Name: molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor
Uploaded: 2022-05-02T15:00:00
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キットV558Δ/+ マウスは遺伝子操作され、Peter Besmer10博士によって共有されました。この作業は、NIHの助成金R01 CA102613およびT32 CA251063によって支援されました。

すべてのマウスを、NIHガイドラインに従い、ペンシルベニア大学IACUCの承認を得て、ペンシルベニア大学で病原体を含まない条件下で飼育した。安楽死は、ペンシルベニア大学実験動物資源の標準作業手順に従って実施した。
1. キットV558Δ/+ マウス飼育
<ol><li>C57BL/6Jマウスを用いて 、キットV558Δ/+ マウス?...

<ol>
	<li>Mastrangelo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+soft+tissue+sarcoma+and+beyond:+a+population-based+prospective+study+in+3+European+regions.">Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions.</a> Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).</li><li>Joensuu, H., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+management+of+gastrointestinal+stromal+tumors:+a+model+for+targeted+and+multidisciplinary+therapy+of+malignancy.">The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy.</a> Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).</li><li>Blanke, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+results+from+a+randomized+phase+II+trial+of+standard-+versus+higher-dose+imatinib+mesylate+for+patients+with+unresectable+or+metastatic+gastrointestinal+stromal+tumors+expressing+KIT.">Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).</li><li>Demetri, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+regorafenib+for+advanced+gastrointestinal+stromal+tumours+after+failure+of+imatinib+and+sunitinib+(GRID):+an+international,+multicentre,+randomised,+placebo-controlled,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial.</a> Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).</li><li>Gold, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcome+of+metastatic+GIST+in+the+era+before+tyrosine+kinase+inhibitors.">Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).</li><li>Huynh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib+induces+growth+suppression+in+mouse+models+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).</li><li>Na, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+xenografts+from+patients+with+gastrointestinal+stromal+tumors:+analysis+of+clinicopathological+characteristics+related+to+engraftment+success.">Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).</li><li>Balachandran, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+potentiates+antitumor+T+cell+responses+in+gastrointestinal+stromal+tumor+through+the+inhibition+of+Ido.">Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido.</a> Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).</li><li>Vitiello, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+immune+profiles+distinguish+the+mutational+subtypes+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).</li><li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase.">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).</li><li>Cavnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIT+oncogene+inhibition+drives+intratumoral+macrophage+M2+polarization.">KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).</li><li>Medina, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+kinase+inhibition+limits+Batf3-dependent+dendritic+cell+development+and+antitumor+immunity.">Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).</li><li>Zhang, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+CD8(+)+T+cells+mediate+the+antitumor+efficacy+of+combined+CD40+ligation+and+imatinib+therapy+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).</li><li>. General Protocol for Western Blotting Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf</a> (2022)</li><li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+formalin-fixed,+paraffin+embedded+blocks.">Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 253-268 (2019).</li><li>Sy, J., Ang, L. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtomy:+Cutting+formalin-fixed,+paraffin-embedded+sections.">Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 269-278 (2019).</li><li>Seifert, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1/PD-L1+blockade+enhances+T-cell+activity+and+antitumor+efficacy+of+imatinib+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors.</a> Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+KIT+modulates+Type+I+IFN-mediated+antitumor+immunity+in+GIST.">Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST.</a> Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).</li><li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Kit+signaling+and+therapeutic+intervention+in+a+mouse+model+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).</li></ol>

KitV558Δ/+ マウスモデルは、GIST の分子および免疫学的解析における強力な研究ツールです。育種戦略では単一の交配が必要ですが、腫瘍応答を分析する実験でKitV558Δ/+マウスコホートを使用するには、広範な交配が必要です。マウスは、同様の腫瘍重量を確保するために年齢と性別が一致している必要があり、腫瘍が確立された8週齢前にマウスの10%が死亡する。C...

GISTはヒトで最も一般的な肉腫であり、米国では約6,000例の発生率を有する1。GISTは、Cajalの間質細胞と名付けられた胃腸ペースメーカー細胞に由来するようであり、典型的にはチロシンキナーゼKITまたはPDGFRA2の単一の変異によって駆動される。手術はGISTの治療の柱であり、治癒的であり得るが、進行した疾患を有する患者は、チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)、イマチニブで治療することができる。20年以上前に導入されて以来、イマチニブはGISTの治療パラダイムを変革し、進行した疾患の生存率を1年から5年以上に改善しました3,4,5。残念なことに、イマチニブは後天的なKIT変異のために治癒することはめったにないので、この腫瘍には新しい治療法が必要です。
マウスモデルは、がんにおける新規治療法の調査において重要な研究ツールである。複数の皮下異種移植片および患者由来異種移植片モデルが開発され、GIST6,7で調査されている。しかし、GISTは発癌性変異に応じて異なる免疫プロファイルを保有し、胃腸腫瘍微小環境の変化はTKI療法の効果を改善するため、免疫不全マウスはヒトGISTを完全には表していない8,9。KitV558Δ/+マウスは、ヒトGIST 10で最も一般的に変異した部位である並膜ドメインをコードするキットエクソン11においてヘテロ接合性生殖細胞系列欠失を有する。キットV558Δ/+マウスは、100%の浸透率を有する単一の盲腸GISTを発達させ、腫瘍はヒトGIST 8,11,12,13と同様の組織学、分子シグナル伝達、免疫浸潤、および治療に対する応答を有する。ここでは、GISTの分子・免疫学的研究に用いるキットV558Δ/+マウスの育種・治療・検体の単離・処理について述べる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x RBC lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mL syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody (C67E7)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini edta free protease inhibitor</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C852A34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Exel International</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C756V81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dog1 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab64085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C788U23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 850 Homogenizer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imatinib mesylate</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT antibody (D13A2)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KitV558&#916;/+ Genotyping</td>
			<td>Transnetyx</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1620145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9121673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody (S473)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-KIT antibody (Y719)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proeinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP170050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes</td>
			<td>Falcon/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS buffer (10x)</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (100mm2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Falcon</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisHCL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1757500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;vivaCT 80 platform</td>
			<td>Scanco medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor

胃腸間質腫瘍(GIST)は最も一般的なヒト肉腫であり、典型的にはKIT受容体の単一の変異によって駆動される。腫瘍の種類を超えて、次世代のがん治療法を調査するために、多数のマウスモデルが開発されてきた。しかし、GISTでは、ほとんどの in vivo 研究は、固有の制限を有する異種移植マウスモデルを使用する。ここでは、 KitV558Δ/+ 変異を保有する消化管間質腫瘍の免疫能を有する遺伝子操作マウスモデルについて説明する。このモデルでは、ほとんどのGISTの原因となる癌遺伝子である変異KITは、その内因性プロモーターによって駆動され、ヒトGISTに見られる組織学的外観および免疫浸潤を模倣するGISTにつながる。さらに、このモデルは、標的分子療法と免疫療法の両方を調査するために首尾よく使用されています。ここでは、 キットV558Δ/+ マウスコロニーの飼育と維持について述べる。さらに、この論文では、 KitV558Δ/+ マウスにおけるGISTの治療と調達、腸間膜リンパ節の排出、隣接する盲腸、ならびに分子および免疫学的分析のためのサンプル調製について詳述します。

KitV558Δ/+マウスモデルは、免疫適格マウスモデルにおける治療薬の調査を可能にします。キットV558Δ/+マウスの平均寿命は、進行性の腸閉塞により8ヶ月である(図4)。KitV558Δ/+マウスの腫瘍は、チロシンキナーゼKITおよび膜貫通チャネルDOG1(図5)、ならびに転写因子ETV1(図</stro...

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Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

この原稿の目的は、 KitV558Δ/+マウスモデルと、マウス標本の解剖と処理を成功させるための技術を説明することです。

消化管間質腫瘍の遺伝子操作マウスモデルにおける分子および免疫学的技術

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

当社のプロトコルは、現在使用されている唯一の免疫適格マウスモデルであるGISTの繁殖、維持、解剖、および検体処理について説明しています。今後の研究者には、このマウスモデルをGISTでのトランスレーショナルリサーチに活用していただきたいと考えています。GISTの伝統的な治療法は、チロシンキナーゼ阻害剤による標的分子療法を含む。このモデルにより、研究者はGISTで免疫療法をテストすることができます。まず、すべての器具を滅菌し、手順全体を通して手袋を着用し、滅菌フィールドを維持します。切開部を70%エタノールで準備する。はさみを使用して、2センチメートルの正中線垂直切開を行い、腹腔に入る。腹腔内癒着を鋭く溶解する。排水する腸間膜リンパ節を除去するには、盲腸を特定し、その腸間膜を優越的に持ち上げる。結腸腸間膜の基部のほぼ中間で、腸間膜リンパ節を同定し、それを鋭く解剖する。必要に応じて、リンパ節組織を3分の1に分割して、タンパク質単離、組織学、および単一細胞懸濁液を得る。リンパ節組織を単一細胞懸濁液用のRPMI培地の20ミリリットルに入れ、氷上に保つ。盲腸は、Kit558マウスのGISTによって主に置き換えられる。GISTと盲腸を単離するために、回腸結節を腫瘍の基部から慎重に分割する。次に、盲腸を再び、腫瘍の基部に対して2センチメートル遠位に分割する。Kit558マウスの50〜60%において、腫瘍の頭部には盲腸組織のキャップが含まれており、これは典型的には漿液を含むが、膿を含むことはめったにない。キャップ組織を腫瘍組織から遠ざけて鋭く解剖する。腫瘍組織と盲腸を3分の1に分割して、タンパク質単離、組織学、および単一細胞懸濁液を得る。単一細胞懸濁液の場合は、腫瘍組織または盲腸を2%FCSでHBSSに入れ、サンプルを覆うのに十分であり、氷の上に保つ。リンパ節検体を含むRPMI培地を100マイクロメートルのフィルターに注ぎます。フィルターを新しい50ミリリットルの円錐形に移動し、リンパ節を3ミリリットルのプラスチックシリンジの柔らかい端でマッシュアップします。フィルターを20ミリリットルのRPMI培地で洗浄します。サンプルを遠心分離し、上清を吸引します。ペレットを20ミリリットルのビーズバッファーに再懸濁し、40マイクロメートルのフィルターに注ぎます。細胞濾液を採取する。血球計数器を用いて細胞を計数する。サンプルを遠心分離し、上清を捨てる。次いで、フローサイトメトリー用のビーズ緩衝液に再懸濁する。テキスト原稿に記載されているようにコラゲナーゼ緩衝液を調製する。滅菌皿にGISTを入れ、2.5ミリリットルのコラゲナーゼ緩衝液を加える。滅菌メスとはさみを使用して、腫瘍が細かい断片になるまで腫瘍をミンチします。大口径ピペットを使用して、腫瘍とコラゲナーゼを50ミリリットルのチューブに吸引します。摂氏37度で毎分100回転で30分間インキュベートし、次いで2ミリリットルのFBSで反応をクエンチする。GIST標本を含むコラゲナーゼを100マイクロメートルのフィルターに注ぎ、3ミリリットルのプラスチックシリンジの柔らかい端で腫瘍をマッシュアップし、50ミリリットルのチューブに集める。20ミリリットルのHBSSでフィルターを洗浄します。濾液を450RCFで摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を捨てる。ペレットを20ミリリットルのビーズバッファーに再懸濁し、濾液を収集し、血球計数器を使用して細胞を計数する40マイクロメートルフィルターに注ぎます。遠心分離機で上清を吸引し、次いでフローサイトメトリー用のビーズバッファーに再懸濁する。はさみを用いて、盲腸を縦方向に分割し、内粘膜を露出させた。それを0.5センチメートルのセクションに切断し、5ミリリットルのHBSSと2%FBSを入れた50ミリリットルのチューブに入れます。30秒間激しく振とうし、450RCFで20秒間遠心分離する。その後、上清を捨てる。5~20ミリリットルのHBSSを2ミリモルのEDTAで加える。摂氏37度で毎分100回転で15分間インキュベートします。遠心分離機で上清を捨て、次いでペレットを5〜20ミリリットルのHBSSに再懸濁する。混合物を30秒間激しく振とうし、次いで450RCFで20秒間遠心分離し、上清を捨てる。このプロセスをもう一度繰り返します。ペレットを5ミリリットルのコラゲナーゼ緩衝液に再懸濁し、摂氏37度で毎分100回転で30分間インキュベートする。10分ごとに激しく振とうし、2ミリリットルのFBSで反応を急冷する。100マイクロメートルのフィルターの上に盲腸標本を含むコラゲナーゼを注ぎ、3ミリリットルのプラスチックシリンジの柔らかい端でマッシュアップします。フィルターを20ミリリットルのHBSSで洗浄し、ろ液を回収する。遠心分離機で上清を捨てる。ペレットを20ミリリットルのビーズバッファーに再懸濁し、40マイクロメートルのフィルターに注ぎます。濾液を収集し、血球計数器を用いて細胞を計数する。遠心分離プロセスをもう一度繰り返し、フローサイトメトリー用のビーズバッファーにペレットを再懸濁します。Kit558マウスの平均寿命は、進行性の腸閉塞のために8ヶ月であった。Kit558マウス由来の腫瘍は、チロシンキナーゼKIT、膜貫通チャネルDog1、および転写因子ETV1を含むGISTの正準マーカーを発現した。腫瘍は、ヒトGISTを密接に模倣した下流マーカーERKおよびAKTまたは免疫微小環境などのKITシグナル伝達経路の変化について研究された。MRIまたはCTは、腫瘍応答の正確な測定として腫瘍体積を追跡するために使用された。回腸骨接合部から離れ、盲腸キャップから離れて腫瘍を解剖することは、真の腫瘍重量および免疫および分子分析を捕捉するために重要である。GIST内では、このモデルは腫瘍微小環境の調査と免疫療法を可能にしました。

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結腸直腸癌モデルマウスにおける循環腫瘍細胞の単離

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

散発性結腸直腸癌の遺伝子操作マウスモデル

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

人間マントル細胞リンパ腫の異種移植マウス モデルにおける腫瘍生着

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Utilizing High Resolution Ultrasound to Monitor Tumor Onset and Growth in Genetically Engineered Pancreatic Cancer Models

高解像度モニター腫瘍発症と遺伝子組み換えの膵癌モデルの成長に超音波を利用しました。

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

アデノ関連ウイルス-Cas9システムを用いた遺伝子操作マウス頭頸部癌細胞株のインビトロ確立

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

腫瘍間質相互作用と創薬を研究するための新規ストロマ線維芽細胞変調3D腫瘍球状モデル

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

腫瘍増殖における癌関連線維芽細胞の役割を調べるためのマウスモデル

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...