Name: ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells at JoVE.com

تم دعم هذا العمل البحثي جزئيا من قبل NIH Grants و K08CA252161 (Q.L.) و R01CA234162 و R01 CA207757 (D.W.G.) و P30CA016056 (منحة الدعم الأساسية لمركز NCI للسرطان) ومؤسسة روزويل بارك ألاينس ومؤسسة أصدقاء المسالك البولية. نشكر ماريسا بلاسك وميلا باكهوموفا على التدقيق اللغوي للمخطوطة.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في مركز روزويل بارك الشامل للسرطان ، بوفالو ، نيويورك (1395M ، 180501 السلامة البيولوجية 180502). ملاحظة: تنفيذ الخطوات من 1 إلى 3 في نفس اليوم.
1. تشريح المثانة الفأر
<ol><li>الت?...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2021.">Cancer statistics, 2021.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+bladder+cancer+research.">Preclinical models for bladder cancer research.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).</li><li>DeGraff, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+preclinical+models+for+the+advancement+of+translational+bladder+cancer+research.">Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).</li><li>Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+treatment+landscape+of+advanced+urothelial+carcinoma.">The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma.</a> Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).</li><li>Mullenders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+human+urothelial+cancer+organoids:+A+tool+for+bladder+cancer+research.">Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).</li><li>Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+bladder+cancer+in+mice:+opportunities+and+challenges.">Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).</li><li>Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mouse+models+in+oncology+research+and+cancer+medicine.">Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Fujii, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+histopathological+evaluation+of+organoids.">A simple method for histopathological evaluation of organoids.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).</li><li>Georgas, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+illustrated+anatomical+ontology+of+the+developing+mouse+lower+urogenital+tract.">An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract.</a> Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).</li><li>Santos, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+organoids+originating+from+Cd49f(high)+mouse+stem+cells+display+Notch-dependent+differentiation+capacity.">Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity.</a> Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+defined+disease+model+reveals+that+urothelial+cells+can+initiate+divergent+bladder+cancer+phenotypes.">A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intertumoral+heterogeneity+in+SCLC+is+influenced+by+the+cell+type+of+origin.">Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin.</a> Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).</li><li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer:+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung.">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li><li>Bottger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+heterogeneity+underlies+differential+cisplatin+sensitivity+in+mouse+models+of+small-cell+lung+cancer.">Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer.</a> Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).</li><li>Puzio-Kuter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+p53+and+Pten+promotes+invasive+bladder+cancer.">Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer.</a> Genes &amp; Development. 23 (6), 675-680 (2009).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mouse+models+of+bladder+cancer+identify+a+prognostic+signature+associated+with+risk+of+disease+progression.">Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression.</a> Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).</li><li>Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+genetic+removal+of+signaling+molecules+in+cultured+primary+mouse+embryonic+fibroblasts.">Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).</li><li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+interrogation+of+cancer+cell+of+origin+through+CRISPR+editing.">Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).</li></ol>

كانت GEMMs هي المعايير الذهبية لنمذجة السرطان التي بدأت من الخلايا الطبيعية ، مما يسمح باختبار عواقب الاضطرابات السرطانية المحتملة (تنشيط الجينات الورمية و / أو فقدان مثبطات الورم) بدقة. هنا ، يتم توفير بروتوكول سريع وفعال لتوليد عضويات سرطان المثانة عن طريق تحرير الجينات خارج الجسم الحي</...

سرطان المثانة هو رابع أكثر أنواع السرطان شيوعا لدى الرجال ويصيب أكثر من 80000 شخص سنويا في الولايات المتحدة1. كان العلاج الكيميائي القائم على البلاتين هو معيار الرعاية للمرضى الذين يعانون من سرطان المثانة المتقدم لأكثر من ثلاثة عقود. لقد تم إحداث ثورة في مشهد علاج سرطان المثانة من خلال الموافقة الأخيرة لإدارة الغذاء والدواء (FDA) على العلاج المناعي (مثبطات نقاط التفتيش المناعية المضادة ل PD-1 و PD-L1) ، و erdafitinib (مثبط مستقبلات عامل نمو الخلايا الليفية) و enfortumab vedotin (اقتران الأجسام المضادة والأدوية) 2،3،4. ومع ذلك، لا تتوفر مؤشرات حيوية معتمدة سريريا للتنبؤ بالاستجابات للعلاج الكيميائي أو العلاج المناعي. هناك حاجة ماسة إلى إنشاء نماذج ما قبل السريرية غنية بالمعلومات يمكنها تحسين فهم الآليات التي تدفع تطور سرطان المثانة وتطوير مؤشرات حيوية تنبؤية لطرق العلاج المختلفة.
تتمثل إحدى العقبات الرئيسية في الأبحاث الانتقالية للمثانة في عدم وجود نماذج ما قبل السريرية تلخص التسبب في سرطان المثانة البشري واستجابات العلاج 5,6. تم تطوير نماذج متعددة قبل السريرية ، بما في ذلك نماذج 2D في المختبر (خطوط الخلايا أو الخلايا المعاد برمجتها بشكل مشروط) ، في نماذج 3D المختبرية (المواد العضوية ، الطباعة ثلاثية الأبعاد) ، وفي نماذج الجسم الحي (xenograft ، النماذج المستحثة بالمواد المسرطنة ، المهندسة وراثيا ، و xenograft المشتقة من المريض) 2,6. تعد نماذج الفئران المهندسة وراثيا (GEMMs) مفيدة للعديد من التطبيقات في بيولوجيا سرطان المثانة ، بما في ذلك تحليلات الأنماط الظاهرية للورم ، والتحقيقات الميكانيكية للجينات المرشحة و / أو مسارات الإشارات ، والتقييم قبل السريري للاستجابات العلاجية 6,7. يمكن ل GEMMs استخدام المؤتلفات الخاصة بالموقع (Cre-loxP) للتحكم في الحذف الجيني في واحد أو أكثر من الجينات المثبطة للورم. عملية توليد GEMMs المطلوبة مع حذف الجينات المتعددة تستغرق وقتا طويلا وشاقة ومكلفة5. الهدف العام من هذه الطريقة هو تطوير طريقة سريعة وفعالة لتسليم Cre خارج الجسم الحي لإنشاء نماذج خروج المغلوب الثلاثي للمثانة (TKO) من الخلايا البولية العادية للفأر التي تحمل أليلات ثلاثية مفعول (Trp53 و Pten و Rb1)8. الميزة الرئيسية لطريقة ex vivo هي سير العمل السريع (1-2 أسابيع بدلا من سنوات من تربية الماوس). توضح هذه المقالة بروتوكول حصاد الخلايا البولية الطبيعية مع الأليلات المفلطحة، ونقل الفيروس الغدي خارج الجسم الحي، والثقافات العضوية، والتوصيف في المختبر وفي الجسم الحي في الفئران C57 BL/6J المناعية. يمكن استخدام هذه الطريقة بشكل أكبر لتوليد عضويات سرطان المثانة ذات الصلة سريريا في الفئران ذات الكفاءة المناعية التي تؤوي أي مزيج من الأليلات المفلطحة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#956;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 1.5 inches needle</td>
			<td>EXELINT International</td>
			<td>26406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)</td>
			<td>UI Viral Vector Core</td>
			<td>VVC-U of Iowa-5-HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57 BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal-stripped FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine substitute (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mammary Epithelial Cell Growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix extracts from Engelbreth&#8211;Holm&#8211;Swarm mouse sarcomas (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M7019</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK7</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-23876</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab735</td>
			<td>IHC 1:100, IF 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Upk3</td>
			<td>Fitzgerald</td>
			<td>10R-U103A</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Vimentin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-6260</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal rat anti-CK8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-s</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell vios 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51033557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal chicken anti-CK5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td>IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signature benchtop shaking incubator Model 1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td>35962-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Processing Gel (HistoGel)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade size 10</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall T1 centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells

سرطان المثانة هو مجال غير مدروس ، خاصة في نماذج الفئران المهندسة وراثيا (GEMMs). كانت GEMMs المولودة مع مواقع Cre و loxP الخاصة بالأنسجة هي المعايير الذهبية لاستهداف الجينات المشروطة أو المستحثة. لتوفير نماذج تجريبية أسرع وأكثر كفاءة ، تم تطوير نظام زراعة عضوي خارج الجسم الحي باستخدام الفيروس الغدي Cre والخلايا البولية الطبيعية التي تحمل أليلات loxP متعددة من مثبطات الورم Trp53 و Pten و Rb1. يتم فصل الخلايا البولية الطبيعية إنزيميا عن أربع مثانات من الفئران الثلاثية المفلطحة (Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f/f). يتم نقل الخلايا البولية خارج الجسم الحي مع الفيروس الغدي-Cre مدفوعا بمروج CMV (Ad5CMVCre). يتم استزراع عضويات المثانة المحولة ونشرها وتمييزها في المختبر وفي الجسم الحي. يستخدم PCR لتأكيد حذف الجينات في Trp53 و Pten و Rb1. يوضح تلطيخ التألق المناعي (IF) للعضويات تعبيرا إيجابيا عن علامات النسب البولي (CK5 و p63). يتم حقن المواد العضوية تحت الجلد في الفئران المضيفة لتوسيع الورم والممرات التسلسلية. تظهر الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) ل xenografts تعبيرا إيجابيا عن CK7 و CK5 و p63 وتعبيرا سلبيا عن CK8 و Uroplakin 3. باختصار ، يعد حذف الجينات بوساطة الفيروس الغدي من الخلايا البولية اللولبية للفئران المصممة بمواقع loxP طريقة فعالة لاختبار الإمكانات السرطانية للتغيرات الجينية المحددة بسرعة.

يظهر سير عمل عمليات حذف الجينات بوساطة الفيروس الغدي-Cre في الخلايا البولية الثيلية للفئران في الشكل 1A. يوضح الفيديو المصاحب كيفية انفصال الخلايا البولية عن قاع المثانة وكيف يتم نقل الخلايا الثلاثية المفلطحة خارج الجسم الحي باستخدام Ad5CMVCre. أظهر الشكل 1A...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells at JoVE.com

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

يصف هذا البروتوكول عملية توليد وتوصيف المواد العضوية البولية الفئران التي تؤوي عمليات حذف في الجينات ذات الاهتمام. وتشمل الطرق حصاد الخلايا البولية الثيلية للفئران ، والنقل خارج الجسم الحي مع الفيروس الغدي الذي يقود تعبير Cre مع مروج CMV ، وفي المختبر وكذلك في توصيف الجسم الحي .

السابقين فيفو النموذج العضوي لحذف الجينات بوساطة الفيروس الغدي-Cre في خلايا الفأر البولية

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

لقد طورنا بروتوكولا سريعا وفعالا لتوليد عضويات سرطان المثانة عن طريق تحرير الجينات خارج الجسم الحي للخلايا البولية الطبيعية للفئران التي تحمل أليلات مفلطخة في الجينات ذات الاهتمام. هذه الطريقة خارج الجسم الحي لديها سير عمل لمدة أسبوع إلى أسبوعين بدلا من سنوات من تربية الفئران ، وهي فعالة للغاية في نقل الفيروس الغدي على عمليات حذف الجينات بوساطة Cre. للبدء ، قم بإعداد جميع الأدوات والكواشف المعقمة ، بما في ذلك المقص والملقط و DPBS في أطباق استزراع 35 ملليلتر والإيثانول 70٪ والشاش والمناشف الورقية النظيفة.بعد ذلك ، قم بتنظيف جميع أسطح منطقة التشريح وقم بتغطية منطقة التشريح بمنشفة ورقية نظيفة. ضع الفأر الرحيم على الشاش في منطقة التشريح ورش 70٪ من الإيثانول على بطن الفأر ، ثم باستخدام مقص تشريح معقم ، قم بعمل شق أسفل خط الوسط في البطن لفضح المثانة. الآن ، استخدم الملقط للإمساك بالمثانة وسحبها بلطف لتحديد التقاطع الحالبي الثنائي.باستخدام المقص ، قم بإزالة قاع المثانة ، باتباع الخط الفاصل بين فتحتي الحالب ونقل المثانة إلى طبق معقم يحتوي على 2 ملليلتر من DPBS ، ثم قم بإزالة النسيج الدهني والضام ووضع المثانة في طبق جديد يحتوي على 2 ملليلتر من DPBS. قم أيضا بإزالة الفيروس الغدي من التخزين الذي تبلغ درجة حرارته 80 درجة مئوية تحت الصفر واحتفظ به على الجليد. لتفكك الخلايا ، قم بإعداد جميع الأدوات والكواشف المعقمة كما هو موضح في المخطوطة ، ثم في خزانة السلامة البيولوجية ، ونقل المثانة إلى طبق 35 ملم وغسلها ب 2 ملليلتر من DPBS المعقمة.اجمع أنسجة المثانة من أربعة فئران في طبق مع ملليلتر واحد من وسط الثقافة الكامل دون FBS المجردة من الفحم. بعد ذلك ، باستخدام شفرة جراحية ، قم بتقطيع كل مثانة إلى أربع قطع متساوية ، ثم باستخدام الملقط ، قم بفتح المثانة لتعريض سطح اليوروثيليوم إلى الوسط. انقل قطع المثانة والمتوسطة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر.اغسل الطبق مرتين ب 2 ملليلتر من وسط الثقافة الكامل بدون FBS المجردة من الفحم وأضف الغسيل إلى أنبوب جهاز الطرد المركزي ، ليصل الحجم الإجمالي إلى 5 ملليلتر. بعد ذلك ، أضف خليط الكولاجيناز والهيالورونيداز وضع الأنبوب أفقيا في حاضنة اهتزاز مدارية 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة عند 200 دورة في الدقيقة. بعد هضم الأنسجة، أضف حجما متساويا بنسبة 10٪ من FBS و DPBS المجردين من الفحم إلى الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي عند 200 مرة من الغرام لمدة 5 دقائق.بعد التخلص من السوبر ناتانت ، أضف 2 ملليلتر من بديل التربسين إلى حبيبة الخلية واخلطها جيدا ، ثم احتضن الأنبوب عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 4 دقائق. بعد الحضانة ، قم بماصة الخلايا لأعلى ولأسفل 10 مرات باستخدام طرف P1000 قياسي وإضافة 5 ملليلتر من FBS و DPBS المجردين من الفحم بنسبة 10٪. قم بتصفية الخلايا المنفصلة من خلال مصفاة خلايا معقمة بسعة 100 ميكرومتر وجمع تعليق الخلية في أنبوب سعة 50 ملليلتر.انقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 200 مرة غرام لمدة 5 دقائق. بعد إزالة supernatant ، أعد تعليق الكريات في 1 ملليلتر من وسط الثقافة الكامل. عد عدد الخلايا باستخدام مقياس الدم والصفيحة 0.5 في 10 إلى الخلايا السادسة في كل بئر من صفيحة 24 بئرا مع 0.5 ملليلتر من وسط الثقافة الكامل الطازج.بعد ذلك ، أخرج مقتطفات المصفوفة من خلايا ساركوما الفئران Engelbreth-Holm-Swarm من تخزين 20 درجة مئوية تحت الصفر وقم بإذابتها على الجليد. أيضا ، قم بتسخين صفيحة من 6 آبار في حاضنة خلايا 37 درجة مئوية. لنقل الفيروس الغدي ، أضف 2 ميكرولتر من الفيروس الغدي إلى لوحة 24 بئرا واخلطها جيدا مع الخلايا البولية المنفصلة .لتعزيز فعالية النقل ، قم بإجراء الدوران عن طريق الطرد المركزي للصفيحة عند 300 مرة غرام لمدة 30 دقيقة ، ثم احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 1 ساعة. انقل الخلايا والمتوسطة من البئر إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 200 مرة جم لمدة 5 دقائق. بعد التخلص من supernatant ، أضف 50 ميكرولتر من وسط الثقافة الكامل واخلطه جيدا مع الخلايا الموجودة في الأسفل.بعد ذلك ، أضف 140 ميكرولتر من مستخلص المصفوفة واخلطها جيدا بلطف لتجنب فقاعات الهواء ، ثم قم بإنشاء قباب للعضويات عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من المحلول بسرعة لكل قبة إلى لوحة 6 بئر المحمومة مسبقا. احتضن اللوحة واسمح للقباب بالتصلب لمدة 5 دقائق. بعد 5 دقائق ، اقلب اللوحة المكونة من 6 آبار رأسا على عقب واستمر في التصلب لمدة 25 دقيقة إضافية.بعد الحضانة ، أضف 2.5 ملليلتر من وسط الثقافة الكامل إلى كل بئر وضع اللوحة في حاضنة للثقافة العضوية. تم اكتشاف بروتين الفلورسنت الأخضر في ما يقرب من 100٪ من الخلايا ، مما يشير إلى كفاءة عالية لنقل الفيروس الغدي. أظهر تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين والكيمياء النسيجية المناعية للأورام العضوية الثلاثية بالضربة القاضية مورفولوجيا سرطان الظهارة البولية عالي الجودة مع تعبير بروتين إيجابي عن علامات النوع الفرعي القاعدي ل CK5 و p63.تم الكشف عن الأليلات المفلطحة غير المعاد تجميعها في الخلايا البولية ، غير المعالجة بالفيروس الغدي ، في حين لوحظت الأليلات المعاد تجميعها في الضربات العضوية الثلاثية القاضية. بشكل عام ، كانت هناك حاجة إلى 2 إلى 3 أسابيع لتشكيل ورم تحت الجلد طوله 2 سم. أظهرت الكيمياء النسيجية المناعية للعضويات الثلاثية بالضربة القاضية ، في xenografts في الجسم الحي ، تعبيرا إيجابيا عن بروتينات CK7 و CK5 و p63.تم الكشف عن التعبير السلبي لبروتينات CK8 و uroplakin. تم الكشف عن علامة اللحمة المتوسطة ، vimentin ، فقط في كبسولة الورم أو السدى. يجب ألا يتجاوز تفكك المثانة الفأر 30 دقيقة.قد يزيد وقت التفكك الأطول في النسبة المئوية للخلايا السدى ، مثل الخلايا البطانية والخلايا الليفية يمكن دمج هذا النهج مع فرز الخلايا أو نوع الخلية فيروس غدي معين لتوليد نوع الخلية من المواد العضوية المحددة ، مثل التجويف مقابل المواد العضوية القاعدية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ال<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تخيلي ورم القرص نموذج: التصور والكمي للالتعبير الجيني وغزو الورم عن طريق الفسيفساء الوراثية

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

عزل الخلايا السرطانية المتداولة في نموذج الفأر المثلي لسرطان القولون والمستقيم

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

في فيفو تقييم الجيش الشعبي الثوري لدرجة الحموضة، فس2، حالة الأكسدة والاختزال، وتركيزات الفوسفات والجلوتاثيون في "ورم المكروية"

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

نموذج ماوس الإكلينيكية من أوستيوساركوما لتعريف الاتصال خارج الخلية حويصلة بوساطة بين الورم والخلايا الجذعية الوسيطة

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

باراميكسوفيروسيس لاستهداف الورم المرباة: التصميم والتقييم السابقين فيفو

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

نموذج المصفوفة خارج الخلية العظام ثلاثية الأبعاد ل Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

تقييم قدره التمايز من الخلايا الظهاريه البروستاتا الماوس باستخدام الثقافة Organoid

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

نموذج شريحة الدماغ خارج الجسم الحي لدراسة واستهداف سرطان الثدي نمو الورم النقيلي في الدماغ

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

تحديد وظائف الجينات في تكوين الأورام عن طريق الاستئصال خارج الجسم الحي للأليلات المفلطحة في الخلايا السرطانية الخبيثة للغمد العصبي المحيطي

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

الحفاظ على التنوع الخلوي للورم الأرومي الدبقي البشري خارج الجسم الحي باستخدام ثقافة العضوية ثلاثية الأبعاد

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...