Name: molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor
Uploaded: 2022-05-02T15:00:00
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I topi KitV558Δ/+ sono stati geneticamente modificati e condivisi dal Dr. Peter Besmer10. Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01 CA102613 e T32 CA251063.

Tutti i topi sono stati ospitati in condizioni prive di agenti patogeni presso l'Università della Pennsylvania secondo le linee guida NIH e con l'approvazione dell'Università della Pennsylvania IACUC. L'eutanasia è stata eseguita seguendo le procedure operative standard dell'Università della Pennsylvania Laboratory Animal Resources.
1. KitV558Δ/+ allevamento di topi
<ol><li>Incrocia i mouse KitV558Δ/+...

<ol>
	<li>Mastrangelo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+soft+tissue+sarcoma+and+beyond:+a+population-based+prospective+study+in+3+European+regions.">Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions.</a> Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).</li><li>Joensuu, H., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+management+of+gastrointestinal+stromal+tumors:+a+model+for+targeted+and+multidisciplinary+therapy+of+malignancy.">The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy.</a> Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).</li><li>Blanke, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+results+from+a+randomized+phase+II+trial+of+standard-+versus+higher-dose+imatinib+mesylate+for+patients+with+unresectable+or+metastatic+gastrointestinal+stromal+tumors+expressing+KIT.">Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).</li><li>Demetri, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+regorafenib+for+advanced+gastrointestinal+stromal+tumours+after+failure+of+imatinib+and+sunitinib+(GRID):+an+international,+multicentre,+randomised,+placebo-controlled,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial.</a> Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).</li><li>Gold, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcome+of+metastatic+GIST+in+the+era+before+tyrosine+kinase+inhibitors.">Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).</li><li>Huynh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib+induces+growth+suppression+in+mouse+models+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).</li><li>Na, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+xenografts+from+patients+with+gastrointestinal+stromal+tumors:+analysis+of+clinicopathological+characteristics+related+to+engraftment+success.">Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).</li><li>Balachandran, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+potentiates+antitumor+T+cell+responses+in+gastrointestinal+stromal+tumor+through+the+inhibition+of+Ido.">Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido.</a> Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).</li><li>Vitiello, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+immune+profiles+distinguish+the+mutational+subtypes+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).</li><li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase.">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).</li><li>Cavnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIT+oncogene+inhibition+drives+intratumoral+macrophage+M2+polarization.">KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).</li><li>Medina, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+kinase+inhibition+limits+Batf3-dependent+dendritic+cell+development+and+antitumor+immunity.">Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).</li><li>Zhang, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+CD8(+)+T+cells+mediate+the+antitumor+efficacy+of+combined+CD40+ligation+and+imatinib+therapy+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).</li><li>. General Protocol for Western Blotting Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf</a> (2022)</li><li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+formalin-fixed,+paraffin+embedded+blocks.">Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 253-268 (2019).</li><li>Sy, J., Ang, L. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtomy:+Cutting+formalin-fixed,+paraffin-embedded+sections.">Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 269-278 (2019).</li><li>Seifert, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1/PD-L1+blockade+enhances+T-cell+activity+and+antitumor+efficacy+of+imatinib+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors.</a> Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+KIT+modulates+Type+I+IFN-mediated+antitumor+immunity+in+GIST.">Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST.</a> Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).</li><li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Kit+signaling+and+therapeutic+intervention+in+a+mouse+model+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).</li></ol>

Il modellomurino Kit V558Δ/+ è un potente strumento di ricerca nell'analisi molecolare e immunologica del GIST. Sebbene la strategia di allevamento richieda un singolo incrocio, l'utilizzo di coorti di topi KitV558Δ/+ in esperimenti di analisi della risposta tumorale richiede un allevamento estensivo. I topi dovrebbero essere abbinati all'età e al sesso per garantire pesi tumorali simili e il 10% dei topi muore prima delle 8 settimane di età quando i tumori sono stabiliti. Str...

GIST è il sarcoma più comune negli esseri umani con un'incidenza di circa 6.000 casi negli Stati Uniti d'America1. GiST sembra provenire dalle cellule pacemaker gastrointestinali chiamate cellule interstiziali di Cajal ed è tipicamente guidato da una singola mutazione nella tirosin-chinasi KIT o PDGFRA2. La chirurgia è il pilastro del trattamento per GIST e può essere curativa, ma i pazienti con malattia avanzata possono essere trattati con l'inibitore della tirosin-chinasi (TKI), imatinib. Dalla sua introduzione oltre 20 anni fa, imatinib ha trasformato il paradigma di trattamento in GIST, migliorando la sopravvivenza nella malattia avanzata da 1 a oltre 5 anni 3,4,5. Sfortunatamente, imatinib è raramente curativo a causa delle mutazioni KIT acquisite, quindi sono necessari nuovi trattamenti per questo tumore.
I modelli murini sono un importante strumento di ricerca nello studio di nuove terapie nel cancro. In GIST 6,7 sono stati sviluppati e studiati più modelli di xenotrapianto sottocutaneo e derivati dal paziente. Tuttavia, i topi immunodeficienti non rappresentano pienamente il GIST umano poiché i GIST ospitano profili immunitari differenziali a seconda della loro mutazione oncogenica e l'alterazione del microambiente tumorale gastrointestinale migliora gli effetti della terapia TKI 8,9. Il topo KitV558Δ/+ ha una delezione della linea germinale eterozigote nell'esone Kit 11, che codifica nel dominio juxtamembrane, il sito più comunemente mutato nel GIST10 umano. I topi del kitV558Δ/+ sviluppano un singolo GIST cecale con penetranza al 100% e i tumori hanno istologia, segnalazione molecolare, infiltrazione immunitaria e risposta alla terapia simili a quelle umane di GIST 8,11,12,13. Qui, descriviamo l'allevamento, il trattamento e l'isolamento e l'elaborazione dei campioni nei topi KitV558Δ / + per l'uso nella ricerca molecolare e immunologica in GIST.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x RBC lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mL syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody (C67E7)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini edta free protease inhibitor</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C852A34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Exel International</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C756V81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dog1 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab64085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C788U23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 850 Homogenizer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imatinib mesylate</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT antibody (D13A2)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KitV558&#916;/+ Genotyping</td>
			<td>Transnetyx</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1620145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9121673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody (S473)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-KIT antibody (Y719)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proeinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP170050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes</td>
			<td>Falcon/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS buffer (10x)</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (100mm2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Falcon</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisHCL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1757500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;vivaCT 80 platform</td>
			<td>Scanco medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor

Il tumore stromale gastrointestinale (GIST) è il sarcoma umano più comune ed è tipicamente guidato da una singola mutazione nel recettore KIT. Tra i tipi di tumore, sono stati sviluppati numerosi modelli murini al fine di studiare la prossima generazione di terapie contro il cancro. Tuttavia, in GIST, la maggior parte degli studi in vivo utilizza modelli murini con xenotrapianto che presentano limitazioni intrinseche. Qui, descriviamo un modello murino immunocompetente e geneticamente modificato di tumore stromale gastrointestinale che ospita una mutazione KitV558Δ / + . In questo modello, il KIT mutante, l'oncogene responsabile della maggior parte dei GIST, è guidato dal suo promotore endogeno che porta a un GIST che imita l'aspetto istologico e l'infiltrato immunitario visto nei GIST umani. Inoltre, questo modello è stato utilizzato con successo per studiare sia terapie molecolari mirate che immunitarie. Qui descriviamo l'allevamento e il mantenimento di una colonia di topi KitV558Δ/+ . Inoltre, questo documento descrive in dettaglio il trattamento e l'approvvigionamento di GIST, drenaggio del linfonodo mesenterico e cieco adiacente nei topi KitV558Δ / + , nonché la preparazione del campione per analisi molecolari e immunologiche.

Il modello murino Kit V558Δ/+ consente lo studio delle terapie in un modello murino immunocompetente. I topi KitV558Δ/+ hanno una durata media di 8 mesi a causa dell'ostruzione intestinale progressiva (Figura 4). I tumori dei topi kitV558Δ/+ esprimono marcatori canonici di GIST tra cui il KIT tirosin-chinasico e il canale transmembrana DOG1 (Figura 5...

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Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

L'obiettivo di questo manoscritto è quello di descrivere il modello murino KitV558Δ/+ e le tecniche per la dissezione e l'elaborazione di campioni di topo.

Tecniche molecolari e immunologiche in un modello murino geneticamente modificato di tumore stromale gastrointestinale

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

Il nostro protocollo descrive l'allevamento, la manutenzione, la dissezione e l'elaborazione del campione dell'unico modello murino immunocompetente, GIST, attualmente in uso. Speriamo che i futuri ricercatori saranno in grado di utilizzare questo modello murino al fine di promuovere la ricerca traslazionale in GIST. Le terapie tradizionali in GIST prevedono una terapia molecolare mirata con inibitori della tirosin-chinasi.Questo modello consente ai ricercatori di testare le immunoterapie in GIST. Per iniziare, sterilizzare tutti gli strumenti, indossare guanti durante la procedura e mantenere un campo sterile. Preparare l'area di incisione con etanolo al 70%.Usando le forbici, fai un'incisione verticale della linea mediana di due centimetri ed entra nella cavità addominale. Lisare bruscamente eventuali aderenze intra-addominali. Per rimuovere il linfonodo mesenterico drenante, identificare il cieco e sollevare il suo mesentere in modo superiore.Approssimativamente a metà strada verso la base del mesentere del colon, identificare il linfonodo mesenterico e sezionarlo bruscamente. Se necessario, dividere il tessuto linfonodale in terzi per l'isolamento proteico, l'istologia e la sospensione a singola cellula. Posizionare il tessuto linfonodale in 20 millilitri di mezzo RPMI per sospensioni monocellulari e mantenere sul ghiaccio.Il cieco è per lo più sostituito da un GIST nei topi Kit558. Per l'isolamento del GIST e del cieco, dividere attentamente la giunzione ileocolica dalla base del tumore. Quindi, dividere nuovamente il cieco, due centimetri distali alla base del tumore.Nel 50-60% dei topi Kit558, la testa del tumore contiene un cappuccio di tessuto cecale, che in genere contiene liquido sieroso, ma raramente può contenere pus. Sezionare bruscamente il tessuto del cappuccio lontano dal tessuto tumorale. Dividere il tessuto tumorale e il cieco in terzi per l'isolamento proteico, l'istologia e la sospensione unicellulare.Per le sospensioni monocellulari, posizionare il tessuto tumorale o il cieco in HBSS con il 2% di FCS, sufficiente per coprire il campione e mantenere il ghiaccio. Versare il mezzo RPMI con il campione linfonodale su un filtro di 100 micrometri. Spostare il filtro su una nuova conica da 50 millilitri e schiacciare il linfonodo con l'estremità morbida di una siringa di plastica da tre millilitri.Filtro di lavaggio con 20 millilitri di supporti RPMI. Centrifugare i campioni e aspirare il surnatante. Risospesso il pellet in 20 millilitri di tampone perline e versare su un filtro da 40 micrometri.Raccogliere il filtrato cellulare. Conta le cellule usando un emocitometro. Centrifugare i campioni ed eliminare il surnatante.Quindi, sospendere nuovamente il tampone per le perline per la citometria a flusso. Preparare il tampone di collagenasi come descritto nel manoscritto di testo. Mettere GIST in un piatto sterile e aggiungere 2,5 millilitri di tampone di collagenasi.Usando un bisturi sterile e forbici, tritare il tumore fino a quando non è in frammenti fini. Utilizzare una pipetta di grandi dimensioni per aspirare il tumore e la collagenasi in un tubo da 50 millilitri. Incubarlo a 37 gradi Celsius per 30 minuti a 100 rotazioni al minuto, quindi spegnere la reazione con due millilitri di FBS.Versare la collagenasi con il campione GIST su un filtro da 100 micrometri e schiacciare il tumore con l'estremità morbida di una siringa di plastica da tre millilitri e raccogliere in un tubo da 50 millilitri. Filtro di lavaggio con 20 millilitri di HBSS. Centrifugare il filtrato a 450 RCF per cinque minuti a quattro gradi Celsius, quindi scartare il surnatante.Risospesso il pellet in 20 millilitri di tampone perline e versare su un filtro da 40 micrometri Raccogliere il filtrato e contare le celle utilizzando un emocitometro. Centrifugare e aspirare il surnatante, quindi risospendere nel tampone perline per la citometria a flusso. Usando le forbici, dividere il cieco longitudinalmente per esporre la mucosa interna.Taglialo in sezioni da 0,5 centimetri e mettilo in un tubo da 50 millilitri con cinque millilitri di HBSS e 2% FBS. Agitare energicamente per 30 secondi e centrifugare a 450 RCF per 20 secondi. Quindi, scartare il surnatante.Aggiungere da cinque a 20 millilitri di HBSS con EDTA a due millimolari. Incubarlo a 37 gradi Celsius a 100 rotazioni al minuto per 15 minuti. Centrifugare e scartare il surnatante, quindi risospescere il pellet in cinque-20 millilitri di HBSS.Agitare vigorosamente la miscela per 30 secondi, quindi centrifugare a 450 RCF per 20 secondi ed eliminare il surnatante. Ripeti questo processo ancora una volta. Risospendare il pellet in cinque millilitri di tampone di collagenasi, quindi incubarlo a 37 gradi Celsius per 30 minuti a 100 rotazioni al minuto.Agitare vigorosamente ogni 10 minuti e spegnere la reazione con due millilitri di FBS. Versare la collagenasi con il campione di cieco su un filtro di 100 micrometri e schiacciare con l'estremità morbida di una siringa di plastica da tre millilitri. Lavare il filtro con 20 millilitri di HBSS e raccogliere il filtrato.Centrifugare e scartare il surnatante. Risospesso il pellet in 20 millilitri di tampone perline e versare su un filtro da 40 micrometri. Raccogliere filtrare e contare le cellule utilizzando un emocitometro.Ripetere ancora una volta il processo di centrifugazione e risospesciare il pellet nel tampone perline per la citometria a flusso. I topi Kit558 hanno avuto una durata media di otto mesi a causa dell'ostruzione intestinale progressiva. I tumori dei topi Kit558 hanno espresso marcatori canonici di GIST, tra cui il KIT tirosin-chinasico, il canale transmembrana Dog1 e il fattore di trascrizione ETV1.I tumori sono stati studiati per i cambiamenti nella via di segnalazione KIT come i marcatori a valle ERK e AKT o il microambiente immunitario, che imitava da vicino il GIST umano. La risonanza magnetica o la TC sono state utilizzate per tracciare il volume del tumore come misurazione accurata della risposta tumorale. Sezionare il tumore lontano dalla giunzione ileocolica e lontano dal cappuccio cecale è importante per catturare il vero peso del tumore e l'analisi immunitaria e molecolare.All'interno del GIST, questo modello ha permesso lo studio del microambiente tumorale, nonché delle immunoterapie.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Il Colon-26 Carcinoma tumore-cuscinetto mouse come un modello per lo studio del cancro cachessia

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Un tumore modello murino ortotopico della vescica e del tumore Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolamento delle cellule tumorali circolanti in un modello di topo ortotopico del tumore del colon-retto

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Un modello di mouse geneticamente modificato del cancro colorettale sporadico

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Attecchimento del tumore in un modello murino di xenotrapianto di umano linfoma a cellule mantellari

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Utilizing High Resolution Ultrasound to Monitor Tumor Onset and Growth in Genetically Engineered Pancreatic Cancer Models

Utilizzando ultrasuoni ad alta risoluzione per Monitor l'inizio del tumore e la crescita nei modelli geneticamente del cancro del pancreas

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

In Vitro Creazione di una linea cellulare di cancro di Murine geneticamente ingegnerizzato e collo utilizzando un sistema Adeno-Associated Virus-Cas9

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Un nuovo modello di spheroid del tumore strutturato in 3D modulato come fibromastro per studiare l'interazione tumora-stroma e la scoperta di farmaci

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Un modello murino per studiare il ruolo dei fibroblasti associati al cancro nella crescita tumorale

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...