Name: ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells at JoVE.com

Dit onderzoekswerk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 en R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), de Roswell Park Alliance Foundation en de Friends of Urology Foundation. Wij danken Marisa Blask en Mila Pakhomova voor het proeflezen van het manuscript.

Alle dierprocedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) in het Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY (1395M, Biosafety 180501 en 180502). OPMERKING: Voer stap 1-3 op dezelfde dag uit.
1. Dissectie van de muizenblaas
<ol><li>Voorbereiding voor dissectie<ol>
<li>Bereid alle steriele instrumenten voor, waaronder scharen, tangen, steriele DPBS in 35 mm kweekschalen, 70% ethanol, steriel gaas en schone papieren handdo...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2021.">Cancer statistics, 2021.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+bladder+cancer+research.">Preclinical models for bladder cancer research.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).</li><li>DeGraff, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+preclinical+models+for+the+advancement+of+translational+bladder+cancer+research.">Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).</li><li>Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+treatment+landscape+of+advanced+urothelial+carcinoma.">The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma.</a> Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).</li><li>Mullenders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+human+urothelial+cancer+organoids:+A+tool+for+bladder+cancer+research.">Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).</li><li>Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+bladder+cancer+in+mice:+opportunities+and+challenges.">Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).</li><li>Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mouse+models+in+oncology+research+and+cancer+medicine.">Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Fujii, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+histopathological+evaluation+of+organoids.">A simple method for histopathological evaluation of organoids.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).</li><li>Georgas, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+illustrated+anatomical+ontology+of+the+developing+mouse+lower+urogenital+tract.">An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract.</a> Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).</li><li>Santos, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+organoids+originating+from+Cd49f(high)+mouse+stem+cells+display+Notch-dependent+differentiation+capacity.">Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity.</a> Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+defined+disease+model+reveals+that+urothelial+cells+can+initiate+divergent+bladder+cancer+phenotypes.">A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intertumoral+heterogeneity+in+SCLC+is+influenced+by+the+cell+type+of+origin.">Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin.</a> Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).</li><li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer:+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung.">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li><li>Bottger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+heterogeneity+underlies+differential+cisplatin+sensitivity+in+mouse+models+of+small-cell+lung+cancer.">Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer.</a> Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).</li><li>Puzio-Kuter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+p53+and+Pten+promotes+invasive+bladder+cancer.">Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer.</a> Genes &amp; Development. 23 (6), 675-680 (2009).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mouse+models+of+bladder+cancer+identify+a+prognostic+signature+associated+with+risk+of+disease+progression.">Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression.</a> Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).</li><li>Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+genetic+removal+of+signaling+molecules+in+cultured+primary+mouse+embryonic+fibroblasts.">Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).</li><li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+interrogation+of+cancer+cell+of+origin+through+CRISPR+editing.">Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).</li></ol>

GEMM's zijn de gouden standaard voor kankermodellering geïnitieerd vanuit normale cellen, waardoor de gevolgen van potentiële oncogene verstoringen (oncogenactivering en / of verlies van tumoronderdrukkers) rigoureus kunnen worden getest. Hier wordt een snel en efficiënt protocol aangeboden om blaaskankerorganoïden te genereren via ex vivo genbewerking van normale muis-urotheelcellen die gevlokte allelen dragen in genen van belang. H&E- en IHC-kleuring tonen aan dat TKO-organoïden histologie vertonen die co...

Blaaskanker is de vierde meest voorkomende kanker bij mannen en treft jaarlijks meer dan 80.000 mensen in de Verenigde Staten1. Platina-gebaseerde chemotherapie is al meer dan drie decennia de standaardzorg voor patiënten met gevorderde blaaskanker. Het landschap van de behandeling van blaaskanker is revolutionair veranderd door de recente goedkeuring door de Food and Drug Administration (FDA) van immunotherapie (anti-PD-1 en anti-PD-L1 immuuncheckpointremmers), erdafitinib (een fibroblastgroeifactorreceptorremmer) en enfortumab vedotin (een antilichaam-geneesmiddelconjugaat)2,3,4. Er zijn echter geen klinisch goedgekeurde biomarkers beschikbaar voor het voorspellen van de reacties op chemotherapie of immunotherapie. Er is een kritieke behoefte om informatieve preklinische modellen te genereren die het begrip van de mechanismen die de progressie van blaaskanker stimuleren kunnen verbeteren en voorspellende biomarkers voor verschillende behandelingsmodaliteiten kunnen ontwikkelen.
Een belangrijk obstakel in blaastranslationele onderzoeken is het gebrek aan preklinische modellen die de pathogenese en behandelingsresponsen van menselijke blaaskanker samenvatten 5,6. Er zijn meerdere preklinische modellen ontwikkeld, waaronder in vitro 2D-modellen (cellijnen of voorwaardelijk geherprogrammeerde cellen), in vitro 3D-modellen (organoïden, 3D-printen) en in vivo modellen (xenograft, kankerverwekkende, genetisch gemanipuleerde modellen en patiënt-afgeleide xenograft)2,6. Genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEMM's) zijn nuttig voor vele toepassingen in de blaaskankerbiologie, waaronder analyses van tumorfenotypen, mechanistisch onderzoek van kandidaatgenen en/of signaalroutes, en de preklinische evaluatie van therapeutische responsen 6,7. GEMM's kunnen site-specifieke recombinases (Cre-loxP) gebruiken om genetische deleties in een of meer tumorsuppressorgenen te controleren. Het proces van het genereren van gewenste GEMM's met meerdere gendeleties is tijdrovend, arbeidsintensief en duur5. Het algemene doel van deze methode is het ontwikkelen van een snelle en efficiënte methode van ex vivo Cre-toediening voor het vaststellen van blaas triple knockout (TKO) modellen van normale muis urotheelcellen met triple floxed allelen (Trp53, Pten en Rb1)8. Het grote voordeel van de ex vivo methode is de snelle workflow (1-2 weken in plaats van jaren muizenfok). Dit artikel beschrijft het protocol voor het oogsten van normale urotheelcellen met gevlokte allelen, ex vivo adenovirustransductie, organoïde culturen en in vitro en in vivo karakterisering bij immunocompetente C57 BL/6J muizen. Deze methode kan verder worden gebruikt om klinisch relevante blaaskankerorganoïden te genereren in immunocompetente muizen die een combinatie van gevlokte allelen herbergen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#956;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 1.5 inches needle</td>
			<td>EXELINT International</td>
			<td>26406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)</td>
			<td>UI Viral Vector Core</td>
			<td>VVC-U of Iowa-5-HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57 BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal-stripped FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine substitute (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mammary Epithelial Cell Growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix extracts from Engelbreth&#8211;Holm&#8211;Swarm mouse sarcomas (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M7019</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK7</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-23876</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab735</td>
			<td>IHC 1:100, IF 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Upk3</td>
			<td>Fitzgerald</td>
			<td>10R-U103A</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Vimentin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-6260</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal rat anti-CK8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-s</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell vios 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51033557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal chicken anti-CK5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td>IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signature benchtop shaking incubator Model 1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td>35962-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Processing Gel (HistoGel)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade size 10</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall T1 centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells

Blaaskanker is een onderbelicht gebied, met name in genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEMM's). Inteelt GEMM's met weefselspecifieke Cre- en loxP-sites zijn de gouden standaard voor voorwaardelijke of induceerbare gentargeting. Om snellere en efficiëntere experimentele modellen te bieden, wordt een ex vivo organoïde kweeksysteem ontwikkeld met behulp van adenovirus Cre en normale urotheelcellen die meerdere loxP-allelen van de tumoronderdrukkers Trp53, Pten en Rb1 dragen. Normale urotheelcellen zijn enzymatisch gescheiden van vier blazen van triple floxed muizen (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). De urotheelcellen worden ex vivo getransduceerd met adenovirus-Cre aangedreven door een CMV promotor (Ad5CMVCre). De getransduceerde blaasorganoïden worden gekweekt, vermeerderd en gekarakteriseerd in vitro en in vivo. PCR wordt gebruikt om gendeleties in Trp53, Pten en Rb1 te bevestigen. Immunofluorescentie (IF) kleuring van organoïden toont positieve expressie van urotheliale afstamming markers (CK5 en p63). De organoïden worden subcutaan geïnjecteerd in gastheermuizen voor tumorexpansie en seriële passages. De immunohistochemie (IHC) van xenografts vertoont positieve expressie van CK7, CK5 en p63 en negatieve expressie van CK8 en Uroplakine 3. Samenvattend is adenovirus-gemedieerde gendeletie uit muizenurotheelcellen die zijn gemanipuleerd met loxP-sites een efficiënte methode om snel het tumorigene potentieel van gedefinieerde genetische veranderingen te testen.

De workflow van adenovirus-Cre gemedieerde gendeleties in muizenurotheelcellen is weergegeven in figuur 1A. De bijbehorende video laat zien hoe de urotheelcellen worden losgekoppeld van de fundus van de blaas en hoe de triple floxed cellen ex vivo worden getransduceerd met Ad5CMVCre. Figuur 1A toonde aan dat minimale submucosa en spiercellen werden gedisassocieerd na enzymvertering. Om de efficiëntie van adenovirus-Cre-toediening te bevestigen, werden ...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells at JoVE.com

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Dit protocol beschrijft het proces van het genereren en karakteriseren van muis urotheliale organoïden die deleties in genen van belang herbergen. De methoden omvatten het oogsten van muizenurotheelcellen, ex vivo transductie met adenovirus dat Cre-expressie drijft met een CMV-promotor, en zowel in vitro als in vivo karakterisering.

Ex Vivo Organoïde model van Adenovirus-Cre gemedieerde gendeleties in muizen urotheelcellen

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

We ontwikkelden een snel en efficiënt protocol om blaaskankerorganoïden te genereren via ex vivo genbewerking van normale muis-urotheelcellen die floxed allelen dragen in genen van belang. Deze ex vivo methode heeft een workflow van één tot twee weken in plaats van jaren van muizen fokken, en het is zeer efficiënt in adenovirustransductie op de Cre-gemedieerde gendeleties. Bereid om te beginnen alle steriele instrumenten en reagentia voor, inclusief scharen, tangen, DPBS in 35-milliliter kweekschalen, 70% ethanol, gaas en schone papieren handdoeken.Reinig vervolgens alle oppervlakken van het dissectiegebied en bedek het dissectiegebied met een schone papieren handdoek. Plaats de geëuthanaseerde muis op het gaas in het dissectiegebied en spuit 70% ethanol op de buik van de muis, maak vervolgens met behulp van een steriele dissectieschaar een onderste buikincisie om de blaas bloot te leggen. Gebruik nu de tang om de blaas vast te pakken en voorzichtig omhoog te trekken om de bilaterale ureterovesicale overgang te identificeren.Verwijder met een schaar de blaasfundus, volg de grenslijn tussen de twee urineleideropeningen en breng de blaas over in een steriele schaal met 2 milliliter DPBS, verwijder vervolgens het vet- en bindweefsel en plaats de blaas in een nieuwe schaal met 2 milliliter DPBS. Verwijder ook het adenovirus uit de opslag van min 80 graden Celsius en houd het op ijs. Bereid voor celdissociatie alle steriele instrumenten en reagentia zoals beschreven in het manuscript, breng vervolgens in een bioveiligheidskast de blaas over naar een schaal van 35 millimeter en was met 2 milliliter steriele DPBS.Verzamel blaasweefsels van vier muizen in een schaal met één milliliter volledig kweekmedium zonder houtskool-gestripte FBS. Vervolgens, met behulp van een chirurgisch mes, hak elke blaas in vier gelijke stukken, dan met behulp van een tang, ontvouw de blaas om het urotheeloppervlak bloot te stellen aan het medium. Breng de blaasstukken en het medium over in een centrifugebuis van 15 milliliter.Was de schaal twee keer met 2 milliliter volledig kweekmedium zonder houtskoolgestripte FBS en voeg de was toe aan de centrifugebuis, waardoor het totale volume op 5 milliliter komt. Voeg vervolgens een collagenase- en hyaluronidasemengsel toe en plaats de buis horizontaal in een orbitale shakerincubator van 37 graden Celsius gedurende 30 minuten bij 200 RPM. Voeg na weefselvertering een gelijk volume van 10% houtskool-gestripte FBS en DPBS toe aan de buis en centrifugeer gedurende 5 minuten op 200 keer g.Voeg na het weggooien van het supernatant 2 milliliter trypsinesubstituut toe aan de celkorrel en meng goed, en incubeer vervolgens de buis bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 4 minuten. Pipetteer na incubatie de cellen 10 keer op en neer met een standaard P1000-tip en voeg 5 milliliter 10% houtskoolgestripte FBS en DPBS toe. Zeef de gedissocieerde cellen door een steriele celzeef van 100 micrometer en verzamel de celsuspensie in een buis van 50 milliliter.Breng de celsuspensie over in een buis van 15 milliliter en centrifugeer gedurende 5 minuten op 200 maal g. Na het verwijderen van het supernatant, resuspend de pellet in 1 milliliter volledig kweekmedium. Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer en plaat 0,5 keer 10 tot de 6e cellen in elke put van een 24-putplaat met 0,5 milliliter vers volledig kweekmedium.Haal vervolgens de matrixextracten van Engelbreth-Holm-Swarm muizensarcoomcellen uit minus 20 graden Celsius opslag en ontdooi ze op ijs. Verwarm ook een 6-well plaat in een celincubator van 37 graden Celsius. Voeg voor adenovirale transductie 2 microliter adenovirus toe aan de 24-well plaat en meng goed met de gedissocieerde urotheelcellen.Om de transductie-efficiëntie te verbeteren, voert u spinoculatie uit door de plaat gedurende 30 minuten op 300 keer g te centrifugeren en vervolgens de plaat gedurende 1 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide te incuberen. Breng cellen en medium van de put over in een buis van 15 milliliter en centrifugeer gedurende 5 minuten op 200 maal g. Voeg na het weggooien van het supernatant 50 microliter volledig kweekmedium toe en meng goed met de cellen aan de onderkant.Voeg vervolgens 140 microliter matrixextract toe en meng voorzichtig goed om luchtbellen te voorkomen, en maak vervolgens koepels voor organoïden door snel 50 microliter van de oplossing per koepel toe te voegen aan de voorgewarmde 6-well plaat. Incubeer de plaat en laat de koepels 5 minuten stollen. Draai na 5 minuten de 6-putplaat ondersteboven en ga nog eens 25 minuten door met stollen.Voeg na incubatie 2,5 milliliter volledig kweekmedium toe aan elke put en plaats de plaat in een incubator voor organoïdecultuur. Het groene fluorescerende eiwit werd gedetecteerd in bijna 100% van de cellen, wat wijst op een hoge efficiëntie van adenovirustransductie. Hematoxyline- en eosinekleuring en immunohistochemie van triple knock-out organoïdentumoren toonden de morfologie van hoogwaardig urotheelcarcinoom met positieve eiwitexpressie van basale subtypemarkers van CK5 en p63.De ongecomponeerde floxed allelen werden gedetecteerd in urotheelcellen, onbehandeld met adenovirus, terwijl de gerecombineerde allelen werden waargenomen in de triple knockout organoïden. Over het algemeen waren 2 tot 3 weken nodig om een subcutane tumor van 2 centimeter te vormen. De immunohistochemie van triple knockout organoïden, in vivo xenografts, vertoonde positieve expressie van CK7-, CK5- en p63-eiwitten.Negatieve expressie werd gedetecteerd voor CK8- en uroplakine-eiwitten. De mesenchymmarker, vimentine, werd alleen gedetecteerd in het tumorkapsel of stroma. De dissociatie van de muisblaas mag niet langer zijn dan 30 minuten.Een langere dissociatietijd kan toenemen in het percentage stromacellen, zoals endotheelcellen en de fibroblasten Deze aanpak kan worden gecombineerd met celsortering of celtype een specifiek adenovirus om het celtype van specifieke organoïden te genereren, zoals lumen versus basale organoïden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolatie van circulerende tumorcellen in een orthotopische muismodel van colorectale kanker

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR beoordeling van pH, pO2, Redox Status, en concentraties van fosfaat en glutathion in de communicatie van de Tumor

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Een preklinische muismodel van osteosarcoom definiëren de extracellulaire vesikel-gemedieerde communicatie tussen Tumor en mesenchymale stamcellen

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirussen voor Tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Driedimensionale bot extracellulaire Matrix Model voor Osteosarcoom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Evaluatie van de differentiatie capaciteit van muizen prostaat epitheelcellen met behulp van Organoid cultuur

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Een ex vivo hersenschijfmodel om borstkanker te bestuderen en te targeten Hersen gemetastaseerde tumorgroei

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Het definiëren van genfuncties in tumorigenese door ex vivo ablatie van gevlochten allelen in kwaadaardige perifere zenuwschedetumorcellen

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Behoud van humane glioblastoom cellulaire diversiteit ex vivo met behulp van driedimensionale organoïde cultuur

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...