Name: molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor
Uploaded: 2022-05-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor at JoVE.com

Мыши KitV558Δ/+ были генетически модифицированы и совместно использовались доктором Питером Бесмером10. Эта работа была поддержана грантами NIH R01 CA102613 и T32 CA251063.

Все мыши были размещены в условиях, свободных от патогенов, в Университете Пенсильвании в соответствии с руководящими принципами NIH и с одобрения Университета Пенсильвании IACUC. Эвтаназия проводилась в соответствии со стандартными операционными процедурами Университета Пенсильвании ?...

<ol>
	<li>Mastrangelo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+soft+tissue+sarcoma+and+beyond:+a+population-based+prospective+study+in+3+European+regions.">Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions.</a> Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).</li><li>Joensuu, H., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+management+of+gastrointestinal+stromal+tumors:+a+model+for+targeted+and+multidisciplinary+therapy+of+malignancy.">The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy.</a> Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).</li><li>Blanke, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+results+from+a+randomized+phase+II+trial+of+standard-+versus+higher-dose+imatinib+mesylate+for+patients+with+unresectable+or+metastatic+gastrointestinal+stromal+tumors+expressing+KIT.">Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).</li><li>Demetri, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+regorafenib+for+advanced+gastrointestinal+stromal+tumours+after+failure+of+imatinib+and+sunitinib+(GRID):+an+international,+multicentre,+randomised,+placebo-controlled,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial.</a> Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).</li><li>Gold, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcome+of+metastatic+GIST+in+the+era+before+tyrosine+kinase+inhibitors.">Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).</li><li>Huynh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib+induces+growth+suppression+in+mouse+models+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).</li><li>Na, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+xenografts+from+patients+with+gastrointestinal+stromal+tumors:+analysis+of+clinicopathological+characteristics+related+to+engraftment+success.">Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).</li><li>Balachandran, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+potentiates+antitumor+T+cell+responses+in+gastrointestinal+stromal+tumor+through+the+inhibition+of+Ido.">Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido.</a> Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).</li><li>Vitiello, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+immune+profiles+distinguish+the+mutational+subtypes+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).</li><li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase.">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).</li><li>Cavnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIT+oncogene+inhibition+drives+intratumoral+macrophage+M2+polarization.">KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).</li><li>Medina, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+kinase+inhibition+limits+Batf3-dependent+dendritic+cell+development+and+antitumor+immunity.">Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).</li><li>Zhang, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+CD8(+)+T+cells+mediate+the+antitumor+efficacy+of+combined+CD40+ligation+and+imatinib+therapy+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).</li><li>. General Protocol for Western Blotting Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf</a> (2022)</li><li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+formalin-fixed,+paraffin+embedded+blocks.">Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 253-268 (2019).</li><li>Sy, J., Ang, L. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtomy:+Cutting+formalin-fixed,+paraffin-embedded+sections.">Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 269-278 (2019).</li><li>Seifert, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1/PD-L1+blockade+enhances+T-cell+activity+and+antitumor+efficacy+of+imatinib+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors.</a> Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+KIT+modulates+Type+I+IFN-mediated+antitumor+immunity+in+GIST.">Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST.</a> Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).</li><li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Kit+signaling+and+therapeutic+intervention+in+a+mouse+model+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).</li></ol>

Мышиная модель KitV558Δ/+ является мощным исследовательским инструментом в молекулярном и иммунологическом анализе GIST. Хотя стратегия разведения требует одного скрещивания, использование когорт мышей KitV558Δ/+ в экспериментах, анализирующих реакцию опухоли, требует о?...

GIST является наиболее распространенной саркомой у людей с заболеваемостью около 6000 случаев в Соединенных Штатах Америки1. GIST, по-видимому, происходит из клеток желудочно-кишечного кардиостимулятора, называемых интерстициальными клетками Cajal, и обычно обусловлен одной мутацией в тирозинкиназе KIT или PDGFRA2. Хирургия является основой лечения GIST и может быть лечебной, но пациенты с прогрессирующим заболеванием могут лечиться ингибитором тирозинкиназы (TKI), иматинибом. С момента своего появления более 20 лет назад иматиниб трансформировал парадигму лечения в GIST, улучшив выживаемость при запущенном заболевании с 1 до более чем 5 лет 3,4,5. К сожалению, иматиниб редко излечивается из-за приобретенных мутаций KIT, поэтому для этой опухоли необходимы новые методы лечения.
Мышиные модели являются важным исследовательским инструментом в исследовании новых методов лечения рака. Несколько моделей подкожных ксенотрансплантатов и ксенотрансплантатов, полученных от пациента, были разработаны и исследованы в GIST 6,7. Тем не менее, иммунодефицитные мыши не в полной мере представляют GIST человека, поскольку GIST имеют дифференциальные иммунные профили в зависимости от их онкогенной мутации, а изменение микроокружения опухоли желудочно-кишечного тракта улучшает эффекты терапии TKI 8,9. Мышь KitV558Δ/+ имеет гетерозиготную делецию зародышевой линии в Kit exon 11, которая кодирует домен juxtamembrane, наиболее часто мутировавший сайт в человеческом GIST10. У мышей KitV558Δ/+ развивается один слепой GIST со 100% пенетранцией, а опухоли имеют аналогичную гистологию, молекулярную сигнализацию, иммунную инфильтрацию и ответ на терапию, как и человеческий GIST 8,11,12,13. Здесь мы описываем разведение, обработку, выделение и обработку образцов на мышах KitV558Δ/+ для использования в молекулярных и иммунологических исследованиях в GIST.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x RBC lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mL syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody (C67E7)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini edta free protease inhibitor</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C852A34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Exel International</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C756V81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dog1 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab64085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C788U23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 850 Homogenizer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imatinib mesylate</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT antibody (D13A2)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KitV558&#916;/+ Genotyping</td>
			<td>Transnetyx</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1620145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9121673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody (S473)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-KIT antibody (Y719)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proeinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP170050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes</td>
			<td>Falcon/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS buffer (10x)</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (100mm2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Falcon</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisHCL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1757500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;vivaCT 80 platform</td>
			<td>Scanco medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor

Стромальная опухоль желудочно-кишечного тракта (GIST) является наиболее распространенной саркомой человека и, как правило, обусловлена одной мутацией в рецепторе KIT. Для различных типов опухолей были разработаны многочисленные мышиные модели, чтобы исследовать следующее поколение методов лечения рака. Однако в GIST в большинстве исследований in vivo используются мышиные модели ксенотрансплантата, которые имеют присущие им ограничения. Здесь мы описываем иммунокомпетентную, генетически модифицированную мышиную модель стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта, содержащую мутацию KitV558Δ/+ . В этой модели мутантный KIT, онкоген, ответственный за большинство ГИСТ, управляется его эндогенным промотором, приводящим к GIST, который имитирует гистологический вид и иммунный инфильтрат, наблюдаемый в ГИСТ человека. Кроме того, эта модель была успешно использована для исследования как целевой молекулярной, так и иммунной терапии. Здесь мы описываем разведение и содержание колонии мышей KitV558Δ/+ . Кроме того, в этой статье подробно описывается лечение и закупка GIST, дренирование брыжеечного лимфатического узла и прилегающей слепой кишки у мышей KitV558Δ/+ , а также подготовка образцов для молекулярного и иммунологического анализа.

Модель мыши KitV558Δ/+ позволяет исследовать терапевтические средства в иммунокомпетентной мышиной модели. Мыши KitV558Δ/+ имеют среднюю продолжительность жизни 8 месяцев из-за прогрессирующей непроходимости кишечника (рисунок 4).. Опух?...

Watch this Scientific Journal Video about Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor at JoVE.com

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

Целью данной рукописи является описание мышиной модели KitV558Δ/+ и методов успешного вскрытия и обработки образцов мышей.

Молекулярные и иммунологические методы в генетически модифицированной мышиной модели стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

Наш протокол описывает разведение, поддержание, рассечение и обработку образцов единственной иммунокомпетентной мышиной модели, GIST, используемой в настоящее время. Мы надеемся, что будущие исследователи смогут использовать эту модель мыши для дальнейших трансляционных исследований в GIST. Традиционная терапия в GIST включает таргетную молекулярную терапию ингибиторами тирозинкиназы.Эта модель позволяет исследователям тестировать иммунотерапию в GIST. Для начала стерилизуйте все инструменты, носите перчатки на протяжении всей процедуры и поддерживайте стерильное поле. Подготовьте участок разреза с 70% этанолом.С помощью ножниц сделайте двухсантиметровый вертикальный разрез средней линии и войдите в брюшную полость. Резко лизируют любые внутрибрюшные спайки. Чтобы удалить дренирующий брыжеечный лимфатический узел, определите слепую кишку и поднимите ее брыжейку лучше.Примерно на полпути к основанию брыжейки толстой кишки определите брыжеечный лимфатический узел и резко рассекните его. По мере необходимости разделите ткань лимфатического узла на трети для выделения белка, гистологии и одноклеточной суспензии. Поместите ткань лимфатических узлов в 20 миллилитров среды RPMI для одноклеточных суспензий и держите на льду.Слепая кость в основном заменяется GIST у мышей Kit558. Для выделения ГИСТ и слепой кишки осторожно отделите илеоколическое соединение от основания опухоли. Затем снова разделите слепую кишку, на два сантиметра дистальнее основания опухоли.У 50-60% мышей Kit558 головка опухоли содержит колпачок ткани слепой кишки, который обычно содержит серозную жидкость, но редко может содержать гной. Резко рассекните ткань колпачка от опухолевой ткани. Разделите опухолевую ткань и слепую кишку на трети для выделения белка, гистологии и одноклеточной суспензии.Для одноклеточных суспензий поместите опухолевую ткань или слепую кишку в HBSS с 2% FCS, достаточным для покрытия образца, и держите на льду. Вылейте RPMI-среду с образцом лимфатического узла на 100-микрометровый фильтр. Переместите фильтр на новый 50-миллилитровый конический, и разомните лимфатический узел мягким концом трехмиллилитрового пластикового шприца.Промывочный фильтр с 20 миллилитрами rpmi среды. Центрифугируйте образцы и аспирируйте супернатант. Повторно суспендировать гранулу в 20 миллилитрах шарикового буфера и перелить на 40-микрометровый фильтр.Соберите фильтрат клеток. Подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометра. Центрифугируйте образцы и выбросьте супернатант.Затем повторно суспендировать в бусинчатом буфере для проточной цитометрии. Подготовьте буфер коллагеназы, как описано в тексте рукописи. Поместите GIST в стерильную посуду и добавьте 2,5 миллилитра коллагеназного буфера.Используя стерильный скальпель и ножницы, измельчите опухоль до тех пор, пока она не окажется в мелких фрагментах. Используйте пипетку с большим отверстием, чтобы аспирировать опухоль и коллагеназу в 50-миллилитровую трубку. Инкубируют его при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут со скоростью 100 оборотов в минуту, затем гасят реакцию двумя миллилитрами FBS.Налейте коллагеназу с образцом GIST на 100-микрометровый фильтр и разомните опухоль мягким концом трехмиллилитрового пластикового шприца и соберите в 50-миллилитровую трубку. Фильтр для промывки с 20 миллилитрами HBSS. Центрифугируйте фильтрат при 450 RCF в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, затем выбросьте супернатант.Повторно суспендировать гранулу в 20 миллилитрах шарикового буфера и перелить на 40-микрометровый фильтр Соберите фильтрат и подсчитайте ячейки с помощью гемоцитометра. Центрифугируют и аспирируют супернатант, затем повторно суспендируют в шариковый буфер для проточной цитометрии. С помощью ножниц расщелите слепую кишку продольно, чтобы обнажить внутреннюю слизистую оболочку.Разрежьте его на 0,5-сантиметровые срезы и поместите в 50-миллилитровую трубку с пятью миллилитрами HBSS и 2% FBS. Энергично встряхните в течение 30 секунд и центрифугируйте при 450 RCF в течение 20 секунд. Затем отбросьте супернатант.Добавьте от пяти до 20 миллилитров HBSS с двухмиллимолярной ЭДТА. Инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия при 100 оборотах в минуту в течение 15 минут. Центрифугируйте и выбросьте супернатант, затем повторно суспендируйте гранулу в пяти-20 миллилитрах HBSS.Энергично встряхните смесь в течение 30 секунд, затем центрифугируйте при 450 RCF в течение 20 секунд и выбросьте супернатант. Повторите этот процесс еще раз. Повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах коллагеназного буфера, затем инкубируйте ее при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут со скоростью 100 оборотов в минуту.Энергично встряхивайте каждые 10 минут и гасите реакцию двумя миллилитрами FBS. Налейте коллагеназу с образцом слепой кишки на 100-микрометровый фильтр и разомните мягким концом трехмиллилитрового пластикового шприца. Промыть фильтр 20 миллилитрами HBSS и собрать фильтрат.Центрифугируйте и выбросьте супернатант. Повторно суспендировать гранулу в 20 миллилитрах шарикового буфера и перелить на 40-микрометровый фильтр. Соберите фильтрат и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.Повторите процесс центрифугирования еще раз и повторно суспендируйте гранулу в шариковом буфере для проточной цитометрии. Мыши Kit558 имели среднюю продолжительность жизни восемь месяцев из-за прогрессирующей непроходимости кишечника. Опухоли у мышей Kit558 экспрессировали канонические маркеры GIST, включая тирозинкиназу KIT, трансмембранный канал Dog1 и транскрипционный фактор ETV1.Опухоли были изучены на предмет изменений в сигнальном пути KIT, таких как нисходящие маркеры ERK и AKT или иммунная микросреда, которая близко имитировала GIST человека. МРТ или КТ использовались для отслеживания объема опухоли в качестве точного измерения ответа опухоли. Рассечение опухоли от илеоколического соединения и от цекальной шапки важно для захвата истинного веса опухоли и иммунного и молекулярного анализа.В рамках GIST эта модель позволила исследовать микроокружение опухоли, а также иммунотерапию.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Имаджинальное Disc Опухоль Модель: Визуализация и Количественная экспрессии генов и опухолевой инвазии с использованием генетических Мозаики

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Colon-26 РАК-ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕЙ мышь в качестве модели для изучения рака кахексия

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Опухоль Модель и опухолевой мышиной цистопластики Система обнаружения

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Выделение циркулирующих опухолевых клеток в модели ортотопической мыши колоректального рака

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Генетически спроектированная мышь Модель спорадического колоректального рака

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Опухоль приживления в гранулы ксенотрансплантата мыши модель человека Мантия клеточная лимфома

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Utilizing High Resolution Ultrasound to Monitor Tumor Onset and Growth in Genetically Engineered Pancreatic Cancer Models

Использование УЗИ высоким разрешением монитор опухоль начала и роста в модели генно-инженерных рака поджелудочной железы

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

В vitro Создание генетически инженерии Murine головы и шеи рак овой линии с использованием Адено-ассоциированных Вирус-Cas9 системы

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Роман Стромальный Фибробласт-Модулированные 3D опухолевой сфероидной модели для изучения опухоли-Строма Взаимодействия и наркотиков Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Мышиная модель для исследования роли связанных с раком фибробластов в росте опухоли

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...