Name: molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor
Uploaded: 2022-05-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor at JoVE.com

KitV558Δ /+ möss var genetiskt konstruerade och delades av Dr. Peter Besmer10. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag R01 CA102613 och T32 CA251063.

Alla möss inhystes under patogenfria förhållanden vid University of Pennsylvania enligt NIH-riktlinjer och med godkännande av University of Pennsylvania IACUC. Eutanasi utfördes enligt University of Pennsylvania Laboratory Animal Resources standardrutiner.
1. KitV558Δ/+ musavel
<ol><li>Backcross the KitV558Δ/+ möss mer än 10 gånger på en C57BL/6J-bakgrund med C57BL/6J-möss. För att göra detta,...

<ol>
	<li>Mastrangelo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+soft+tissue+sarcoma+and+beyond:+a+population-based+prospective+study+in+3+European+regions.">Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions.</a> Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).</li><li>Joensuu, H., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+management+of+gastrointestinal+stromal+tumors:+a+model+for+targeted+and+multidisciplinary+therapy+of+malignancy.">The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy.</a> Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).</li><li>Blanke, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+results+from+a+randomized+phase+II+trial+of+standard-+versus+higher-dose+imatinib+mesylate+for+patients+with+unresectable+or+metastatic+gastrointestinal+stromal+tumors+expressing+KIT.">Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).</li><li>Demetri, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+regorafenib+for+advanced+gastrointestinal+stromal+tumours+after+failure+of+imatinib+and+sunitinib+(GRID):+an+international,+multicentre,+randomised,+placebo-controlled,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial.</a> Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).</li><li>Gold, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcome+of+metastatic+GIST+in+the+era+before+tyrosine+kinase+inhibitors.">Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).</li><li>Huynh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib+induces+growth+suppression+in+mouse+models+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).</li><li>Na, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+xenografts+from+patients+with+gastrointestinal+stromal+tumors:+analysis+of+clinicopathological+characteristics+related+to+engraftment+success.">Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).</li><li>Balachandran, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+potentiates+antitumor+T+cell+responses+in+gastrointestinal+stromal+tumor+through+the+inhibition+of+Ido.">Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido.</a> Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).</li><li>Vitiello, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+immune+profiles+distinguish+the+mutational+subtypes+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).</li><li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase.">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).</li><li>Cavnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIT+oncogene+inhibition+drives+intratumoral+macrophage+M2+polarization.">KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).</li><li>Medina, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+kinase+inhibition+limits+Batf3-dependent+dendritic+cell+development+and+antitumor+immunity.">Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).</li><li>Zhang, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+CD8(+)+T+cells+mediate+the+antitumor+efficacy+of+combined+CD40+ligation+and+imatinib+therapy+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).</li><li>. General Protocol for Western Blotting Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf</a> (2022)</li><li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+formalin-fixed,+paraffin+embedded+blocks.">Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 253-268 (2019).</li><li>Sy, J., Ang, L. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtomy:+Cutting+formalin-fixed,+paraffin-embedded+sections.">Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections.</a> Biobanking: Methods and Protocols. , 269-278 (2019).</li><li>Seifert, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1/PD-L1+blockade+enhances+T-cell+activity+and+antitumor+efficacy+of+imatinib+in+gastrointestinal+stromal+tumors.">PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors.</a> Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+KIT+modulates+Type+I+IFN-mediated+antitumor+immunity+in+GIST.">Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST.</a> Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).</li><li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Kit+signaling+and+therapeutic+intervention+in+a+mouse+model+of+gastrointestinal+stromal+tumor.">Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).</li></ol>

KitV558Δ/+ musmodellen är ett kraftfullt forskningsverktyg inom molekylär och immunologisk analys av GIST. Även om avelsstrategin kräver ett enda kors, kräver användning av KitV558Δ / + muskohorter i experiment som analyserar tumörrespons omfattande avel. Möss bör ålders- och könsmatchas för att säkerställa liknande tumörvikter, och 10% av mössen dör före 8 veckors ålder när tumörer etableras. Mindre omfattande avelsstrategier är möjliga om man använder av...

GIST är den vanligaste sarkom hos människor med en förekomst av cirka 6 000 fall i USA1. GIST verkar härstamma från de gastrointestinala pacemakercellerna som heter de interstitiella cellerna i Cajal, och drivs vanligtvis av en enda mutation i tyrosinkinasen KIT eller PDGFRA2. Kirurgi är grundpelaren i behandlingen av GIST och kan vara botande, men patienter med avancerad sjukdom kan behandlas med tyrosinkinashämmaren (TKI), imatinib. Sedan introduktionen för över 20 år sedan har imatinib förändrat behandlingsparadigmet inom GIST och förbättrat överlevnaden vid avancerad sjukdom från 1 till över 5 år 3,4,5. Tyvärr är imatinib sällan botande på grund av förvärvade KIT-mutationer, så nya behandlingar behövs för denna tumör.
Musmodeller är ett viktigt forskningsverktyg i undersökningen av nya terapier vid cancer. Flera subkutana xenograft- och patientbaserade xenograftmodeller har utvecklats och undersökts i GIST 6,7. Immunbristmöss representerar emellertid inte helt human GIST eftersom GIST har differentiella immunprofiler beroende på deras onkogena mutation, och förändring av den gastrointestinala tumörmikromiljön förbättrar effekterna av TKI-terapi 8,9. KitV558Δ /+ -musen har en heterozygot bakterieradering i Kit exon 11, som kodar för juxtamembrandomänen, den vanligaste muterade platsen i mänsklig GIST10. KitV558Δ / + möss utvecklar en enda cecal GIST med 100% penetrans, och tumörer har liknande histologi, molekylär signalering, immuninfiltration och svar på terapi som human GIST 8,11,12,13. Här beskriver vi avel, behandling och provisolering och bearbetning i KitV558Δ /+ möss för användning i molekylär och immunologisk forskning inom GIST.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x RBC lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mL syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 micron filter</td>
			<td>EMSCO</td>
			<td>1194-2350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody (C67E7)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini edta free protease inhibitor</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C852A34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Exel International</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C756V81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dog1 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab64085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C788U23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 850 Homogenizer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imatinib mesylate</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT antibody (D13A2)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KitV558&#916;/+ Genotyping</td>
			<td>Transnetyx</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1620145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9121673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody (S473)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-ERK antibody (p44/42)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-KIT antibody (Y719)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proeinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP170050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes</td>
			<td>Falcon/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS buffer (10x)</td>
			<td>University of Pennsylvania Cell Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (100mm2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Falcon</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisHCL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1757500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Rio-Rad</td>
			<td>1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;vivaCT 80 platform</td>
			<td>Scanco medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular and immunologic techniques in a genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor

Gastrointestinal stromal tumör (GIST) är den vanligaste humana sarkom och drivs vanligtvis av en enda mutation i KIT-receptorn. Över tumörtyper har många musmodeller utvecklats för att undersöka nästa generations cancerterapier. Men i GIST använder de flesta in vivo-studier xenograftmusmodeller som har inneboende begränsningar. Här beskriver vi en immunkompetent, genetiskt konstruerad musmodell av gastrointestinal stromal tumör som hyser en KitV558Δ/+ mutation. I denna modell drivs mutant KIT, onkogenen som är ansvarig för de flesta GIST, av sin endogena promotor som leder till en GIST som efterliknar det histologiska utseendet och immuninfiltrat som ses i mänskliga GIST. Dessutom har denna modell använts framgångsrikt för att undersöka både riktade molekylära och immunterapier. Här beskriver vi avel och underhåll av en KitV558Δ/+ muskoloni. Dessutom beskriver detta dokument behandling och upphandling av GIST, dränering av mesenterisk lymfkörtel och intilliggande cecum i KitV558Δ / + -möss, samt provberedning för molekylära och immunologiska analyser.

KitV558Δ/+ musmodellen möjliggör undersökning av terapier i en immunkompetent musmodell. KitV558Δ /+ möss har en genomsnittlig livslängd på 8 månader på grund av progressiv tarmobstruktion (figur 4). Tumörer från KitV558Δ/+ möss uttrycker kanoniska markörer för GIST inklusive tyrosinkinas KIT och transmembrankanalen DOG1 (figur 5...

Watch this Scientific Journal Video about Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor at JoVE.com

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

Målet med detta manuskript är att beskriva KitV558Δ/+ musmodellen och tekniker för framgångsrik dissektion och bearbetning av musprover.

Molekylära och immunologiska tekniker i en genetiskt konstruerad musmodell av gastrointestinal stromal tumör

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

Vårt protokoll beskriver avel, underhåll, dissektion och provbehandling av den enda immunkompetenta musmodellen, GIST, som för närvarande används. Vi hoppas att framtida forskare kommer att kunna använda denna musmodell för att främja translationell forskning inom GIST. Traditionella terapier inom GIST involverar riktad molekylär terapi med tyrosinkinashämmare.Denna modell gör det möjligt för forskare att testa immunterapier i GIST. Börja med att sterilisera alla instrument, bära handskar under hela proceduren och upprätthålla ett sterilt fält. Förbered snittområdet med 70% etanol.Använd sax, gör ett två centimeter mittlinje vertikalt snitt och gå in i bukhålan. Lysa kraftigt eventuella intra-abdominala vidhäftningar. För att ta bort den dränerande mesenteriska lymfkörteln, identifiera cecum och lyft dess mesenteri överlägset.Ungefär halvvägs till basen av kolonmesenteriet, identifiera den mesenteriska lymfkörteln och dissekera den kraftigt. Dela lymfkörtelvävnad vid behov i tredjedelar för proteinisolering, histologi och encellssuspension. Placera lymfkörtelvävnad i 20 ml RPMI-medium för encellssuspensioner och håll på is.Cecum ersätts mestadels av en GIST i Kit558-mössen. För isolering av GIST och cecum, dela försiktigt den ileokoliska korsningen från tumörens bas. Dela sedan cecum igen, två centimeter distal till tumörens bas.Hos 50 till 60% av Kit558-mössen innehåller tumörhuvudet ett lock av cekal vävnad, som vanligtvis innehåller serös vätska, men kan sällan innehålla pus. Dissekera kraftigt lockvävnaden bort från tumörvävnaden. Dela tumörvävnaden och cecum i tredjedelar för proteinisolering, histologi och encellssuspension.För encellssuspensioner, placera tumörvävnad eller cecum i HBSS med 2% FCS, tillräckligt för att täcka provet och hålla på is. Häll RPMI-media med lymfkörtelprovet över ett 100-mikrometer filter. Flytta filtret till en ny 50-milliliter konisk och mosa lymfkörteln med den mjuka änden av en tre milliliter plastspruta.Tvätta filtret med 20 ml RPMI-media. Centrifugera proverna och aspirera supernatanten. Resuspend pelleten i 20 ml pärlbuffert och häll över ett 40-mikrometer filter.Samla cellfiltrat. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer. Centrifugera proverna och kassera supernatanten.Resuspendera sedan i pärlbuffert för flödescytometri. Förbered kollagenasbufferten enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Placera GIST i en steril skål och tillsätt 2,5 ml kollagenasbuffert.Använd en steril skalpell och sax och haka tumören tills den är i fina fragment. Använd en pipett med stor borrning för att aspirera tumören och kollagenaset i ett 50-milliliter rör. Inkubera den vid 37 grader Celsius i 30 minuter vid 100 rotationer per minut och släck sedan reaktionen med två milliliter FBS.Häll kollagenas med GIST-prov över ett 100-mikrometerfilter och mosa tumören med den mjuka änden av en tre milliliter plastspruta och samla i ett 50-milliliter rör. Tvätta filtret med 20 ml HBSS. Centrifugera filtratet vid 450 RCF i fem minuter vid fyra grader Celsius och kassera sedan supernatanten.Resuspend pelleten i 20 ml pärlbuffert och häll över ett 40-mikrometer filter Samla filtratet och räkna celler med hjälp av en hemocytometer. Centrifugera och aspirera supernatanten och återsuspendera sedan i pärlbuffert för flödescytometri. Använd sax och dela cecum i längdriktningen för att exponera den inre slemhinnan.Skär den i 0,5 centimeter sektioner och placera den i ett 50-milliliter rör med fem milliliter HBSS och 2% FBS. Skaka kraftigt i 30 sekunder och centrifugera vid 450 RCF i 20 sekunder. Kassera sedan supernatanten.Tillsätt fem till 20 ml HBSS med två millimolär EDTA. Inkubera den vid 37 grader Celsius vid 100 rotationer per minut i 15 minuter. Centrifugera och kassera supernatanten och återsuspendera sedan pelleten i fem till 20 ml HBSS.Skaka blandningen kraftigt i 30 sekunder, centrifugera sedan vid 450 RCF i 20 sekunder och kassera supernatanten. Upprepa denna process en gång till. Resuspendera pelleten i fem milliliter kollagenasbuffert och inkubera den sedan vid 37 grader Celsius i 30 minuter vid 100 rotationer per minut.Skaka kraftigt var 10: e minut och släck reaktionen med två milliliter FBS. Häll kollagenas med cecumprov över ett 100-mikrometer filter och mosa med den mjuka änden av en tre milliliter plastspruta. Tvätta filtret med 20 ml HBSS och samla filtratet.Centrifugera och kassera supernatanten. Resuspend pelleten i 20 ml pärlbuffert och häll över ett 40-mikrometer filter. Samla filtrat och räkna celler med hjälp av en hemocytometer.Upprepa centrifugeringsprocessen en gång till och återsuspendera pelleten i pärlbuffert för flödescytometri. Kit558-mössen hade en genomsnittlig livslängd på åtta månader på grund av progressiv tarmobstruktion. Tumörer från Kit558-mössen uttryckte kanoniska markörer för GIST, inklusive tyrosinkinas KIT, transmembrankanalen Dog1 och transkriptionsfaktorn ETV1.Tumörer studerades för förändringar i KIT-signalvägen, såsom nedströmsmarkörerna ERK och AKT eller immunmikromiljö, som nära efterliknade human GIST. MR eller CT användes för att spåra tumörvolymen som en noggrann mätning av tumörsvaret. Att dissekera tumören bort från den ileokoliska korsningen och bort från cecallocket är viktigt för att fånga sann tumörvikt och immun- och molekylär analys.Inom GIST har denna modell möjliggjort undersökning av tumörmikromiljön, liksom immunterapier.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal skiva Tumör Modell: Visualisering och kvantifiering av genuttryck och tumör invasiv använda genetiska mosaiker

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Colon-26 karcinom tumörbärande mus som en modell för studier av cancerkakexi

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

En Murin Orthotopic blåstumör modell och Tumör Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolering av cirkulerande tumörceller i en ortotopisk musmodell av kolorektal cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

En genetiskt konstruerad musmodell av sporadisk kolorektal cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Tumör Engraftment i en Xenograft musmodell av mänskliga mantelcellslymfom

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Utilizing High Resolution Ultrasound to Monitor Tumor Onset and Growth in Genetically Engineered Pancreatic Cancer Models

Utnyttja högupplöst ultraljud för att övervaka tumör uppkomsten och tillväxten i genmanipulerade pankreascancer modeller

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

In vitro inrättande av en genetiskt modifierad murin huvud och hals cancer cellinjer med ett Adeno-associerat virus-Cas9 system

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

En ny Stromal Fibroblast-Modulerad 3D Tumör Spheroid modell för att studera tumör-Stroma interaktion och drug discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

En musmodell för att undersöka rollen av cancerassocierade fibroblaster i tumörtillväxt

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...