Name: molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor
Uploaded: 2022-05-02T15:00:00
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किट V558Δ/+ चूहों को आनुवंशिक रूप से इंजीनियर किया गया था और डॉ पीटर बेसमर10 द्वारा साझा किया गया था। इस काम को एनआईएच अनुदान आर 01 सीए 102613 और टी 32 सीए 251063 द्वारा समर्थित किया गया था।

सभी चूहों को एनआईएच दिशानिर्देशों के अनुसार और पेंसिल्वेनिया आईएसीयूसी विश्वविद्यालय के अनुमोदन के साथ पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय में रोगज़नक़ मुक्त परिस्थितियों में रखा गया था। पेंसिल्वेनिया...

<ol>
	<li>Mastrangelo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+soft+tissue+sarcoma+and+beyond:+a+population-based+prospective+study+in+3+European+regions.">Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions.</a> Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).</li><li>Joensuu, H., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+management+of+gastrointestinal+stromal+tumors:+a+model+for+targeted+and+multidisciplinary+therapy+of+malignancy.">The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy.</a> Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).</li><li>Blanke, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+results+from+a+randomized+phase+II+trial+of+standard-+versus+higher-dose+imatinib+mesylate+for+patients+with+unresectable+or+metastatic+gastrointestinal+stromal+tumors+expressing+KIT.">Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).</li><li>Demetri, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+regorafenib+for+advanced+gastrointestinal+stromal+tumours+after+failure+of+imatinib+and+sunitinib+(GRID):+an+international,+multicentre,+randomised,+placebo-controlled,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial.</a> Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).</li><li>Gold, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcome+of+metastatic+GIST+in+the+era+before+tyrosine+kinase+inhibitors.">Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).</li><li>Huynh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib+induces+growth+suppression+in+mouse+models+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).</li><li>Na, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+xenografts+from+patients+with+gastrointestinal+stromal+tumors:+analysis+of+clinicopathological+characteristics+related+to+engraftment+success.">Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).</li><li>Balachandran, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+potentiates+antitumor+T+cell+responses+in+gastrointestinal+stromal+tumor+through+the+inhibition+of+Ido.">Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido.</a> Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).</li><li>Vitiello, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+immune+profiles+distinguish+the+mutational+subtypes+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).</li><li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase.">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).</li><li>Cavnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIT+oncogene+inhibition+drives+intratumoral+macrophage+M2+polarization.">KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).</li><li>Medina, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+kinase+inhibition+limits+Batf3-dependent+dendritic+cell+development+and+antitumor+immunity.">Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).</li><li>Zhang, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+CD8(+)+T+cells+mediate+the+antitumor+efficacy+of+combined+CD40+ligation+and+imatinib+therapy+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).</li><li>. General Protocol for Western Blotting Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf</a> (2022)</li><li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+formalin-fixed,+paraffin+embedded+blocks.">Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 253-268 (2019).</li><li>Sy, J., Ang, L. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtomy:+Cutting+formalin-fixed,+paraffin-embedded+sections.">Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 269-278 (2019).</li><li>Seifert, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1/PD-L1+blockade+enhances+T-cell+activity+and+antitumor+efficacy+of+imatinib+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors.</a> Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+KIT+modulates+Type+I+IFN-mediated+antitumor+immunity+in+GIST.">Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST.</a> Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).</li><li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Kit+signaling+and+therapeutic+intervention+in+a+mouse+model+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).</li></ol>

किट V558Δ/+ माउस मॉडल जीआईएसटी के आणविक और प्रतिरक्षाविज्ञानी विश्लेषण में एक शक्तिशाली अनुसंधान उपकरण है। यद्यपि प्रजनन रणनीति को एक एकल क्रॉस की आवश्यकता होती है, ट्यूमर प्रतिक्रिया का विश्ले?...

जीआईएसटी संयुक्त राज्य अमेरिका में लगभग 6,000 मामलों की घटनाओं के साथ मनुष्यों में सबसे आम सारकोमाहै 1. जीआईएसटी गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल पेसमेकर कोशिकाओं से उत्पन्न होता है जिसे काजल की अंतरालीय कोशिकाओं का नाम दिया जाता है, और आमतौर पर टायरोसिन किनेज किट या पीडीजीएफआरए 2 में एक एकल उत्परिवर्तन द्वारा संचालितहोता है। सर्जरी जीआईएसटी के लिए उपचार का मुख्य आधार है और उपचारात्मक हो सकती है, लेकिन उन्नत बीमारी वाले रोगियों का इलाज टायरोसिन किनेज इनहिबिटर (टीकेआई), इमाटिनिब के साथ किया जा सकता है। 20 साल पहले इसकी शुरुआत के बाद से, इमातिनिब ने जीआईएसटी में उपचार प्रतिमान को बदल दिया है, उन्नत बीमारी में जीवित रहने में सुधार 1 से 5 साल 3,4,5 तक। दुर्भाग्य से, अधिग्रहित किट उत्परिवर्तन के कारण इमैटिनिब शायद ही कभी उपचारात्मक होता है, इसलिए इस ट्यूमर के लिए नए उपचार की आवश्यकता होती है।
माउस मॉडल कैंसर में उपन्यास चिकित्सा की जांच में एक महत्वपूर्ण अनुसंधान उपकरण हैं। जीआईएसटी 6,7 में कई चमड़े के नीचे के ज़ेनोग्राफ्ट और रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट मॉडल विकसित और जांच की गई है। हालांकि, इम्यूनोडेफिशिएंट चूहे पूरी तरह से मानव जीआईएसटी का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं क्योंकि जीआईएसटी अपने ऑन्कोजेनिक उत्परिवर्तन के आधार पर अंतर प्रतिरक्षा प्रोफाइल को बंद करते हैं, और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को बदलने से टीकेआई थेरेपी 8,9 के प्रभावमें सुधार होता है। + माउस में किट एक्सॉन 11 में एक विषमयुग्मजी जर्मलाइन विलोपन है, जो मानव जीआईएसटी10 में सबसे अधिक उत्परिवर्तित साइट जक्सटामेम्ब्रेन डोमेन को एन्कोड करता है। + चूहों में 100% प्रवेश के साथ एक एकल सीकल जीआईएसटी विकसित होता है, और ट्यूमर में मानव जीआईएसटी 8,11,12,13 के समान ऊतक विज्ञान, आणविक सिग्नलिंग, प्रतिरक्षा घुसपैठ और चिकित्सा की प्रतिक्रिया होती है। यहां, हम जीआईएसटी में आणविक और इम्यूनोलॉजिकल अनुसंधान में उपयोग के लिए किटवी 558Δ/+ चूहों में प्रजनन, उपचार और नमूना अलगाव और प्रसंस्करण का वर्णन करते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x RBC lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mL syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody (C67E7)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini edta free protease inhibitor</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C852A34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Exel International</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C756V81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dog1 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab64085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C788U23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 850 Homogenizer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imatinib mesylate</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT antibody (D13A2)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KitV558&#916;/+ Genotyping</td>
			<td>Transnetyx</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1620145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9121673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody (S473)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-KIT antibody (Y719)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proeinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP170050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes</td>
			<td>Falcon/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS buffer (10x)</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (100mm2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Falcon</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisHCL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1757500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;vivaCT 80 platform</td>
			<td>Scanco medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor

गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्ट्रोमल ट्यूमर (जीआईएसटी) सबसे आम मानव सारकोमा है और आमतौर पर केआईटी रिसेप्टर में एक एकल उत्परिवर्तन द्वारा संचालित होता है। ट्यूमर प्रकारों में, कैंसर उपचार की अगली पीढ़ी की जांच करने के लिए कई माउस मॉडल विकसित किए गए हैं। हालांकि, जीआईएसटी में, विवो अध्ययनों में अधिकांश ज़ेनोग्राफ्ट माउस मॉडल का उपयोग करते हैं जिनकी अंतर्निहित सीमाएं हैं। यहां, हम गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्ट्रोमल ट्यूमर के एक प्रतिरक्षात्मक, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल का वर्णन करते हैं जो किटवी 558Δ / + उत्परिवर्तन को आश्रय देता है। इस मॉडल में, उत्परिवर्ती केआईटी, अधिकांश जीआईएसटी के लिए जिम्मेदार ऑन्कोजीन, इसके अंतर्जात प्रमोटर द्वारा संचालित होता है जो जीआईएसटी में देखी गई हिस्टोलॉजिकल उपस्थिति और प्रतिरक्षा घुसपैठ की नकल करता है। इसके अलावा, इस मॉडल का उपयोग लक्षित आणविक और प्रतिरक्षा उपचार दोनों की जांच के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। यहां, हम एक किटV558Δ/+ माउस कॉलोनी के प्रजनन और रखरखाव का वर्णन करते हैं। इसके अतिरिक्त, यह पेपर जीआईएसटी के उपचार और खरीद का विवरण देता है, मेसेंटेरिक लिम्फ नोड को सूखा देता है, और किटवी 558Δ/+ चूहों में आसन्न सीकम, साथ ही आणविक और इम्यूनोलॉजिकल विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी करता है।

किट V558Δ/+ माउस मॉडल एक प्रतिरक्षा सक्षम माउस मॉडल में चिकित्सीय की जांच के लिए अनुमति देता है। + चूहों प्रगतिशील आंत्र रुकावट (चित्रा 4) के कारण 8 महीने का औसत जीवनकाल है</...

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Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

इस पांडुलिपि का लक्ष्य किटV558Δ/+ माउस मॉडल और माउस नमूनों के सफल विच्छेदन और प्रसंस्करण के लिए तकनीकों का वर्णन करना है।

गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्ट्रोमल ट्यूमर के आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल में आणविक और इम्यूनोलॉजिकल तकनीकें

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

हमारा प्रोटोकॉल वर्तमान में उपयोग में आने वाले एकमात्र प्रतिरक्षात्मक माउस मॉडल, जीआईएसटी के प्रजनन, रखरखाव, विच्छेदन और नमूना प्रसंस्करण का वर्णन करता है। हमें उम्मीद है कि भविष्य के शोधकर्ता जीआईएसटी में आगे के अनुवादसंबंधी अनुसंधान के लिए इस माउस मॉडल का उपयोग करने में सक्षम होंगे। जीआईएसटी में पारंपरिक उपचारों में टायरोसिन किनेज अवरोधकों के साथ लक्षित आणविक चिकित्सा शामिल है।यह मॉडल शोधकर्ताओं को जीआईएसटी में इम्यूनोथेरेपी का परीक्षण करने में सक्षम बनाता है। शुरू करने के लिए, सभी उपकरणों को निष्फल करें, पूरी प्रक्रिया में दस्ताने पहनें, और एक बाँझ क्षेत्र बनाए रखें। 70% इथेनॉल के साथ चीरा के क्षेत्र को तैयार करें।कैंची का उपयोग करके, दो सेंटीमीटर मिडलाइन ऊर्ध्वाधर चीरा बनाएं और पेट की गुहा में प्रवेश करें। किसी भी इंट्रा-पेट आसंजन को तेजी से लाइज करें। ड्रेनिंग मेसेंटेरिक लिम्फ नोड को हटाने के लिए, सीकुम की पहचान करें और इसकी मेसेंटरी को बेहतर ढंग से उठाएं।कॉलोनिक मेसेंटरी के आधार के लगभग बीच में, मेसेंटेरिक लिम्फ नोड की पहचान करें और इसे तेजी से विच्छेदित करें। आवश्यकतानुसार, प्रोटीन अलगाव, ऊतक विज्ञान और एकल कोशिका निलंबन के लिए लिम्फ नोड ऊतक को तिहाई में विभाजित करें। एकल-कोशिका निलंबन के लिए आरपीएमआई माध्यम के 20 मिलीलीटर में लिम्फ नोड ऊतक रखें और बर्फ पर रखें।सीकम को ज्यादातर किट 558 चूहों में जीआईएसटी द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। जीआईएसटी और सीकम के अलगाव के लिए, ट्यूमर के आधार से इलियोकोलिक जंक्शन को सावधानीपूर्वक विभाजित करें। फिर, सीकुम को फिर से विभाजित करें, ट्यूमर के आधार पर दो सेंटीमीटर डिस्टल।किट 558 चूहों के 50 से 60% में, ट्यूमर के सिर में सीकल ऊतक की एक टोपी होती है, जिसमें आमतौर पर सीरस तरल पदार्थ होता है, लेकिन शायद ही कभी मवाद हो सकता है। तेजी से ट्यूमर ऊतक से दूर टोपी ऊतक विच्छेदन। प्रोटीन अलगाव, ऊतक विज्ञान और एकल-कोशिका निलंबन के लिए ट्यूमर ऊतक और सीकम को तिहाई में विभाजित करें।एकल-कोशिका निलंबन के लिए, एचबीएसएस में ट्यूमर ऊतक या सीकम को 2% एफसीएस के साथ रखें, नमूने को कवर करने के लिए पर्याप्त है, और बर्फ पर रखें। 100-माइक्रोमीटर फिल्टर पर लिम्फ नोड नमूने के साथ आरपीएमआई मीडिया डालो। फिल्टर को एक नए 50-मिलीलीटर शंक्वाकार में ले जाएं, और तीन मिलीलीटर प्लास्टिक सिरिंज के नरम छोर के साथ लिम्फ नोड को मैश करें।आरपीएमआई मीडिया के 20 मिलीलीटर के साथ फिल्टर धो लें। नमूने अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला आकांक्षा। मनका बफर के 20 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें और 40-माइक्रोमीटर फिल्टर पर डालें।सेल छानना ले लीजिए। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। नमूनों अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।फिर, प्रवाह साइटोमेट्री के लिए मनका बफर में फिर से निलंबित कर दिया। पाठ पांडुलिपि में वर्णित के रूप में कोलेजनेज बफर तैयार करें। एक बाँझ पकवान में जीआईएसटी रखें और कोलेजनेज बफर के 2.5 मिलीलीटर जोड़ें।एक बाँझ स्केलपेल और कैंची का उपयोग करके, ट्यूमर को तब तक कीमा बनाएं जब तक कि यह ठीक टुकड़ों में न हो। ट्यूमर और कोलेजनेज को 50 मिलीलीटर ट्यूब में एस्पिरेट करने के लिए एक बड़े बोर पिपेट का उपयोग करें। इसे 100 घूर्णन प्रति मिनट पर 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, फिर एफबीएस के दो मिलीलीटर के साथ प्रतिक्रिया को बुझाएं।100-माइक्रोमीटर फिल्टर पर जीआईएसटी नमूने के साथ कोलेजनेज डालें और ट्यूमर को तीन-मिलीलीटर प्लास्टिक सिरिंज के नरम छोर के साथ मैश करें और 50-मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा करें। एचबीएसएस के 20 मिलीलीटर के साथ फिल्टर धो लें। चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 450 आरसीएफ पर छानना अपकेंद्रित्र करें, फिर सतह पर तैरनेवाला त्याग दें।मनका बफर के 20 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें और 40-माइक्रोमीटर फिल्टर पर डालें छानना इकट्ठा करें और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गिनती करें। अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा, फिर प्रवाह साइटोमेट्री के लिए मनका बफर में फिर से निलंबित। कैंची का उपयोग करके, आंतरिक श्लेष्म को उजागर करने के लिए सीकम को अनुदैर्ध्य रूप से विभाजित करें।इसे 0.5-सेंटीमीटर वर्गों में काटें और इसे एचबीएसएस के पांच मिलीलीटर और 2% एफबीएस के साथ 50 मिलीलीटर ट्यूब में रखें। 30 सेकंड के लिए सख्ती से हिलाएं और 20 सेकंड के लिए 450 आरसीएफ पर अपकेंद्रित्र करें। फिर, सतह पर तैरनेवाला त्यागें।दो मिलीमोलर ईडीटीए के साथ एचबीएसएस के पांच से 20 मिलीलीटर जोड़ें। इसे 15 मिनट के लिए 100 रोटेशन प्रति मिनट पर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें, फिर एचबीएसएस के पांच से 20 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।मिश्रण को 30 सेकंड के लिए सख्ती से हिलाएं, फिर 20 सेकंड के लिए 450 आरसीएफ पर अपकेंद्रित्र करें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। इस प्रक्रिया को एक बार फिर दोहराएं। कोलेजनेज बफर के पांच मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें, फिर इसे 100 घूर्णन प्रति मिनट पर 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।हर 10 मिनट में सख्ती से हिलाएं और एफबीएस के दो मिलीलीटर के साथ प्रतिक्रिया को बुझाएं। 100-माइक्रोमीटर फिल्टर पर सीकम नमूने के साथ कोलेजनेज डालें और तीन-मिलीलीटर प्लास्टिक सिरिंज के नरम छोर के साथ मैश करें। एचबीएसएस के 20 मिलीलीटर के साथ फिल्टर धो लें और छानना इकट्ठा करें।अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। मनका बफर के 20 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें और 40-माइक्रोमीटर फिल्टर पर डालें। एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके छानना और गिनती कोशिकाओं को इकट्ठा करें।सेंट्रीफ्यूजेशन प्रक्रिया को एक बार फिर दोहराएं और प्रवाह साइटोमेट्री के लिए मनका बफर में गोली को फिर से निलंबित करें। प्रगतिशील आंत्र रुकावट के कारण किट 558 चूहों का औसत जीवनकाल आठ महीने था। किट 558 चूहों के ट्यूमर ने जीआईएसटी के विहित मार्करों को व्यक्त किया, जिसमें टायरोसिन किनेज किट, ट्रांसमेम्ब्रेन चैनल डॉग 1 और प्रतिलेखन कारक ईटीवी 1 शामिल हैं।डाउनस्ट्रीम मार्कर ईआरके और एकेटी या प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट जैसे केआईटी सिग्नलिंग मार्ग में परिवर्तन के लिए ट्यूमर का अध्ययन किया गया था, जो मानव जीआईएसटी की बारीकी से नकल करता था। एमआरआई या सीटी का उपयोग ट्यूमर प्रतिक्रिया के सटीक माप के रूप में ट्यूमर की मात्रा को ट्रैक करने के लिए किया गया था। ट्यूमर को इलियोकोलिक जंक्शन से दूर और सीकल कैप से दूर विच्छेदन करना सच्चे ट्यूमर वजन और प्रतिरक्षा और आणविक विश्लेषण को पकड़ने के लिए महत्वपूर्ण है।जीआईएसटी के भीतर, इस मॉडल ने ट्यूमर माइक्रोएनवायरनमेंट, साथ ही इम्यूनोथेरेपी की जांच की अनुमति दी है।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; Imaginal डिस्क ट्यूमर आदर्श: दृश्य और जीन अभिव्यक्ति और ट्यूमर invasiveness की मात्रा जेनेटिक मोज़ाइक का प्रयोग

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

आंतों-26 कार्सिनोमा ट्यूमर असर कर्क कैचेक्सिया के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में माउस

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

एक murine Orthotopic मूत्राशय ट्यूमर मॉडल और ट्यूमर का पता लगाने प्रणाली

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

कोलोरेक्टल कैंसर के ऑर्थोटोपिक माउस मॉडल में ट्यूमर कोशिकाओं को प्रसारित करने का अलगाव

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

स्पोराडिक कोलोरेक्टल कैंसर का आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

ह्यूमन मेंटल सेल लिंफोमा के एक Xenograft माउस मॉडल में ट्यूमर Engraftment

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Utilizing High Resolution Ultrasound to Monitor Tumor Onset and Growth in Genetically Engineered Pancreatic Cancer Models

आनुवंशिक रूप से इंजीनियर अग्नाशय के कैंसर के मॉडल में ट्यूमर की शुरुआत और विकास की निगरानी करने के लिए उच्च संकल्प अल्ट्रासाउंड का उपयोग

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

एक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर Murine सिर और गर्दन कैंसर सेल लाइन के विट्रो स्थापना में एक Adeno-एसोसिएटेड वायरस-Cas9 प्रणाली का उपयोग कर

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

ट्यूमर-स्ट्रोमा इंटरैक्शन और ड्रग डिस्कवरी का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट-मोडलेटेड 3डी ट्यूमर स्फेरॉइड मॉडल

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

ट्यूमर के विकास में कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट की भूमिका की जांच करने के लिए एक माउस मॉडल

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...