Name: ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells at JoVE.com

Dette forskningsarbejde blev delvist støttet af NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 og R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation og Friends of Urology Foundation. Vi takker Marisa Blask og Mila Pakhomova for korrekturlæsning af manuskriptet.

Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY (1395M, Biosafety 180501 and 180502). BEMÆRK: Udfør trin 1-3 samme dag.
1. Dissektion af museblære
<ol><li>Forberedelse til dissektion<ol>
<li>Forbered alle de sterile instrumenter, herunder saks, tang, steril DPBS i 35 mm kulturskåle, 70% ethanol, sterilt gasbind og rene papirhåndklæder. Rengør alle overflader af dissektio...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2021.">Cancer statistics, 2021.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+bladder+cancer+research.">Preclinical models for bladder cancer research.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).</li><li>DeGraff, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+preclinical+models+for+the+advancement+of+translational+bladder+cancer+research.">Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).</li><li>Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+treatment+landscape+of+advanced+urothelial+carcinoma.">The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma.</a> Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).</li><li>Mullenders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+human+urothelial+cancer+organoids:+A+tool+for+bladder+cancer+research.">Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).</li><li>Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+bladder+cancer+in+mice:+opportunities+and+challenges.">Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).</li><li>Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mouse+models+in+oncology+research+and+cancer+medicine.">Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Fujii, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+histopathological+evaluation+of+organoids.">A simple method for histopathological evaluation of organoids.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).</li><li>Georgas, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+illustrated+anatomical+ontology+of+the+developing+mouse+lower+urogenital+tract.">An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract.</a> Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).</li><li>Santos, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+organoids+originating+from+Cd49f(high)+mouse+stem+cells+display+Notch-dependent+differentiation+capacity.">Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity.</a> Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+defined+disease+model+reveals+that+urothelial+cells+can+initiate+divergent+bladder+cancer+phenotypes.">A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intertumoral+heterogeneity+in+SCLC+is+influenced+by+the+cell+type+of+origin.">Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin.</a> Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).</li><li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer:+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung.">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li><li>Bottger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+heterogeneity+underlies+differential+cisplatin+sensitivity+in+mouse+models+of+small-cell+lung+cancer.">Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer.</a> Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).</li><li>Puzio-Kuter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+p53+and+Pten+promotes+invasive+bladder+cancer.">Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer.</a> Genes &amp; Development. 23 (6), 675-680 (2009).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mouse+models+of+bladder+cancer+identify+a+prognostic+signature+associated+with+risk+of+disease+progression.">Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression.</a> Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).</li><li>Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+genetic+removal+of+signaling+molecules+in+cultured+primary+mouse+embryonic+fibroblasts.">Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).</li><li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+interrogation+of+cancer+cell+of+origin+through+CRISPR+editing.">Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).</li></ol>

GEMM'er har været guldstandarderne for kræftmodellering initieret fra normale celler, hvilket gør det muligt at teste konsekvenserne af potentielle onkogene forstyrrelser (onkogenaktivering og / eller tab af tumorsuppressorer) grundigt. Her tilvejebringes en hurtig og effektiv protokol til at generere blærekræftorganoider via ex vivo-genredigering af normale museurtelceller, der bærer floxede alleler i gener af interesse. H & E og IHC farvning viser, at TKO-organoider udviser histologi i overensstemmelse m...

Blærekræft er den fjerde mest almindelige kræft hos mænd og rammer mere end 80.000 mennesker årligt i USA1. Platinbaseret kemoterapi har været standardbehandling for patienter med fremskreden blærekræft i mere end tre årtier. Landskabet af blærekræftbehandling er blevet revolutioneret af den nylige Food and Drug Administration (FDA) godkendelse af immunterapi (anti-PD-1 og anti-PD-L1 immun checkpoint hæmmere), erdafitinib (en fibroblast vækstfaktor receptor inhibitor) og enfortumab vedotin (et antistof-lægemiddel konjugat) 2,3,4. Der findes dog ingen klinisk godkendte biomarkører til at forudsige responsen på kemoterapi eller immunterapi. Der er et kritisk behov for at generere informative prækliniske modeller, der kan forbedre forståelsen af de mekanismer, der driver blærekræftprogression og udvikle prædiktive biomarkører for forskellige behandlingsmetoder.
En stor hindring i blære translationel forskning er manglen på prækliniske modeller, der rekapitulerer human blærekræftpatogenese og behandlingsrespons 5,6. Der er udviklet flere prækliniske modeller, herunder in vitro 2D-modeller (cellelinjer eller betinget omprogrammerede celler), in vitro 3D-modeller (organoider, 3D-udskrivning) og in vivo-modeller (xenograft, kræftfremkaldende, genetisk manipulerede modeller og patientafledt xenograft)2,6. Gensplejsede musemodeller (GEMM'er) er nyttige til mange anvendelser inden for blærekræftbiologi, herunder analyser af tumorfænotyper, mekanistiske undersøgelser af kandidatgener og/eller signalveje og præklinisk evaluering af terapeutiske responser 6,7. GEMM'er kan anvende stedsspecifikke rekombinaser (Cre-loxP) til at kontrollere genetiske deletioner i et eller flere tumorsuppressorgener. Processen med at generere ønskede GEMM'er med flere gendeletninger er tidskrævende, besværlig og dyr5. Det overordnede mål med denne metode er at udvikle en hurtig og effektiv metode til ex vivo Cre-levering til etablering af blære triple knockout (TKO) modeller fra normale muse urothelceller, der bærer tredobbelt floxede alleler (Trp53, Pten og Rb1)8. Den største fordel ved ex vivo-metoden er den hurtige arbejdsgang (1-2 uger i stedet for mange års museavl). Denne artikel beskriver protokollen for høst af normale urothelceller med floxerede alleler, ex vivo adenovirustransduktion, organoidkulturer og in vitro- og in vivo-karakterisering i immunkompetente C57 BL / 6J-mus. Denne metode kan yderligere anvendes til at generere klinisk relevante blærekræftorganoider i immunkompetente mus, der huser enhver kombination af floxede alleler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#956;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 1.5 inches needle</td>
			<td>EXELINT International</td>
			<td>26406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)</td>
			<td>UI Viral Vector Core</td>
			<td>VVC-U of Iowa-5-HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57 BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal-stripped FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine substitute (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mammary Epithelial Cell Growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix extracts from Engelbreth&#8211;Holm&#8211;Swarm mouse sarcomas (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M7019</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK7</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-23876</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab735</td>
			<td>IHC 1:100, IF 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Upk3</td>
			<td>Fitzgerald</td>
			<td>10R-U103A</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Vimentin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-6260</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal rat anti-CK8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-s</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell vios 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51033557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal chicken anti-CK5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td>IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signature benchtop shaking incubator Model 1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td>35962-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Processing Gel (HistoGel)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade size 10</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall T1 centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells

Blærekræft er et underundersøgt område, især i genetisk manipulerede musemodeller (GEMM'er). Indavlede GEMM'er med vævsspecifikke Cre- og loxP-steder har været guldstandarderne for betinget eller inducerbar genmålretning. For at give hurtigere og mere effektive eksperimentelle modeller udvikles et ex vivo organoidkultursystem ved hjælp af adenovirus Cre og normale urotelceller, der bærer flere loxP-alleler af tumorsuppressorerne Trp53, Pten og Rb1. Normale urothelceller adskilles enzymatisk fra fire blærer af triple floxed mus (Trp53f / f: Ptenf / f: Rb1f / f). Urotelcellerne transduceres ex vivo med adenovirus-Cre drevet af en CMV-promotor (Ad5CMVCre). De transducerede blæreorganoider dyrkes, formeres og karakteriseres in vitro og in vivo. PCR bruges til at bekræfte gendeletninger i Trp53, Pten og Rb1. Immunofluorescens (IF) farvning af organoider viser positiv ekspression af urothelial afstamningsmarkører (CK5 og p63). Organoiderne injiceres subkutant i værtsmus til tumorudvidelse og serielle passager. Immunohistokemien (IHC) af xenografts udviser positiv ekspression af CK7, CK5 og p63 og negativ ekspression af CK8 og Uroplakin 3. Sammenfattende er adenovirusmedieret gendeletning fra museurtelceller konstrueret med loxP-steder en effektiv metode til hurtigt at teste det tumorigene potentiale af definerede genetiske ændringer.

Arbejdsgangen for adenovirus-Cre-medierede gendeletninger i museurtelceller er vist i figur 1A. Den ledsagende video viser, hvordan urothelcellerne adskilles fra blærens fundus, og hvordan de tredobbelte floxerede celler transduceres ex vivo med Ad5CMVCre. Figur 1A viste, at minimale submucosa og muskelceller blev adskilt efter enzymfordøjelsen. For at bekræfte effektiviteten af adenovirus-Cre-levering blev disassocierede urotelceller fra tredobbelt ...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells at JoVE.com

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Denne protokol beskriver processen med generering og karakterisering af muse urotheliale organoider, der indeholder deletioner i gener af interesse. Metoderne omfatter høst af muse urothelceller, ex vivo-transduktion med adenovirus, der driver Cre-ekspression med en CMV-promotor, og in vitro - såvel som in vivo-karakterisering .

Ex Vivo Organoidmodel af adenovirus-cre-medierede gendeletninger i museurtelceller

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Vi udviklede en hurtig og effektiv protokol til at generere blærekræftorganoider via ex vivo genredigering af normale muse urotelceller, der bærer floxede alleler i gener af interesse. Denne ex vivo-metode har en arbejdsgang på en til to uger i stedet for mange års museavl, og den er yderst effektiv til adenovirustransduktion på de Cre-medierede gendeletninger. Til at begynde med skal du forberede alle sterile instrumenter og reagenser, herunder saks, tang, DPBS i 35 ml kulturskåle, 70% ethanol, gasbind og rene papirhåndklæder.Rengør derefter alle overflader af dissektionsområdet og dæk dissektionsområdet med et rent papirhåndklæde. Placer den aflivede mus på gasbindet i dissektionsområdet og spray 70% ethanol på musens mave, og brug derefter steril dissektionssaks, lav et lavere midterlinje abdominal snit for at udsætte blæren. Brug nu tangen til at gribe og forsigtigt trække blæren op for at identificere det bilaterale ureterovesiske kryds.Brug en saks til at fjerne blærefundusen efter grænselinjen mellem de to urinlederåbninger og overfør blæren til en steril skål indeholdende 2 ml DPBS, fjern derefter fedt- og bindevævet og læg blæren i en ny skål indeholdende 2 ml DPBS. Fjern også adenovirus fra minus 80 grader Celsius opbevaring og hold det på is. Til cellesociation skal du forberede alle sterile instrumenter og reagenser som beskrevet i manuskriptet, derefter i et biosikkerhedsskab overføre blæren til en 35 millimeter skål og vaske med 2 ml steril DPBS.Saml blærevæv fra fire mus i en skål med en milliliter komplet dyrkningsmedium uden trækulsst strippet FBS. Brug derefter et kirurgisk blad til at hakke hver blære i fire lige store stykker, og brug derefter tang til at udfolde blæren for at udsætte urotheloverfladen for mediet. Overfør blærestykkerne og mediet til et 15 ml centrifugerør.Vask fadet to gange med 2 ml komplet dyrkningsmedium uden trækulsstribbet FBS, og tilsæt vasken til centrifugerøret, hvilket bringer det samlede volumen til 5 ml. Derefter tilsættes en collagenase og hyaluronidase blanding og placeres røret vandret i en 37 grader Celsius orbital shaker inkubator i 30 minutter ved 200 RPM. Efter vævsfordøjelse tilsættes et lige stort volumen på 10% trækulsstribbet FBS og DPBS i røret og centrifugeres ved 200 gange g i 5 minutter.Efter kassering af supernatanten tilsættes 2 ml trypsinerstatning i cellepillen og blandes godt, og derefter inkuberes røret ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 4 minutter. Efter inkubation pipetteres cellerne op og ned 10 gange med en standard P1000-spids og tilsættes 5 ml 10% trækulsstået FBS og DPBS. Sil de dissocierede celler gennem en 100 mikrometer steril cellesil og opsaml cellesuspensionen i et 50 ml rør.Overfør cellesuspensionen til et 15 ml rør og centrifuge ved 200 gange g i 5 minutter. Efter fjernelse af supernatanten skal pelleten suspenderes igen i 1 milliliter komplet kulturmedium. Tæl antallet af celler ved hjælp af et hæmocytometer og plade 0,5 gange 10 til 6. celler i hver brønd i en 24-brønds plade med 0,5 ml frisk komplet dyrkningsmedium.Tag derefter matrixekstrakterne af Engelbreth-Holm-Swarm musesarkomceller ud af minus 20 grader Celsius opbevaring og tø dem op på is. Forvarm også en 6-brønds plade i en 37-graders Celsius celleinkubator. Til adenoviral transduktion tilsættes 2 mikroliter adenovirus i 24-brøndspladen og blandes godt med de dissocierede urothelceller.For at forbedre transduktionseffektiviteten skal du udføre spinokulation ved at centrifugere pladen ved 300 gange g i 30 minutter og derefter inkubere pladen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 1 time. Overfør celler og medium fra brønden til et 15 milliliter rør og centrifuge ved 200 gange g i 5 minutter. Efter kassering af supernatanten tilsættes 50 mikroliter komplet kulturmedium og blandes godt med cellerne i bunden.Tilsæt derefter 140 mikroliter matrixekstrakt og bland forsigtigt godt for at undgå luftbobler, og opret derefter kupler til organoider ved hurtigt at tilføje 50 mikroliter af opløsningen pr. Kuppel i den forvarmede 6-brønds plade. Inkuber pladen og lad kuplerne størkne i 5 minutter. Efter 5 minutter skal du vende pladen med 6 brønde på hovedet og fortsætte størkningen i yderligere 25 minutter.Efter inkubation tilsættes 2,5 ml komplet kulturmedium til hver brønd og anbringes pladen i en inkubator til organoidkultur. Det grønne fluorescerende protein blev påvist i næsten 100% af cellerne, hvilket tyder på høj effektivitet af adenovirustransduktion. Hæmatoxylin og eosinfarvning og immunohistokemi af triple knockout organoider tumorer viste morfologien af højkvalitets urothelial carcinom med positiv proteinekspression af basale subtypemarkører af CK5 og p63.De ikke-rekombinerede floxede alleler blev påvist i urothelceller, ubehandlet med adenovirus, mens de rekombinerede alleler blev observeret i de tredobbelte knockout-organoider. Generelt var der brug for 2 til 3 uger for at danne en 2 centimeter subkutan tumor. Immunhistokemien af tredobbelte knockout-organoider, in vivo xenografts, viste positiv ekspression af CK7-, CK5- og p63-proteiner.Negativ ekspression blev påvist for CK8- og uroplakinproteiner. Mesenchymmarkøren, vimentin, blev kun påvist i tumorkapslen eller stroma. Museblære dissociationen må ikke overstige 30 minutter.En længere dissociationstid kan stige i procentdelen af stromacellerne, såsom endotelceller og fibroblaster Denne tilgang kan kombineres med cellesortering eller celletype et specifikt adenovirus for at generere celletypen af specifikke organoider, såsom lumen versus basale organoider.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Det<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginære Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantificering af genekspression og tumorindtrængen Brug Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolering af cirkulerende tumorceller i en ortotopisk musemodel af kolorektal cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR vurdering af pH, pO2, Redox Status, og koncentrationen af fosfat og glutathion i Tumor mikromiljø

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

En prækliniske musemodel af osteosarkom at definere den ekstracellulære vesikel-medieret kommunikation mellem Tumor og mesenkymale stamceller

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirus for Tumor-målrettet Immunomodulation: Design og evaluering Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Tre-dimensionelle knogle ekstracellulære Matrix Model for osteosarkom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Evaluering af differentierings kapaciteten af mus prostata Epiteliale celler ved hjælp af Organoid kultur

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

En Ex Vivo Brain Slice Model til at studere og målrette brystkræft hjernemetastatisk tumorvækst

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Definition af genfunktioner i tumorigenese ved Ex vivo Ablation af floxede alleler i maligne perifere nerveskede tumorceller

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Opretholdelse af menneskelig glioblastom cellulær mangfoldighed Ex vivo ved hjælp af tredimensionel organoidkultur

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...