Name: ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells at JoVE.com

Diese Forschungsarbeit wurde zum Teil von NIH Grants, K08CA252161(Q.L.), R01CA234162 und R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), der Roswell Park Alliance Foundation und der Friends of Urology Foundation unterstützt. Wir danken Marisa Blask und Mila Pakhomova für das Korrekturlesen des Manuskripts.

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY, genehmigt (1395M, Biosafety 180501 und 180502). HINWEIS: Führen Sie die Schritte 1 bis 3 am selben Tag aus.
1. Sezierung der Mausblase
<ol><li>Vorbereitung für die Dissektion<ol>
<li>Bereiten Sie alle sterilen Instrumente einschließlich Schere, Pinzette, sterile DPBS in 35-mm-Kulturgeschirr, 70% Ethanol, sterile Gaze und saubere Pa...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2021.">Cancer statistics, 2021.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+bladder+cancer+research.">Preclinical models for bladder cancer research.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).</li><li>DeGraff, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+preclinical+models+for+the+advancement+of+translational+bladder+cancer+research.">Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).</li><li>Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+treatment+landscape+of+advanced+urothelial+carcinoma.">The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma.</a> Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).</li><li>Mullenders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+human+urothelial+cancer+organoids:+A+tool+for+bladder+cancer+research.">Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).</li><li>Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+bladder+cancer+in+mice:+opportunities+and+challenges.">Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).</li><li>Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mouse+models+in+oncology+research+and+cancer+medicine.">Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Fujii, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+histopathological+evaluation+of+organoids.">A simple method for histopathological evaluation of organoids.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).</li><li>Georgas, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+illustrated+anatomical+ontology+of+the+developing+mouse+lower+urogenital+tract.">An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract.</a> Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).</li><li>Santos, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+organoids+originating+from+Cd49f(high)+mouse+stem+cells+display+Notch-dependent+differentiation+capacity.">Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity.</a> Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+defined+disease+model+reveals+that+urothelial+cells+can+initiate+divergent+bladder+cancer+phenotypes.">A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intertumoral+heterogeneity+in+SCLC+is+influenced+by+the+cell+type+of+origin.">Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin.</a> Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).</li><li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer:+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung.">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li><li>Bottger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+heterogeneity+underlies+differential+cisplatin+sensitivity+in+mouse+models+of+small-cell+lung+cancer.">Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer.</a> Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).</li><li>Puzio-Kuter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+p53+and+Pten+promotes+invasive+bladder+cancer.">Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer.</a> Genes &amp; Development. 23 (6), 675-680 (2009).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mouse+models+of+bladder+cancer+identify+a+prognostic+signature+associated+with+risk+of+disease+progression.">Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression.</a> Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).</li><li>Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+genetic+removal+of+signaling+molecules+in+cultured+primary+mouse+embryonic+fibroblasts.">Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).</li><li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+interrogation+of+cancer+cell+of+origin+through+CRISPR+editing.">Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).</li></ol>

GEMMs waren die Goldstandards für die Krebsmodellierung, die von normalen Zellen initiiert wurde, so dass die Folgen potenzieller onkogener Störungen (Onkogenaktivierung und / oder Verlust von Tumorsuppressoren) rigoros getestet werden konnten. Hier wird ein schnelles und effizientes Protokoll bereitgestellt, um Blasenkrebs-Organoide durch Ex-vivo-Gen-Editing von normalen Maus-Urothelzellen, die floxierte Allele in interessanten Genen tragen, zu erzeugen. H&E- und IHC-Färbungen zeigen, dass TKO-Organoide eine...

Blasenkrebs ist die vierthäufigste Krebsart bei Männern und betrifft jährlich mehr als 80.000 Menschen in den Vereinigten Staaten1. Die platinbasierte Chemotherapie ist seit mehr als drei Jahrzehnten der Standard für Patienten mit fortgeschrittenem Blasenkrebs. Die Landschaft der Blasenkrebsbehandlung wurde durch die jüngste Zulassung der Food and Drug Administration (FDA) für Immuntherapie (Anti-PD-1- und Anti-PD-L1-Immun-Checkpoint-Inhibitoren), Erdafitinib (ein Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor-Inhibitor) und Enfortumab-Vedotin (ein Antikörper-Wirkstoff-Konjugat) revolutioniert2,3,4. Es stehen jedoch keine klinisch zugelassenen Biomarker zur Verfügung, um das Ansprechen auf eine Chemotherapie oder Immuntherapie vorherzusagen. Es besteht ein dringender Bedarf, informative präklinische Modelle zu erstellen, die das Verständnis der Mechanismen verbessern können, die das Fortschreiten von Blasenkrebs vorantreiben, und prädiktive Biomarker für verschiedene Behandlungsmodalitäten entwickeln können.
Ein großes Hindernis in der blasentranslationalen Forschung ist das Fehlen präklinischer Modelle, die die Pathogenese und das Behandlungsansprechen von menschlichem Blasenkrebs rekapitulieren 5,6. Es wurden mehrere präklinische Modelle entwickelt, darunter In-vitro-2D-Modelle (Zelllinien oder bedingt umprogrammierte Zellen), In-vitro-3D-Modelle (Organoide, 3D-Druck) und In-vivo-Modelle (Xenotransplantat, karzinogeninduzierte, gentechnisch veränderte Modelle und von Patienten abgeleitete Xenotransplantate)2,6. Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) sind für viele Anwendungen in der Blasenkrebsbiologie nützlich, einschließlich Analysen von Tumorphänotypen, mechanistischen Untersuchungen von Kandidatengenen und/oder Signalwegen und der präklinischen Bewertung therapeutischer Reaktionen 6,7. GEMMs können standortspezifische Rekombinasen (Cre-loxP) verwenden, um genetische Deletionen in einem oder mehreren Tumorsuppressorgenen zu kontrollieren. Der Prozess der Erzeugung gewünschter GEMMs mit mehreren Gendeletionen ist zeitaufwendig, mühsam und teuer5. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Entwicklung einer schnellen und effizienten Methode der Ex-vivo-Cre-Abgabe zur Etablierung von Blasen-Triple-Knockout-Modellen (TKO) aus normalen Maus-Urothelzellen, die dreifach floxierte Allele (Trp53, Pten und Rb1) tragen8. Der große Vorteil der Ex-vivo-Methode ist der schnelle Workflow (1-2 Wochen statt jahrelanger Mauszucht). Dieser Artikel beschreibt das Protokoll für die Ernte normaler Urothelzellen mit floxierten Allelen, ex vivo Adenovirus-Transduktion, Organoidkulturen und in vitro und in vivo Charakterisierung bei immunkompetenten C57 BL/6J Mäusen. Diese Methode kann weiter verwendet werden, um klinisch relevante Blasenkrebs-Organoide in immunkompetenten Mäusen zu erzeugen, die eine beliebige Kombination von floxierten Allelen beherbergen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#956;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 1.5 inches needle</td>
			<td>EXELINT International</td>
			<td>26406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)</td>
			<td>UI Viral Vector Core</td>
			<td>VVC-U of Iowa-5-HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57 BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal-stripped FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine substitute (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mammary Epithelial Cell Growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix extracts from Engelbreth&#8211;Holm&#8211;Swarm mouse sarcomas (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M7019</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK7</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-23876</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab735</td>
			<td>IHC 1:100, IF 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Upk3</td>
			<td>Fitzgerald</td>
			<td>10R-U103A</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Vimentin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-6260</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal rat anti-CK8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-s</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell vios 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51033557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal chicken anti-CK5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td>IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signature benchtop shaking incubator Model 1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td>35962-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Processing Gel (HistoGel)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade size 10</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall T1 centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells

Blasenkrebs ist ein wenig untersuchter Bereich, insbesondere in gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEMMs). Inzucht-GEMMs mit gewebespezifischen Cre- und loxP-Stellen waren die Goldstandards für bedingtes oder induzierbares Gen-Targeting. Um schnellere und effizientere experimentelle Modelle zu liefern, wird ein Ex-vivo-Organoid-Kultursystem entwickelt, das das Adenovirus Cre und normale Urothelzellen verwendet, die mehrere loxP-Allele der Tumorsuppressoren Trp53, Pten und Rb1 tragen. Normale Urothelzellen sind enzymatisch von vier Blasen dreifach floxierter Mäuse getrennt (Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f/f). Die Urothelzellen werden ex vivo mit Adenovirus-Cre transduziert, das von einem CMV-Promotor (Ad5CMVCre) angetrieben wird. Die transduzierten Blasenorganoide werden in vitro und in vivo kultiviert, vermehrt und charakterisiert. Die PCR wird verwendet, um Gendeletionen in Trp53, Pten und Rb1 zu bestätigen. Die Immunfluoreszenz-Färbung (IF) von Organoiden zeigt eine positive Expression von Urothellinienmarkern (CK5 und p63). Die Organoide werden subkutan in Wirtsmäuse injiziert, um Tumorexpansion und serielle Passagen zu erhalten. Die Immunhistochemie (IHC) von Xenotransplantaten zeigt eine positive Expression von CK7, CK5 und p63 und eine negative Expression von CK8 und Uroplakin 3. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Adenovirus-vermittelte Gendeletion aus Urothelzellen der Maus, die mit loxP-Stellen manipuliert wurden, eine effiziente Methode ist, um das tumorigene Potenzial definierter genetischer Veränderungen schnell zu testen.

Der Arbeitsablauf von Adenovirus-Cre-vermittelten Gendeletionen in Urothelzellen der Maus ist in Abbildung 1A dargestellt. Das dazugehörige Video zeigt, wie die Urothelzellen vom Fundus der Blase getrennt werden und wie die dreifach floxierten Zellen ex vivo mit Ad5CMVCre transduziert werden. Abbildung 1A zeigte, dass minimale Submukosen und Muskelzellen nach der Enzymverdauung dissoziiert wurden. Um die Effizienz der Adenovirus-Cre-Abgabe zu bestätig...

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Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Erzeugung und Charakterisierung von Urothelorganoiden der Maus, die Deletionen in interessanten Genen beherbergen. Die Methoden umfassen die Gewinnung von Maus-Urothelzellen, die Ex-vivo-Transduktion mit Adenovirus-treibender Cre-Expression mit einem CMV-Promotor sowie die In-vitro- sowie In-vivo-Charakterisierung.

Ex vivo Organoid-Modell von Adenovirus-Cre-vermittelten Gendeletionen in Urothelzellen der Maus

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Wir haben ein schnelles und effizientes Protokoll entwickelt, um Blasenkrebs-Organoide durch Ex-vivo-Gen-Editing von normalen Maus-Urothelzellen, die floxierte Allele in interessanten Genen tragen, zu erzeugen. Diese Ex-vivo-Methode hat einen ein- bis zweiwöchigen Workflow anstelle von jahrelanger Mauszucht und ist hocheffizient in der Adenovirus-Transduktion auf den Cre-vermittelten Gendeletionen. Bereiten Sie zunächst alle sterilen Instrumente und Reagenzien vor, einschließlich Schere, Pinzette, DPBS in 35-Milliliter-Kulturgeschirr, 70% Ethanol, Gaze und saubere Papierhandtücher.Als nächstes reinigen Sie alle Oberflächen des Sezierbereichs und bedecken Sie den Dissektionsbereich mit einem sauberen Papiertuch. Legen Sie die eingeschläferte Maus auf die Gaze im Dissektionsbereich und sprühen Sie 70% Ethanol auf den Bauch der Maus, dann mit einer sterilen Dissektionsschere, machen Sie einen Bauchschnitt in der unteren Mittellinie, um die Blase freizulegen. Verwenden Sie nun die Pinzette, um die Blase zu greifen und vorsichtig hochzuziehen, um die bilaterale ureterovesische Verbindung zu identifizieren.Entfernen Sie mit einer Schere den Blasenfundus, folgen Sie der Grenzlinie zwischen den beiden Harnleiteröffnungen und geben Sie die Blase in eine sterile Schale mit 2 Millilitern DPBS, entfernen Sie dann das Fett- und Bindegewebe und geben Sie die Blase in eine neue Schale mit 2 Millilitern DPBS. Entfernen Sie auch das Adenovirus aus dem minus 80 Grad Celsius großen Speicher und halten Sie es auf Eis. Bereiten Sie für die Zelldissoziation alle sterilen Instrumente und Reagenzien wie im Manuskript beschrieben vor, geben Sie dann in einer Biosicherheitskabine die Blase in eine 35-Millimeter-Schüssel und waschen Sie sie mit 2 Millilitern sterilem DPBS.Sammeln Sie das Blasengewebe von vier Mäusen in einer Schale mit einem Milliliter vollständigem Kulturmedium ohne kohlebefreites FBS. Als nächstes zerkleinern Sie mit einer chirurgischen Klinge jede Blase in vier gleiche Stücke, dann entfalten Sie mit einer Pinzette die Blase, um die Urotheloberfläche dem Medium auszusetzen. Blasenstücke und Medium in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben.Waschen Sie die Schüssel zweimal mit 2 Millilitern komplettem Kulturmedium ohne kohleabgestreiftes FBS und geben Sie die Wäsche in das Zentrifugenröhrchen, wodurch das Gesamtvolumen auf 5 Milliliter erhöht wird. Als nächstes fügen Sie eine Kollagenase- und Hyaluronidase-Mischung hinzu und legen Sie die Tube horizontal in einen 37-Grad-Celsius-Orbitalschüttler-Inkubator für 30 Minuten bei 200 U / min. Nach der Gewebeverdauung ein gleiches Volumen von 10% mit Holzkohle abgestreiftes FBS und DPBS in das Röhrchen geben und 5 Minuten lang bei 200 x g zentrifugieren.Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, fügen Sie 2 Milliliter Trypsinersatz in das Zellpellet hinzu und mischen Sie gut, dann inkubieren Sie die Tube bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 4 Minuten. Nach der Inkubation pipettieren Sie die Zellen 10 Mal mit einer Standard-P1000-Spitze auf und ab und fügen Sie 5 Milliliter 10% kohlebelichtetes FBS und DPBS hinzu. Belasten Sie die dissoziierten Zellen durch ein 100 Mikrometer langes steriles Zellsieb und sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50-Milliliter-Röhrchen.Die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen geben und 5 Minuten lang 200 mal g zentrifugieren. Nach dem Entfernen des Überstands das Pellet in 1 Milliliter komplettem Kulturmedium resuspendieren. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer und einer Platte 0,5 mal 10 bis zu den 6. Zellen in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 0,5 Millilitern frischem Vollkulturmedium.Als nächstes nehmen Sie die Matrixextrakte der Engelbreth-Holm-Swarm-Maussarkomzellen aus minus 20 Grad Celsius Speicher heraus und tauen sie auf Eis auf. Wärmen Sie auch eine 6-Well-Platte in einem 37-Grad-Celsius-Zellinkubator vor. Für die adenovirale Transduktion fügen Sie 2 Mikroliter Adenovirus in die 24-Well-Platte hinzu und mischen Sie gut mit den dissoziierten Urothelzellen.Um die Transduktionseffizienz zu erhöhen, führen Sie die Spinokulation durch, indem Sie die Platte 30 Minuten lang bei 300 x g zentrifugieren und dann die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 1 Stunde inkubieren. Zellen und Medium aus der Vertiefung in ein 15-Milliliter-Röhrchen und Zentrifuge bei 200 mal g für 5 Minuten überführen. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, fügen Sie 50 Mikroliter komplettes Kulturmedium hinzu und mischen Sie gut mit den Zellen am Boden.Als nächstes fügen Sie 140 Mikroliter Matrixextrakt hinzu und mischen Sie vorsichtig gut, um Luftblasen zu vermeiden, und erstellen Sie dann Kuppeln für Organoide, indem Sie schnell 50 Mikroliter der Lösung pro Kuppel in die vorgewärmte 6-Well-Platte geben. Inkubieren Sie die Platte und lassen Sie die Kuppeln für 5 Minuten erstarren. Nach 5 Minuten drehen Sie die 6-Well-Platte auf den Kopf und erstarren Sie weitere 25 Minuten.Nach der Inkubation fügen Sie 2,5 Milliliter vollständiges Kulturmedium zu jeder Vertiefung hinzu und legen Sie die Platte in einen Inkubator für Organoidkultur. Das grün fluoreszierende Protein wurde in fast 100% der Zellen nachgewiesen, was auf eine hohe Effizienz der Adenovirus-Transduktion hindeutet. Hämatoxylin- und Eosinfärbung und Immunhistochemie von Triple-Knockout-Organoid-Tumoren zeigten die Morphologie hochgradiger Urothelkarzinome mit positiver Proteinexpression von basalen Subtypmarkern von CK5 und p63.Die nicht rekombinierten floxierten Allele wurden in Urothelzellen nachgewiesen, die nicht mit Adenovirus behandelt wurden, während die rekombinierten Allele in den dreifachen Knockout-Organoiden beobachtet wurden. Im Allgemeinen wurden 2 bis 3 Wochen benötigt, um einen 2 Zentimeter großen subkutanen Tumor zu bilden. Die Immunhistochemie von Triple-Knockout-Organoiden, in vivo Xenotransplantaten, zeigte eine positive Expression von CK7-, CK5- und p63-Proteinen.Negative Expression wurde für CK8- und Uroplakin-Proteine nachgewiesen. Der Mesenchymmarker Vimentin wurde nur in der Tumorkapsel oder im Stroma nachgewiesen. Die Dissoziation der Mausblase darf 30 Minuten nicht überschreiten.Eine längere Dissoziationszeit kann den Prozentsatz der Stromazellen, wie Endothelzellen und die Fibroblasten, erhöhen Dieser Ansatz kann mit der Zellsortierung oder dem Zelltyp eines spezifischen Adenovirus kombiniert werden, um den Zelltyp spezifischer Organoide zu erzeugen, wie Lumen versus Basalorganoide.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Forschung

Krebsforschung

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen in einem orthotopischen Mausmodell des Darmkrebses

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR-Bewertung der pH, pO2, Redox-Status, und Konzentrationen von Phosphat und Glutathion in der Tumor-Mikroumgebung

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Eine präklinische Mausmodell der Osteosarkom, die extrazelluläre Vesikel-vermittelter Kommunikation zwischen Tumor und mesenchymalen Stammzellen zu definieren

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses für Tumor-gezielte Immunmodulation: Gestaltung und Evaluation Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Dreidimensionale extrazelluläre Matrix Knochenmodell für Osteosarkom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Bewertung der Differenzierungskapazität von Mausprostataepithelzellen mithilfe der organoiden Kultur

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Ein Ex-vivo-Gehirnschnittmodell zur Untersuchung und Bekämpfung des metastasierenden Tumorwachstums von Brustkrebs im Gehirn

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Definition von Genfunktionen in der Tumorgenese durch Ex-vivo-Ablation von Flox-Allelen in bösartigen peripheren Nervenscheidentumorzellen

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Erhaltung der zellulären Vielfalt des menschlichen Glioblastoms ex vivo unter Verwendung dreidimensionaler Organoidkultur

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...