9121673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody (S473)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-KIT antibody (Y719)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proeinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP170050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes</td>
			<td>Falcon/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS buffer (10x)</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (100mm2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Falcon</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisHCL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1757500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;vivaCT 80 platform</td>
			<td>Scanco medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor

גידול סטרומלי במערכת העיכול (GIST) הוא הסרקומה האנושית הנפוצה ביותר והוא מונע בדרך כלל על ידי מוטציה אחת בקולטן KIT. על פני סוגי גידולים, פותחו מודלים רבים של עכברים על מנת לחקור את הדור הבא של הטיפולים בסרטן. עם זאת, ב- GIST, רוב מחקרי in vivo משתמשים במודלים של עכברי קסנוגרפט שיש להם מגבלות מובנות. כאן, אנו מתארים מודל עכברי בעל יכולת חיסונית, מהונדס גנטית, של גידול סטרומלי במערכת העיכול עם מוטציה של KitV558Δ/+ . במודל זה, KIT המוטנטי, האונקוגן האחראי על רוב ה-GISTs, מונע על ידי המקדם האנדוגני שלו המוביל ל-GIST המחקה את המראה ההיסטולוגי ואת החדירה החיסונית שנראית ב-GISTs אנושיים. יתר על כן, מודל זה שימש בהצלחה כדי לחקור הן טיפולים מולקולריים ממוקדים והן טיפולים חיסוניים. כאן, אנו מתארים את הרבייה והתחזוקה של מושבת עכברים Kit V558Δ/+ . בנוסף, מאמר זה מפרט את הטיפול והרכש של GIST, ניקוז בלוטות לימפה מזנטרית, וצקום צמוד בעכברי KitV558Δ/+ , כמו גם הכנה לדוגמה לניתוחים מולקולריים ואימונולוגיים.

מודל העכבר Kit V558Δ/+ מאפשר לחקור טיפולים במודל עכברים אימונו-תחרותי. לערכהV558Δ/+ לעכברים יש תוחלת חיים ממוצעת של 8 חודשים עקב חסימת מעיים מתקדמת (איור 4). גידולים מ-KitV558Δ/+ עכברים מבטאים סמנים קנוניים של GIST כולל הטירוזין קינאז KIT ...

Watch this Scientific Journal Video about Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor at JoVE.com

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

מטרת כתב יד זה היא לתאר את מודל העכבר Kit V558Δ/+ ואת הטכניקות לניתוח ועיבוד מוצלחים של דגימות עכברים.

טכניקות מולקולריות ואימונולוגיות במודל עכבר מהונדס גנטית של גידול סטרומלי במערכת העיכול

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

הפרוטוקול שלנו מתאר את הרבייה, התחזוקה, הניתוח ועיבוד הדגימה של מודל העכברים החיסוני היחיד, GIST, הנמצא כיום בשימוש. אנו מקווים שחוקרים עתידיים יוכלו להשתמש במודל העכברים הזה כדי להמשיך את המחקר התרגומי ב-GIST. טיפולים מסורתיים ב- GIST כוללים טיפול מולקולרי ממוקד עם מעכבי טירוזין קינאז.מודל זה מאפשר לחוקרים לבחון אימונותרפיות ב-GIST. כדי להתחיל, לעקר את כל המכשירים, ללבוש כפפות לאורך כל ההליך, ולשמור על שדה סטרילי. הכן את אזור החתך עם 70% אתנול.באמצעות מספריים, לעשות חתך אנכי בקו האמצע של שני סנטימטרים ולהיכנס לחלל הבטן. בחדות למדוד כל הידבקויות תוך-בטניות. כדי להסיר את בלוטת הלימפה המזנטרית המתנקזת, זהה את הצקום והרם את המזנטריה שלו בצורה מעולה.בערך באמצע הדרך לבסיס המזנטריה המעי הגסית, זהה את בלוטת הלימפה המזנטרית ונתח אותה בחדות. לפי הצורך, חלקו את רקמת בלוטות הלימפה לשלישים לבידוד חלבונים, היסטולוגיה ותרחיף של תאים בודדים. מניחים רקמת בלוטות לימפה ב-20 מיליליטרים של מדיום RPMI לתרחיפים חד-תאיים ושומרים על קרח.הצקום מוחלף ברובו על ידי GIST בעכברי Kit558. לבידוד של GIST ו cecum, בזהירות לחלק את הצומת האילאוקולי מבסיס הגידול. לאחר מכן, מחלקים שוב את הצקום, שני סנטימטרים דיסטליים לבסיס הגידול.ב-50% עד 60% מהעכברים Kit558, ראש הגידול מכיל מכסה של רקמת צ'ק, שבדרך כלל מכילה נוזל סרוסי, אך לעיתים רחוקות עשויה להכיל מוגלה. לנתח בחדות את רקמת הכובע הרחק מרקמת הגידול. מחלקים את רקמת הגידול ואת ה-cecum לשלישים לצורך בידוד חלבונים, היסטולוגיה ותרחיף של תאים בודדים.עבור תרחיפים חד-תאיים, הניחו רקמת גידול או cecum ב-HBSS עם 2%FCS, מספיק כדי לכסות את הדגימה, ולשמור על קרח. יש לשפוך מדיית RPMI עם דגימת בלוטות הלימפה על גבי מסנן של 100 מיקרומטר. העבירו את המסנן לחרוט חדש של 50 מיליליטר, ומעכו את בלוטת הלימפה עם הקצה הרך של מזרק פלסטיק בעל שלושה מיליליטר.לשטוף מסנן עם 20 מיליליטרים של מדיית RPMI. צנטריפוגה את הדגימות ושואפים את הסופרנטנט. שופכים מחדש את הכדור ב-20 מיליליטרים של מאגר חרוזים ושופכים על מסנן של 40 מיקרומטר.לאסוף את תפיח התא. לספור תאים באמצעות המוציטומטר. צנטריפוגה את הדגימות והשליכה את הסופרנאטנט.לאחר מכן, resuspend במאגר חרוזים עבור ציטומטריה זרימה. הכינו את מאגר הקולג'אנאז כמתואר בכתב היד של הטקסט. מניחים את ה-GIST בצלחת סטרילית ומוסיפים 2.5 מיליליטר של מאגר קולגןאז.באמצעות אזמל סטרילי ומספריים, לטחון את הגידול עד שהוא בשברים עדינים. השתמשו בפיפטה בעלת בור גדול כדי לשאוף את הגידול ואת הקולגן לתוך צינור של 50 מיליליטר. דגירו אותו ב-37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ב-100 סיבובים לדקה, ואז מרווים את התגובה עם שני מיליליטרים של FBS.יוצקים קולגןאז עם דגימת GIST על גבי מסנן של 100 מיקרומטר ומעכים את הגידול עם הקצה הרך של מזרק פלסטיק של שלושה מיליליטר ומלקטים בצינור 50 מיליליטר. לשטוף מסנן עם 20 מיליליטרים של HBSS. צנטריפוגה של התסיס ב-450 RCF למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, ואז השליכו את הסופרנאטנט.בצעו שימוש חוזר בכדור ב-20 מיליליטרים של מאגר חרוזים ושפכו מעל מסנן של 40 מיקרומטר אספו את התסיסים וספרו תאים באמצעות המוציטומטר. צנטריפוגה ושואפים לסופרנאטנט, ואז משחזרים את החיץ בחיץ חרוזים לציטומטריית זרימה. באמצעות מספריים, לפצל את cecum אורכית כדי לחשוף את הרירית הפנימית.חותכים אותו למקטעים של 0.5 ס"מ ומניחים אותו בצינור של 50 מיליליטר עם חמישה מיליליטרים של HBSS ו-2% FBS. יש לנער במרץ במשך 30 שניות ולצנטריפוגה ב-450 RCF למשך 20 שניות. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט.הוסף חמישה עד 20 מיליליטרים של HBSS עם EDTA דו-מילימולרי. דגירו אותו ב-37 מעלות צלזיוס ב-100 סיבובים לדקה במשך 15 דקות. צנטריפוגה והשלכת הסופרנאטנט, ואז החייאת הכדור בחמישה עד 20 מיליליטרים של HBSS.יש לנער את התערובת במרץ למשך 30 שניות, ולאחר מכן לבצע צנטריפוגה ב-450 RCF למשך 20 שניות ולהשליך את הסופרנטנט. חזור על תהליך זה פעם נוספת. משחזרים את הכדור בחמישה מיליליטרים של מאגר קולגןאז, ואז דוגרים אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב-100 סיבובים לדקה.לנער במרץ כל 10 דקות ולהרווה את התגובה עם שני מיליליטרים של FBS. יוצקים קולגן עם דגימת cecum על גבי מסנן של 100 מיקרומטר ומחית עם הקצה הרך של מזרק פלסטיק של שלושה מיליליטר. לשטוף את המסנן עם 20 מיליליטרים של HBSS ולאסוף את התסיס.צנטריפוגה ולהשליך את הסופרנאטנט. שופכים מחדש את הכדור ב-20 מיליליטרים של מאגר חרוזים ושופכים על מסנן של 40 מיקרומטר. לאסוף תסיסים ולספור תאים באמצעות המוציטומטר.חזור על תהליך הצנטריפוגה פעם נוספת והחייא את הכדור במאגר חרוזים לציטומטריית זרימה. לעכברי Kit558 הייתה תוחלת חיים ממוצעת של שמונה חודשים עקב חסימת מעיים מתקדמת. גידולים מעכברי Kit558 ביטאו סמנים קנוניים של GIST, כולל ה-KIT של טירוזין קינאז, ערוץ הטרנס-ממברנה Dog1 וגורם השעתוק ETV1.גידולים נחקרו עבור שינויים במסלול האיתות KIT כגון הסמנים במורד הזרם ERK ו- AKT או מיקרו-סביבה חיסונית, אשר חיקו באופן הדוק את ה- GIST האנושי. MRI או CT שימשו למעקב אחר נפח הגידול כמדידה מדויקת של תגובת הגידול. ניתוח הגידול הרחק מהצומת האילאוקולי והרחק מהכובע הצחי חשוב כדי ללכוד את משקל הגידול האמיתי ואת הניתוח החיסוני והמולקולרי.בתוך GIST, מודל זה איפשר לחקור את המיקרו-סביבה של הגידול, כמו גם אימונותרפיות.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

קולון-26 קרצינומה גידול נושאות עכבר כמודל לחקר סרטן תשישות

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

מודל גידול Murine Orthotopic שלפוחית ​​השתן סרטן מערכת איתור

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

בידוד של תאים סרטניים במחזור מודל עכבר אורתופטי של סרטן המעי הגס

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

דגם עכבר מהונדס גנטית של סרטן המעי הגס ספוראדי

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Engraftment גידול במודל של עכברים Xenograft של האדם מנטל לימפומה התא

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Utilizing High Resolution Ultrasound to Monitor Tumor Onset and Growth in Genetically Engineered Pancreatic Cancer Models

ניצול אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה על צג תחילת גידול וצמיחה מודלים מהונדס גנטית לסרטן הלבלב

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

בשנת הקמת מבחנה של הראש מהונדסים גנטית מורה וצוואר הסרטן קו תא באמצעות Adeno משויך וירוס-Cas9 מערכת

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

סטרומה הרומן פיברוהפיצוץ-מודנן 3D הגידול מודל ספרואיד ללמוד אינטראקציה סרטניים-סטרומה וגילוי הסמים

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

מודל עכברי לחקר התפקיד של פיברובלסטים הקשורים לסרטן בצמיחת הגידול

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...