Name: molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor
Uploaded: 2022-05-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor at JoVE.com

KitV558Δ/+ mus ble genetisk konstruert og delt av Dr. Peter Besmer10. Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd R01 CA102613 og T32 CA251063.

Alle mus ble plassert under patogenfrie forhold ved University of Pennsylvania i henhold til NIH-retningslinjer og med godkjenning fra University of Pennsylvania IACUC. Eutanasi ble utført etter standard driftsprosedyrer fra University of Pennsylvania Laboratory Animal Resources.
1. KitV558Δ /+ musavl
<ol><li>Backcross KitV558Δ/+ musene mer enn 10 ganger på en C57BL/6J-bakgrunn ved hjelp av C57BL/6J-mus...

<ol>
	<li>Mastrangelo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+soft+tissue+sarcoma+and+beyond:+a+population-based+prospective+study+in+3+European+regions.">Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions.</a> Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).</li><li>Joensuu, H., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+management+of+gastrointestinal+stromal+tumors:+a+model+for+targeted+and+multidisciplinary+therapy+of+malignancy.">The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy.</a> Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).</li><li>Blanke, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+results+from+a+randomized+phase+II+trial+of+standard-+versus+higher-dose+imatinib+mesylate+for+patients+with+unresectable+or+metastatic+gastrointestinal+stromal+tumors+expressing+KIT.">Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).</li><li>Demetri, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+regorafenib+for+advanced+gastrointestinal+stromal+tumours+after+failure+of+imatinib+and+sunitinib+(GRID):+an+international,+multicentre,+randomised,+placebo-controlled,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial.</a> Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).</li><li>Gold, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcome+of+metastatic+GIST+in+the+era+before+tyrosine+kinase+inhibitors.">Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).</li><li>Huynh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib+induces+growth+suppression+in+mouse+models+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).</li><li>Na, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+xenografts+from+patients+with+gastrointestinal+stromal+tumors:+analysis+of+clinicopathological+characteristics+related+to+engraftment+success.">Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).</li><li>Balachandran, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+potentiates+antitumor+T+cell+responses+in+gastrointestinal+stromal+tumor+through+the+inhibition+of+Ido.">Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido.</a> Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).</li><li>Vitiello, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+immune+profiles+distinguish+the+mutational+subtypes+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).</li><li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase.">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).</li><li>Cavnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIT+oncogene+inhibition+drives+intratumoral+macrophage+M2+polarization.">KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).</li><li>Medina, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+kinase+inhibition+limits+Batf3-dependent+dendritic+cell+development+and+antitumor+immunity.">Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).</li><li>Zhang, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+CD8(+)+T+cells+mediate+the+antitumor+efficacy+of+combined+CD40+ligation+and+imatinib+therapy+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).</li><li>. General Protocol for Western Blotting Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf</a> (2022)</li><li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+formalin-fixed,+paraffin+embedded+blocks.">Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 253-268 (2019).</li><li>Sy, J., Ang, L. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtomy:+Cutting+formalin-fixed,+paraffin-embedded+sections.">Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 269-278 (2019).</li><li>Seifert, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1/PD-L1+blockade+enhances+T-cell+activity+and+antitumor+efficacy+of+imatinib+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors.</a> Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+KIT+modulates+Type+I+IFN-mediated+antitumor+immunity+in+GIST.">Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST.</a> Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).</li><li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Kit+signaling+and+therapeutic+intervention+in+a+mouse+model+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).</li></ol>

KitV558Δ/+ musemodellen er et kraftig forskningsverktøy i molekylær og immunologisk analyse av GIST. Selv om avlsstrategien krever et enkelt kryss, krever bruk av KitV558Δ/+ musekohorter i eksperimenter som analyserer tumorrespons omfattende avl. Mus bør være alder- og sex-matchet for å sikre lignende tumorvekter, og 10% av musene dør før 8 ukers alder når svulster etableres. Mindre omfattende avlsstrategier er mulig hvis du bruker avanserte avbildningsteknikker som CT el...

GIST er den vanligste sarkom hos mennesker med en forekomst på ca 6000 tilfeller i USA1. GIST ser ut til å stamme fra de gastrointestinale pacemakercellene som kalles interstitialcellene i Cajal, og er vanligvis drevet av en enkelt mutasjon i tyrosinkinase KIT eller PDGFRA2. Kirurgi er bærebjelken i behandlingen for GIST og kan være kurativ, men pasienter med avansert sykdom kan behandles med tyrosinkinasehemmeren (TKI), imatinib. Siden introduksjonen for over 20 år siden har imatinib forvandlet behandlingsparadigmet i GIST, noe som forbedrer overlevelsen ved avansert sykdom fra 1 til over 5 år 3,4,5. Dessverre er imatinib sjelden kurativ på grunn av oppkjøpte KIT-mutasjoner, så det er behov for nye behandlinger for denne svulsten.
Musemodeller er et viktig forskningsverktøy i undersøkelsen av nye terapier i kreft. Flere subkutane xenograft- og pasientavledede xenograftmodeller er utviklet og undersøkt i GIST 6,7. Imidlertid representerer immunodeficient mus ikke fullt ut menneskelig GIST siden GISTs har differensial immunprofiler avhengig av deres onkogene mutasjon, og endring av gastrointestinal tumormikromiljø forbedrer effekten av TKI-terapi 8,9. KitV558Δ/+-musen har en heterzygot bakteriesletting i Kit exon 11, som koder juxtamembrane-domenet, det mest muterte nettstedet i humant GIST10. KitV558Δ/+ mus utvikler en enkelt cecal GIST med 100% penetrans, og svulster har lignende histologi, molekylær signalering, immuninfiltrasjon og respons på terapi som menneskelig GIST 8,11,12,13. Her beskriver vi avl, behandling og prøveisolasjon og prosessering i KitV558Δ/+ mus til bruk i molekylær og immunologisk forskning i GIST.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x RBC lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mL syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody (C67E7)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini edta free protease inhibitor</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C852A34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Exel International</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C756V81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dog1 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab64085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C788U23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 850 Homogenizer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imatinib mesylate</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT antibody (D13A2)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KitV558&#916;/+ Genotyping</td>
			<td>Transnetyx</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1620145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9121673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody (S473)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-KIT antibody (Y719)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proeinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP170050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes</td>
			<td>Falcon/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS buffer (10x)</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (100mm2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Falcon</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisHCL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1757500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;vivaCT 80 platform</td>
			<td>Scanco medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) er den vanligste menneskelige sarkom og er vanligvis drevet av en enkelt mutasjon i KIT-reseptoren. På tvers av tumortyper er det utviklet mange musemodeller for å undersøke neste generasjon kreftbehandlinger. Men i GIST bruker de fleste in vivo-studier xenograftmusmodeller som har iboende begrensninger. Her beskriver vi en immunotokmpetent, genetisk konstruert musemodell av gastrointestinal stromal svulst som huser en KitV558Δ/+ mutasjon. I denne modellen er mutant KIT, oncogene ansvarlig for de fleste GISTs, drevet av sin endogene promotor som fører til en GIST som etterligner det histologiske utseendet og immuninfiltrering sett i menneskelige GISTs. Videre har denne modellen blitt brukt med hell for å undersøke både målrettede molekylære og immunterapier. Her beskriver vi avl og vedlikehold av en KitV558Δ/+ musekoloni. I tillegg beskriver dette dokumentet behandling og anskaffelse av GIST, drenering av mesenterisk lymfeknute og tilstøtende cecum i KitV558Δ/+ mus, samt prøvepreparering for molekylære og immunologiske analyser.

KitV558Δ/+-musemodellen gjør det mulig å undersøke terapeutiske behandlinger i en immunokokkmusmodell. KitV558Δ/+ mus har en gjennomsnittlig levetid på 8 måneder på grunn av progressiv tarmobstruksjon (figur 4). Svulster fra KitV558Δ/+ mus uttrykker kanoniske markører av GIST, inkludert tyrosinkinaseSETTET og transmembrankanalen DOG1 (figur 5<...

Watch this Scientific Journal Video about Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor at JoVE.com

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

Målet med dette manuskriptet er å beskrive KitV558Δ/+ musemodell og teknikker for vellykket disseksjon og behandling av museprøver.

Molekylære og immunologiske teknikker i en genetisk konstruert musemodell av gastrointestinal stromal tumor

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

Vår protokoll beskriver avl, vedlikehold, disseksjon og prøvebehandling av den eneste immunkompetente musemodellen GIST, som for tiden er i bruk. Vi håper at fremtidige forskere vil kunne bruke denne musemodellen for å videreoverstille forskning i GIST. Tradisjonelle terapier i GIST innebærer målrettet molekylær terapi med tyrosinkinasehemmere.Denne modellen gjør det mulig for forskere å teste immunterapier i GIST. For å begynne med sterilisere alle instrumenter, bruk hansker gjennom hele prosedyren, og oppretthold et sterilt felt. Forbered snittområdet med 70% etanol.Bruk saks, lag et to centimeter midtlinje vertikalt snitt og gå inn i bukhulen. Lyse kraftig noen intra-abdominal adhesjoner. For å fjerne den drenerende mesenteriske lymfeknuten, identifiser cecum og løft mesenteriet overlegent.Omtrent midtveis i bunnen av det koloniske mesenteriet, identifiser den mesenteriske lymfeknuten og disseker den skarpt. Del om nødvendig lymfeknutevev i tredjedeler for proteinisolasjon, histologi og enkeltcellet suspensjon. Plasser lymfeknutevev i 20 milliliter RPMI-medium for encellede suspensjoner og hold på is.Cecum er for det meste erstattet av en GIST i Kit558 mus. For isolering av GIST og cecum, del forsiktig det ileopiske krysset fra bunnen av svulsten. Deretter deler du cecum igjen, to centimeter distal til bunnen av svulsten.I 50 til 60% av Kit558-musene inneholder svulstens hode en hette av cecal vev, som vanligvis inneholder serøs væske, men kan sjelden inneholde pus. Disseker hettevevet kraftig vekk fra tumorvevet. Del tumorvevet og cecum i tredjedeler for proteinisolasjon, histologi og encellet suspensjon.For encellede suspensjoner, plasser tumorvev eller cecum i HBSS med 2% FCS, nok til å dekke prøven, og hold på is. Hell RPMI-medier med lymfeknuteprøven over et 100-mikrometer filter. Flytt filteret til en ny konisk 50 milliliter, og mos lymfeknuten med den myke enden av en tre milliliter plastsprøyte.Vask filteret med 20 milliliter RPMI-medier. Sentrifuger prøvene og aspirer supernatanten. Resuspend pellet i 20 milliliter perlebuffer og hell over et 40-mikrometer filter.Samle cellefiltratet. Telle celler ved hjelp av et hemocytometer. Sentrifuger prøvene og kast supernatanten.Deretter resuspend i perlebuffer for strømningscytometri. Forbered kollagenalbuffer som beskrevet i tekstmanuskriptet. Plasser GIST i en steril tallerken og tilsett 2,5 milliliter kollagenalissebuffer.Bruk en steril skalpell og saks, hakk svulsten til den er i fine fragmenter. Bruk en storboret pipette for å aspirere svulsten og kollagenalen i et 50 milliliterrør. Inkuber den ved 37 grader Celsius i 30 minutter ved 100 rotasjoner per minutt, og slukk deretter reaksjonen med to milliliter FBS.Hell kollagenasen med GIST-prøve over et 100-mikrometer filter og mos svulsten med den myke enden av en tre milliliter plastsprøyte og samle i et 50 milliliter rør. Vask filteret med 20 milliliter HBSS. Sentrifuger filtratet ved 450 RCF i fem minutter ved fire grader Celsius, og kast deretter supernatanten.Resuspend pellet i 20 milliliter perlebuffer og hell over et 40-mikrometer filter Samle filtratet og telle celler ved hjelp av et hemocytometer. Sentrifuger og aspirer supernatanten, og resuspend deretter i perlebuffer for strømningscytometri. Bruk saks, del cecum langsgående for å eksponere den indre slimhinnen.Klipp den i 0,5 centimeter seksjoner og legg den i et 50 milliliter rør med fem milliliter HBSS og 2% FBS. Rist kraftig i 30 sekunder og sentrifuger ved 450 RCF i 20 sekunder. Kast deretter supernatanten.Legg til fem til 20 milliliter HBSS med to millimolar EDTA. Inkuber den ved 37 grader Celsius ved 100 rotasjoner per minutt i 15 minutter. Sentrifuger og kast supernatanten, og bruk deretter pelletsen på nytt i fem til 20 milliliter HBSS.Rist blandingen kraftig i 30 sekunder, sentrifuger deretter ved 450 RCF i 20 sekunder og kast supernatanten. Gjenta denne prosessen en gang til. Resuspend pellet i fem milliliter kollagenalisse buffer, deretter inkubere den ved 37 grader Celsius i 30 minutter ved 100 rotasjoner per minutt.Rist kraftig hvert 10. Hell kollagen med cecumprøve over et 100-mikrometer filter og mos med den myke enden av en tre milliliter plastsprøyte. Vask filteret med 20 milliliter HBSS og samle filtratet.Sentrifuger og kast supernatanten. Resuspend pellet i 20 milliliter perlebuffer og hell over et 40-mikrometer filter. Samle filtrat- og telleceller ved hjelp av et hemocytometer.Gjenta sentrifugeringsprosessen igjen og resuspender pellet i perlebuffer for strømningscytometri. Kit558-musene hadde en gjennomsnittlig levetid på åtte måneder på grunn av progressiv tarmobstruksjon. Svulster fra Kit558-musene uttrykte kanoniske markører av GIST, inkludert tyrosinkinase KIT, transmembranekanalen Dog1 og transkripsjonsfaktoren ETV1.Tumorer ble studert for endringer i KIT-signalveien som nedstrømsmarkørene ERK og AKT eller immunmikromiljø, som tett etterlignet menneskelig GIST. MR eller CT ble brukt til å spore tumorvolum som en nøyaktig måling av tumorrespons. Dissekering av svulsten vekk fra det ileokortiske krysset og bort fra cecal cap er viktig for å fange ekte tumorvekt og immun- og molekylær analyse.Innenfor GIST har denne modellen tillatt undersøkelse av tumormikromiljøet, samt immunterapi.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantifisering av genekspresjon og Tumor Invasivitet Bruke Genetic Mosaikk

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Colon-26 karsinom Tumor-bærende mus som en modell for studier av kreft kakeksi

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

En Murine ortotopiske Blære Tumor Model og Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolering av sirkulerende tumorceller i en ortotopisk musemodell av kolorektal kreft

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

En genetisk utviklet musemodell av sporadisk kolorektal kreft

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Svulst Engraftment i en Xenograft musemodell av menneskelig mantelen celle lymfomer

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Utilizing High Resolution Ultrasound to Monitor Tumor Onset and Growth in Genetically Engineered Pancreatic Cancer Models

Utnytte høyoppløselig ultralyd Monitor svulst utbruddet og vekst i genmodifiserte bukspyttkjertelkreft modeller

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

Opprettelse av en genetisk konstruert murine hode-og nakke kreftcelle linje ved bruk av et Adeno-tilknyttet virus Cas9 system

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

En roman Stromal Fibroblast-Modulert 3D Tumor Sfæroid Modell for å studere tumor-Stroma interaksjon og narkotika oppdagelse

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

En musemodell for å undersøke rollen som kreftassosierte fibroblaster i tumorvekst

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...