Name: molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor
Uploaded: 2022-05-02T15:00:00
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Los ratones KitV558Δ/+ fueron modificados genéticamente y compartidos por el Dr. Peter Besmer10. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01 CA102613 y T32 CA251063.

Todos los ratones fueron alojados en condiciones libres de patógenos en la Universidad de Pensilvania de acuerdo con las pautas de los NIH y con la aprobación de la Universidad de Pensilvania IACUC. La eutanasia se realizó siguiendo los procedimientos operativos estándar de Recursos Animales de Laboratorio de la Universidad de Pensilvania.
1. KitV558Δ / + cría de ratones
<ol><li>Retrocruce los ratones KitV558Δ/...

<ol>
	<li>Mastrangelo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+soft+tissue+sarcoma+and+beyond:+a+population-based+prospective+study+in+3+European+regions.">Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions.</a> Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).</li><li>Joensuu, H., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+management+of+gastrointestinal+stromal+tumors:+a+model+for+targeted+and+multidisciplinary+therapy+of+malignancy.">The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy.</a> Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).</li><li>Blanke, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+results+from+a+randomized+phase+II+trial+of+standard-+versus+higher-dose+imatinib+mesylate+for+patients+with+unresectable+or+metastatic+gastrointestinal+stromal+tumors+expressing+KIT.">Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).</li><li>Demetri, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+regorafenib+for+advanced+gastrointestinal+stromal+tumours+after+failure+of+imatinib+and+sunitinib+(GRID):+an+international,+multicentre,+randomised,+placebo-controlled,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial.</a> Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).</li><li>Gold, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+immune+profiles+distinguish+the+mutational+subtypes+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).</li><li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase.">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).</li><li>Cavnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIT+oncogene+inhibition+drives+intratumoral+macrophage+M2+polarization.">KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).</li><li>Medina, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+kinase+inhibition+limits+Batf3-dependent+dendritic+cell+development+and+antitumor+immunity.">Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).</li><li>Zhang, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+CD8(+)+T+cells+mediate+the+antitumor+efficacy+of+combined+CD40+ligation+and+imatinib+therapy+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).</li><li>. General Protocol for Western Blotting Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf</a> (2022)</li><li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+formalin-fixed,+paraffin+embedded+blocks.">Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 253-268 (2019).</li><li>Sy, J., Ang, L. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtomy:+Cutting+formalin-fixed,+paraffin-embedded+sections.">Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 269-278 (2019).</li><li>Seifert, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1/PD-L1+blockade+enhances+T-cell+activity+and+antitumor+efficacy+of+imatinib+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors.</a> Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+KIT+modulates+Type+I+IFN-mediated+antitumor+immunity+in+GIST.">Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST.</a> Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).</li><li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Kit+signaling+and+therapeutic+intervention+in+a+mouse+model+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).</li></ol>

El modelo de ratón KitV558Δ/+ es una poderosa herramienta de investigación en el análisis molecular e inmunológico de GIST. Aunque la estrategia de mejoramiento requiere un solo cruce, el uso de cohortes de ratones KitV558Δ / + en experimentos que analizan la respuesta tumoral requiere una reproducción extensa. Los ratones deben ser emparejados por edad y sexo para garantizar pesos tumorales similares, y el 10% de los ratones mueren antes de las 8 semanas de edad cuando se e...

GIST es el sarcoma más común en humanos con una incidencia de aproximadamente 6.000 casos en los Estados Unidos de América1. El GIST parece originarse en las células marcapasos gastrointestinales llamadas células intersticiales de Cajal, y generalmente es impulsado por una sola mutación en la tirosina quinasa KIT o PDGFRA2. La cirugía es el pilar del tratamiento para el GIST y puede ser curativa, pero los pacientes con enfermedad avanzada pueden ser tratados con el inhibidor de la tirosina cinasa (TKI), imatinib. Desde su introducción hace más de 20 años, imatinib ha transformado el paradigma de tratamiento en GIST, mejorando la supervivencia en enfermedad avanzada de 1 a más de 5 años 3,4,5. Desafortunadamente, imatinib rara vez es curativo debido a mutaciones KIT adquiridas, por lo que se necesitan nuevos tratamientos para este tumor.
Los modelos de ratón son una importante herramienta de investigación en la investigación de nuevas terapias en cáncer. Se han desarrollado e investigado múltiples modelos de xenoinjerto subcutáneo y xenoinjerto derivado del paciente en GIST 6,7. Sin embargo, los ratones inmunodeficientes no representan completamente el GIST humano, ya que los GIST albergan perfiles inmunes diferenciales dependiendo de su mutación oncogénica, y la alteración del microambiente tumoral gastrointestinal mejora los efectos de la terapia TKI 8,9. El ratón KitV558Δ/+ tiene una deleción heterocigota de la línea germinal en el exón Kit 11, que codifica el dominio yuxtamembrana, el sitio más comúnmente mutado en GIST10 humano. Los ratones KitV558Δ/+ desarrollan un GIST cecal único con penetrancia del 100%, y los tumores tienen histología, señalización molecular, infiltración inmune y respuesta a la terapia similares a GISThumanos 8,11,12,13. Aquí, describimos la cría, el tratamiento y el aislamiento y procesamiento de muestras en ratones KitV558Δ / + para su uso en investigación molecular e inmunológica en GIST.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x RBC lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mL syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody (C67E7)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini edta free protease inhibitor</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C852A34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Exel International</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C756V81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dog1 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab64085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C788U23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 850 Homogenizer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imatinib mesylate</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT antibody (D13A2)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KitV558&#916;/+ Genotyping</td>
			<td>Transnetyx</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1620145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9121673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody (S473)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-KIT antibody (Y719)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proeinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP170050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes</td>
			<td>Falcon/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS buffer (10x)</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (100mm2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Falcon</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisHCL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1757500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;vivaCT 80 platform</td>
			<td>Scanco medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor

El tumor del estroma gastrointestinal (GIST) es el sarcoma humano más común y generalmente es impulsado por una sola mutación en el receptor KIT. En todos los tipos de tumores, se han desarrollado numerosos modelos de ratón para investigar la próxima generación de terapias contra el cáncer. Sin embargo, en GIST, la mayoría de los estudios in vivo utilizan modelos de ratón de xenoinjerto que tienen limitaciones inherentes. Aquí, describimos un modelo de ratón inmunocompetente y genéticamente modificado de tumor del estroma gastrointestinal que alberga una mutación KitV558Δ / + . En este modelo, el KIT mutante, el oncogén responsable de la mayoría de los GIST, es impulsado por su promotor endógeno que conduce a un GIST que imita la apariencia histológica y el infiltrado inmune visto en los GIST humanos. Además, este modelo se ha utilizado con éxito para investigar tanto terapias moleculares como inmunes dirigidas. Aquí, describimos la cría y el mantenimiento de una colonia de ratones KitV558Δ / + . Además, este documento detalla el tratamiento y la obtención de GIST, el drenaje del ganglio linfático mesentérico y el ciego adyacente en ratones KitV558Δ / + , así como la preparación de muestras para análisis moleculares e inmunológicos.

El modelo de ratón KitV558Δ/+ permite la investigación terapéutica en un modelo de ratón inmunocompetente. Los ratones KitV558Δ/+ tienen una vida útil promedio de 8 meses debido a la obstrucción intestinal progresiva (Figura 4). Los tumores de ratones KitV558Δ/+ expresan marcadores canónicos de GIST incluyendo la tirosina quinasa KIT y el canal transmembrana DOG1 (<strong ...

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Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

El objetivo de este manuscrito es describir el modelo de ratón KitV558Δ/+ y las técnicas para la disección y el procesamiento exitosos de especímenes de ratón.

Técnicas moleculares e inmunológicas en un modelo de ratón genéticamente modificado de tumor del estroma gastrointestinal

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

Nuestro protocolo describe la reproducción, el mantenimiento, la disección y el procesamiento de muestras del único modelo de ratón inmunocompetente, GIST, actualmente en uso. Esperamos que los futuros investigadores puedan utilizar este modelo de ratón para promover la investigación traslacional en GIST. Las terapias tradicionales en GIST implican terapia molecular dirigida con inhibidores de la tirosina cinasa.Este modelo permite a los investigadores probar inmunoterapias en GIST. Para comenzar, esterilice todos los instrumentos, use guantes durante todo el procedimiento y mantenga un campo estéril. Prepare el área de incisión con etanol al 70%.Usando tijeras, haga una incisión vertical de dos centímetros en la línea media y entre en la cavidad abdominal. Lisa bruscamente cualquier adherencia intraabdominal. Para extirpar el ganglio linfático mesentérico drenante, identifique el ciego y levante su mesenterio de manera superior.Aproximadamente a mitad de camino a la base del mesenterio colónico, identifique el ganglio linfático mesentérico y diseccionarlo bruscamente. Según sea necesario, divida el tejido de los ganglios linfáticos en tercios para el aislamiento de proteínas, la histología y la suspensión de una sola célula. Coloque el tejido de los ganglios linfáticos en 20 mililitros de medio RPMI para suspensiones unicelulares y manténgalo en hielo.El ciego es reemplazado principalmente por un GIST en los ratones Kit558. Para el aislamiento del GIST y el ciego, divida cuidadosamente la unión ileocólica de la base del tumor. Luego, divida el ciego nuevamente, dos centímetros distales a la base del tumor.En el 50 al 60% de los ratones Kit558, la cabeza del tumor contiene una tapa de tejido cecal, que generalmente contiene líquido seroso, pero rara vez puede contener pus. Diseccionar bruscamente el tejido de la tapa lejos del tejido tumoral. Divida el tejido tumoral y el ciego en tercios para el aislamiento de proteínas, la histología y la suspensión unicelular.Para suspensiones unicelulares, coloque el tejido tumoral o el ciego en HBSS con 2% fcS, suficiente para cubrir la muestra, y manténgase en hielo. Vierta el medio RPMI con la muestra de ganglios linfáticos sobre un filtro de 100 micrómetros. Mueva el filtro a un nuevo cónico de 50 mililitros y triture el ganglio linfático con el extremo blando de una jeringa de plástico de tres mililitros.Filtro de lavado con 20 mililitros de medios RPMI. Centrifugar las muestras y aspirar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 20 mililitros de tampón de cuentas y verter sobre un filtro de 40 micrómetros.Recoger el filtrado celular. Cuente las células con un hemocitómetro. Centrifugar las muestras y desechar el sobrenadante.Luego, vuelva a suspender en el tampón de cuentas para citometría de flujo. Prepare el tampón de colagenasa como se describe en el manuscrito de texto. Coloque GIST en un plato estéril y agregue 2.5 mililitros de tampón de colagenasa.Usando un bisturí estéril y tijeras, picar el tumor hasta que esté en fragmentos finos. Use una pipeta de gran diámetro para aspirar el tumor y la colagenasa en un tubo de 50 mililitros. Incubarlo a 37 grados centígrados durante 30 minutos a 100 rotaciones por minuto, luego apagar la reacción con dos mililitros de FBS.Vierta la colagenasa con una muestra de GIST sobre un filtro de 100 micrómetros y triture el tumor con el extremo blando de una jeringa de plástico de tres mililitros y recójalo en un tubo de 50 mililitros. Filtro de lavado con 20 mililitros de HBSS. Centrifugar el filtrado a 450 RCF durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, luego desechar el sobrenadante.Resuspender el pellet en 20 mililitros de tampón de cuentas y verter sobre un filtro de 40 micrómetros Recoger el filtrado y contar las células utilizando un hemocitómetro. Centrifugue y aspire el sobrenadante, luego vuelva a suspender en tampón de cuentas para citometría de flujo. Usando tijeras, divida el ciego longitudinalmente para exponer la mucosa interna.Córtelo en secciones de 0,5 centímetros y colóquelo en un tubo de 50 mililitros con cinco mililitros de HBSS y 2% FBS. Agite vigorosamente durante 30 segundos y centrífuga a 450 RCF durante 20 segundos. Luego, deseche el sobrenadante.Agregue de cinco a 20 mililitros de HBSS con EDTA de dos milimolares. Incubarlo a 37 grados centígrados a 100 rotaciones por minuto durante 15 minutos. Centrifugar y desechar el sobrenadante, luego volver a suspender el pellet en cinco a 20 mililitros de HBSS.Agite la mezcla vigorosamente durante 30 segundos, luego centrífuga a 450 RCF durante 20 segundos y deseche el sobrenadante. Repita este proceso una vez más. Resuspender el pellet en cinco mililitros de tampón de colagenasa, luego incubarlo a 37 grados Celsius durante 30 minutos a 100 rotaciones por minuto.Agitar vigorosamente cada 10 minutos y saciar la reacción con dos mililitros de FBS. Vierta la colagenasa con una muestra de ciego sobre un filtro de 100 micrómetros y triture con el extremo blando de una jeringa de plástico de tres mililitros. Lave el filtro con 20 mililitros de HBSS y recoja el filtrado.Centrifuga y desecha el sobrenadante. Resuspender el pellet en 20 mililitros de tampón de cuentas y verter sobre un filtro de 40 micrómetros. Recolecte el filtrado y cuente las células usando un hemocitómetro.Repita el proceso de centrifugación una vez más y vuelva a suspender el pellet en tampón de cuentas para citometría de flujo. Los ratones Kit558 tuvieron una vida útil promedio de ocho meses debido a la obstrucción intestinal progresiva. Los tumores de los ratones Kit558 expresaron marcadores canónicos de GIST, incluyendo la tirosina quinasa KIT, el canal transmembrana Dog1 y el factor de transcripción ETV1.Los tumores se estudiaron para detectar cambios en la vía de señalización kit, como los marcadores aguas abajo ERK y AKT o el microambiente inmune, que imitaba de cerca el GIST humano. La resonancia magnética o la tomografía computarizada se utilizaron para rastrear el volumen del tumor como una medición precisa de la respuesta tumoral. La disección del tumor lejos de la unión ileocólica y lejos de la tapa cecal es importante para capturar el verdadero peso del tumor y el análisis inmunológico y molecular.Dentro de GIST, este modelo ha permitido la investigación del microambiente tumoral, así como de las inmunoterapias.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

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El Colon-26 Carcinoma portadores de tumores de ratón como modelo para el estudio del cáncer de caquexia

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Un Modelo de tumor y el tumor murino ortotópico de vejiga Sistema de Detección

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Aislamiento de células tumorales circulantes en un modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Un modelo de ratón de ingeniería genética de cáncer colorrectal esporádico

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Engraftment de tumor en un modelo de ratón de xenoinjerto de linfoma de manto humano

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Utilizing High Resolution Ultrasound to Monitor Tumor Onset and Growth in Genetically Engineered Pancreatic Cancer Models

Utilizando ultrasonido de alta resolución Monitor Tumor Inicio y crecimiento en modelos de cáncer pancreático genéticamente

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

In Vitro Establecimiento de una línea celular de cáncer de cabeza y cuello de murine genéticamente diseñada utilizando un sistema de virus Cas9 asociado con Adeno

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Un novedoso modelo de esferoides de tumor 3D modulado por fibroblastos para el estudio de la interacción tumor-Stroma y el descubrimiento de fármacos

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Un modelo de ratón para investigar el papel de los fibroblastos asociados al cáncer en el crecimiento tumoral

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...