Name: ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells at JoVE.com

עבודת מחקר זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי NIH, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 ו- R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (מענק תמיכת ליבה של מרכז הסרטן NCI), קרן הברית של רוזוול פארק וקרן הידידים של אורולוגיה. אנו מודים למריסה בלאסק ולמילה פאחומובה על ההגהה של כתב היד.

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במרכז הסרטן המקיף רוזוול פארק, באפלו, ניו יורק (1395M, בטיחות ביולוגית 180501 ו- 180502). הערה: בצע את שלבים 1-3 באותו יום.
1. כריתה של שלפוחית השתן של העכבר
<ol><li>הכנה לנתיחה<ol>
<li>הכינו את כל המכשירי?...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2021.">Cancer statistics, 2021.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+bladder+cancer+research.">Preclinical models for bladder cancer research.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).</li><li>DeGraff, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+preclinical+models+for+the+advancement+of+translational+bladder+cancer+research.">Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).</li><li>Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+treatment+landscape+of+advanced+urothelial+carcinoma.">The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma.</a> Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).</li><li>Mullenders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+human+urothelial+cancer+organoids:+A+tool+for+bladder+cancer+research.">Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).</li><li>Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+bladder+cancer+in+mice:+opportunities+and+challenges.">Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).</li><li>Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mouse+models+in+oncology+research+and+cancer+medicine.">Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Fujii, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+histopathological+evaluation+of+organoids.">A simple method for histopathological evaluation of organoids.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).</li><li>Georgas, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+illustrated+anatomical+ontology+of+the+developing+mouse+lower+urogenital+tract.">An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract.</a> Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).</li><li>Santos, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+organoids+originating+from+Cd49f(high)+mouse+stem+cells+display+Notch-dependent+differentiation+capacity.">Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity.</a> Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+defined+disease+model+reveals+that+urothelial+cells+can+initiate+divergent+bladder+cancer+phenotypes.">A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intertumoral+heterogeneity+in+SCLC+is+influenced+by+the+cell+type+of+origin.">Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin.</a> Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).</li><li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer:+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung.">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li><li>Bottger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+heterogeneity+underlies+differential+cisplatin+sensitivity+in+mouse+models+of+small-cell+lung+cancer.">Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer.</a> Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).</li><li>Puzio-Kuter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+p53+and+Pten+promotes+invasive+bladder+cancer.">Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer.</a> Genes &amp; Development. 23 (6), 675-680 (2009).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mouse+models+of+bladder+cancer+identify+a+prognostic+signature+associated+with+risk+of+disease+progression.">Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression.</a> Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).</li><li>Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+genetic+removal+of+signaling+molecules+in+cultured+primary+mouse+embryonic+fibroblasts.">Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).</li><li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+interrogation+of+cancer+cell+of+origin+through+CRISPR+editing.">Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).</li></ol>

GEMMs היו תקני הזהב למודלים סרטניים שיזמו מתאים רגילים, ואפשרו לבחון בקפדנות את ההשלכות של הפרעות אונקוגניות פוטנציאליות (הפעלת אונקוגן ו/או אובדן מדכאי גידולים). כאן, פרוטוקול מהיר ויעיל מסופק ליצירת אורגנואידים של סרטן שלפוחית השתן באמצעות עריכת גנים ex vivo של תאי אורותל עכברים רגילים ?...

סרטן שלפוחית השתן הוא הסרטן הרביעי בשכיחותו בקרב גברים ומשפיע על יותר מ -80,000 אנשים מדי שנה בארצות הברית1. כימותרפיה מבוססת פלטינום היא הטיפול הסטנדרטי בחולים עם סרטן שלפוחית שתן מתקדם במשך יותר משלושה עשורים. הנוף של הטיפול בסרטן שלפוחית השתן עבר מהפכה על ידי אישור מינהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) לאחרונה לאימונותרפיה (מעכבי מחסום חיסוני נגד PD-1 ואנטי PD-L1), ארדפיטניב (מעכב קולטן גורם גדילה פיברובלסט) ואנפורטומאב ודוטין (מצומד נוגדן-תרופה)2,3,4. עם זאת, אין סמנים ביולוגיים מאושרים קלינית זמינים לניבוי התגובות לכימותרפיה או אימונותרפיה. יש צורך קריטי ליצור מודלים פרה-קליניים אינפורמטיביים שיכולים לשפר את ההבנה של המנגנונים המניעים את התקדמות סרטן שלפוחית השתן ולפתח סמנים ביולוגיים חזויים עבור שיטות טיפול שונות.
מכשול מרכזי במחקר התרגומי של שלפוחית השתן הוא היעדר מודלים פרה-קליניים המשחזרים את הפתוגנזה של סרטן שלפוחית השתן האנושית ואת תגובות הטיפול 5,6. פותחו מספר מודלים פרה-קליניים, כולל מודלים דו-ממדיים במבחנה (קווי תאים או תאים שתוכנתו מחדש באופן מותנה), מודלים תלת-ממדיים במבחנה (אורגנואידים, הדפסה תלת-ממדית) ומודלים in vivo (קסנוגרפט, מודלים המושרים על-ידי מסרטן, מודלים מהונדסים גנטית וקסנוגרפט שמקורו בחולה)2,6. מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMMs) שימושיים ליישומים רבים בביולוגיה של סרטן שלפוחית השתן, כולל ניתוחים של פנוטיפים של גידולים, חקירות מכניסטיות של גנים מועמדים ו/או מסלולי איתות, והערכה פרה-קלינית של תגובות טיפוליות 6,7. GEMMs יכולים להשתמש ברקומבינאזות ספציפיות לאתר (Cre-loxP) כדי לשלוט במחיקות גנטיות בגן מדכא גידול אחד או יותר. התהליך של יצירת GEMMs רצויים עם מחיקות גנים מרובות הוא גוזל זמן רב, מייגע ויקר5. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לפתח שיטה מהירה ויעילה של העברת ex vivo Cre לביסוס מודלים של נוקאאוט משולש בשלפוחית השתן (TKO) מתאי אורותל עכברים רגילים הנושאים אללים משולשים (Trp53, Pten ו- Rb1)8. היתרון העיקרי של שיטת ex vivo הוא זרימת העבודה המהירה (1-2 שבועות במקום שנים של גידול עכברים). מאמר זה מתאר את הפרוטוקול לקצירת תאי אורותל רגילים עם אללים פלוקסים, התמרת אדנו-וירוס ex vivo, תרביות אורגנואידיות ואפיון in vitro ו-in vivo בעכברי C57 BL/6J אימונו-תחרותיים. ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי ליצור אורגנואידים רלוונטיים מבחינה קלינית לסרטן שלפוחית השתן בעכברים מדוכאי חיסון עם כל שילוב של אללים פלוקסים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#956;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 1.5 inches needle</td>
			<td>EXELINT International</td>
			<td>26406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)</td>
			<td>UI Viral Vector Core</td>
			<td>VVC-U of Iowa-5-HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57 BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal-stripped FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine substitute (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mammary Epithelial Cell Growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix extracts from Engelbreth&#8211;Holm&#8211;Swarm mouse sarcomas (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M7019</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK7</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-23876</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab735</td>
			<td>IHC 1:100, IF 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Upk3</td>
			<td>Fitzgerald</td>
			<td>10R-U103A</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Vimentin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-6260</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal rat anti-CK8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-s</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell vios 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51033557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal chicken anti-CK5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td>IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signature benchtop shaking incubator Model 1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td>35962-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Processing Gel (HistoGel)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade size 10</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall T1 centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells

סרטן שלפוחית השתן הוא תחום לא מבוקר, במיוחד במודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMMs). GEMMs גזעיים עם אתרי Cre ו-loxP ספציפיים לרקמות היו תקני הזהב למיקוד גנים מותנה או בלתי ניתן להשראה. כדי לספק מודלים ניסיוניים מהירים ויעילים יותר, מפותחת מערכת תרבית אורגנואידית ex vivo באמצעות אדנו-וירוס Cre ותאי אורותל רגילים הנושאים אללים מרובים של loxP של מדכאי הגידול Trp53, Pten ו - Rb1. תאי אורותל רגילים מנותקים באופן אנזימטי מארבע שלפוחיות של עכברים משולשים (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). תאי האורותל מומרים ex vivo עם אדנו-וירוס-Cre המונע על ידי מקדם CMV (Ad5CMVCre). האורגנואידים המתומרים של שלפוחית השתן מתורבתים, מופצים ומאופיינים במבחנה וב-in vivo. PCR משמש לאישור מחיקות גנים ב- Trp53, Pten ו- Rb1. צביעה אימונופלואורסצנטית (IF) של אורגנואידים מדגימה ביטוי חיובי של סמני שושלת אורותל (CK5 ועמ' 63). האורגנואידים מוזרקים באופן תת עורי לעכברים מארחים לצורך הרחבת הגידול ומעברים סדרתיים. האימונוהיסטוכימיה (IHC) של קסנוגרפטים מציגה ביטוי חיובי של CK7, CK5 ועמ' 63 וביטוי שלילי של CK8 ואורופלקין 3. לסיכום, מחיקת גנים בתיווך אדנו-וירוס מתאי אורותל של עכברים המהונדסים עם אתרי loxP היא שיטה יעילה לבחון במהירות את הפוטנציאל הגידולי של שינויים גנטיים מוגדרים.

זרימת העבודה של מחיקות גנים בתיווך אדנו-וירוס-Cre בתאי אורותל של עכברים מוצגת באיור 1A. הסרטון הנלווה מדגים כיצד תאי השתן מנותקים מהפונדוס של שלפוחית השתן וכיצד התאים המשולשים של פלוקס מומרים ex vivo עם Ad5CMVCre. איור 1A הראה כי תת-מולקולות ותאי שריר מינימליים ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells at JoVE.com

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

פרוטוקול זה מתאר את תהליך הייצור והאפיון של אורגנואידים אורותליאליים של עכברים, תוך מחיקות בגנים בעלי עניין. השיטות כוללות קצירת תאי אורותל של עכבר, התמרת ex vivo עם אדנו-וירוס המניע את ביטוי Cre עם מקדם CMV, ואפיון in vitro כמו גם in vivo .

אקס ויוו מודל אורגנואידי של מחיקות גנים בתיווך אדנו-וירוס-Cre בתאי אורותל של עכבר

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

פיתחנו פרוטוקול מהיר ויעיל ליצירת אורגנואידים של סרטן שלפוחית השתן באמצעות עריכת גנים ex vivo של תאי אורותל רגילים של עכברים הנושאים אללים מטושטשים בגנים בעלי עניין. לשיטת ex vivo זו יש זרימת עבודה של שבוע עד שבועיים במקום שנים של גידול עכברים, והיא יעילה מאוד בהתמרת אדנו-וירוס במחיקת גנים בתיווך Cre. כדי להתחיל, הכינו את כל המכשירים והריאגנטים הסטריליים, כולל מספריים, מלקחיים, DPBS במנות תרבית של 35 מיליליטר, 70% אתנול, גזה ומגבות נייר נקיות.לאחר מכן, נקו את כל המשטחים של אזור הנתיחה וכסו את אזור הנתיחה במגבת נייר נקייה. מניחים את העכבר המתת החסד על הגזה באזור הנתיחה ומרססים 70% אתנול על בטנו של העכבר, ולאחר מכן משתמשים במספריים כריתה סטריליים, מבצעים חתך בטן בקו האמצע התחתון כדי לחשוף את שלפוחית השתן. כעת, השתמשו במלקחיים כדי לתפוס ולמשוך בעדינות את שלפוחית השתן כדי לזהות את צומת השופכן הדו-צדדי.באמצעות מספריים, מסירים את פונדוס שלפוחית השתן, עוקבים אחר קו הגבול בין שני פתחי השופכן ומעבירים את שלפוחית השתן לתוך צלחת סטרילית המכילה 2 מיליליטרים של DPBS, ואז מסירים את רקמת השומן והחיבור ומכניסים את שלפוחית השתן לתוך צלחת חדשה המכילה 2 מיליליטרים של DPBS. כמו כן, הסר את האדנו-וירוס מאחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס ושמור אותו על הקרח. לצורך דיסוציאציה של תאים, הכינו את כל המכשירים והריאגנטים הסטריליים כמתואר בכתב היד, ולאחר מכן בארון בטיחות ביולוגית, העבירו את שלפוחית השתן לצלחת של 35 מילימטר ושטפו עם 2 מיליליטרים של DPBS סטרילי.אספו רקמות שלפוחית שתן מארבעה עכברים לתוך צלחת עם מיליליטר אחד של מדיום תרבית שלם ללא FBS מופשט פחם. לאחר מכן, באמצעות להב כירורגי, לדחוס כל שלפוחית שתן לארבעה חלקים שווים, ולאחר מכן באמצעות מלקחיים, לפתוח את שלפוחית השתן כדי לחשוף את פני השטח של אורותליום למדיום. מעבירים את חלקי שלפוחית השתן ואת המדיום לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר.שטפו את התבשיל פעמיים עם 2 מיליליטרים של מדיום תרבית שלם ללא FBS מופשט פחם והוסיפו את הכביסה לצינור הצנטריפוגה, מה שמביא את הנפח הכולל ל-5 מיליליטרים. לאחר מכן, הוסיפו תערובת קולגן והיאלורונידאז והניחו את הצינור אופקית באינקובטור שייקר אורביטלי של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב-200 סל"ד. לאחר עיכול רקמות, הוסיפו נפח שווה של 10% FBS ו-DPBS מופשטים מפחם לתוך הצינור וצנטריפוגה ב-200 פעמים גרם למשך 5 דקות.לאחר השלכת הסופרנאטנט, מוסיפים 2 מיליליטרים של תחליף טריפסין לכדור התא ומערבבים היטב, ואז מדגרים את הצינור ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 4 דקות. לאחר הדגירה, פיפט את התאים למעלה ולמטה 10 פעמים עם קצה P1000 סטנדרטי ולהוסיף 5 מיליליטרים של 10% FBS ו- DPBS מופשטים מפחם. מסננים את התאים המנותקים דרך מסננת תאים סטרילית של 100 מיקרומטר ואוספים את תרחיף התא בצינור של 50 מיליליטר.מעבירים את מתלי התא לצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-200 פעמים גרם למשך 5 דקות. לאחר הסרת הסופרנאטנט, החייאת הכדור ב 1 מיליליטר של מדיום תרבית שלם. ספרו את מספר התאים באמצעות המוציטומטר וצלחת 0.5 פעמים 10 עד 6 לתוך כל באר של צלחת של 24 בארות עם 0.5 מיליליטר של מדיום תרבית שלמה ורענן.לאחר מכן, הוציאו את תמציות המטריצה של תאי סרקומה של עכבר אנגלברת-הולם-נחיל מאחסון מינוס 20 מעלות צלזיוס והפשירו אותם על קרח. כמו כן, מחממים מראש צלחת של 6 בארות באינקובטור תאים של 37 מעלות צלזיוס. עבור התמרה אדנו-ויראלית, הוסיפו 2 מיקרוליטרים של אדנו-וירוס לתוך הצלחת בת 24 הבארות וערבבו היטב עם תאי האורותל המנותקים.כדי לשפר את יעילות ההתמרה, בצע ספינוקולציה על ידי צנטריפוגה של הצלחת ב-300 פעמים גרם למשך 30 דקות, ולאחר מכן הדגירה של הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך שעה אחת. מעבירים תאים ואמצעיים מהבאר לתוך צינור וצנטריפוגה של 15 מיליליטר ב-200 פעמים גרם למשך 5 דקות. לאחר השלכת ה-supernatant, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של מדיום תרבית שלם וערבבו היטב עם התאים בתחתית.לאחר מכן, הוסיפו 140 מיקרוליטרים של תמצית מטריצה וערבבו בעדינות היטב כדי להימנע מבועות אוויר, ואז צרו כיפות לאורגנואידים על ידי הוספה מהירה של 50 מיקרוליטרים של התמיסה לכל כיפה לתוך לוחית 6 הקידוחים שתוכננה מראש. דוגרים את הצלחת ומאפשרים לכיפות להתמצק במשך 5 דקות. לאחר 5 דקות, הפכו את צלחת 6 הבאר במהופך והמשיכו להתמצק במשך 25 דקות נוספות.לאחר הדגירה, מוסיפים 2.5 מיליליטרים של מדיום תרבית שלם לכל באר ומניחים את הצלחת באינקובטור לתרבית אורגנואידית. החלבון הפלואורסצנטי הירוק זוהה בכמעט 100% מהתאים, מה שמרמז על יעילות גבוהה של התמרת אדנו-וירוס. צביעת המטוקסילין ואאוזין ואימונוהיסטוכימיה של גידולי אורגנואידים משולשים של נוקאאוט הראו את המורפולוגיה של קרצינומה אורותליאלית בדרגה גבוהה עם ביטוי חלבון חיובי של סמני תת-סוג בסיסיים של CK5 ו-p63.האללים הלא-רקומבינים של פלוקס זוהו בתאי אורותל, שלא טופלו באמצעות אדנו-וירוס, בעוד שהאללים הרקומבינציה נצפו באורגנואידים המשולשים של הנוקאאוט. באופן כללי, 2 עד 3 שבועות היו נחוצים כדי ליצור גידול תת עורי 2 ס"מ. האימונוהיסטוכימיה של אורגנואידים בעלי נוקאאוט משולש, in vivo xenografts, הציגה ביטוי חיובי של חלבוני CK7, CK5 ו-p63.ביטוי שלילי זוהה עבור חלבוני CK8 ואורופלקין. סמן המזנכים, וימנטין, זוהה רק בקפסולת הגידול או בסטרומה. הדיסוציאציה של שלפוחית השתן של העכבר לא תעלה על 30 דקות.זמן דיסוציאציה ארוך יותר עשוי לגדול באחוז תאי הסטרומה, כגון תאי אנדותל ופיברובלסטים גישה זו יכולה להיות משולבת עם מיון תאים או סוג תא אדנווירוס מסוים כדי ליצור את סוג התא של אורגנואידים ספציפיים, כגון לומן לעומת אורגנואידים בסיסיים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

בידוד של תאים סרטניים במחזור מודל עכבר אורתופטי של סרטן המעי הגס

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

אין ויוו הערכת EPR pH, pO2, מצב חמצון-חיזור, ואת ריכוזים של פוספט גלוטתיון ב Microenvironment הגידול

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

דגם פרה העכבר של אוסטאוסרקומה כדי להגדיר את התקשורת חוץ-תאית שלפוחית בתיווך בין גידול בתאי גזע Mesenchymal

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses עבור Immunomodulation, ממוקדות הגידול: הערכה לשעבר Vivo ועיצוב

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

עצם תלת-ממדי מטריצה חוץ-תאית מודל אוסטאוסרקומה

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

הערכת יכולת בידול של העכבר תאים אפיתל הערמונית באמצעות תרבות אורגאיד

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

מודל פרוסת מוח Ex Vivo כדי לחקור ולמקד את צמיחת הגידול הגרורתי של סרטן השד במוח

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

הגדרת תפקודי גנים בגידולים סרטניים על ידי אבלציה Ex vivo של אללים פלוקסים בתאי גידול מעטפת עצב היקפית ממאירה

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

שמירה על המגוון התאי של גליובלסטומה אנושית Ex vivo באמצעות תרבית אורגנואידית תלת-ממדית

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...