Name: ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells at JoVE.com

この研究研究は、NIH Grants、K08CA252161(Q.L.)、R01CA234162、およびR01 CA207757(D.W.G.)、P30CA016056(NCI Cancer Center Core Support Grant)、Roswell Park Alliance Foundation、Friends of Urology Foundationによって部分的に支援されました。原稿の校正をしてくれたMarisa BlaskとMila Pakhomovaに感謝します。

すべての動物処置は、ニューヨーク州バッファローのロズウェルパーク総合がんセンター(1395M、バイオセーフティ180501および180502)の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。 メモ: 手順 1 ~ 3 を同じ日に実行します。
1. マウス膀胱の解剖
<ol><li>解剖の準備<ol>
<li>はさみ、鉗子、滅菌DPBSを含むすべての滅菌器具を35 mm培養皿、70%エタノ?...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2021.">Cancer statistics, 2021.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+bladder+cancer+research.">Preclinical models for bladder cancer research.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).</li><li>DeGraff, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+preclinical+models+for+the+advancement+of+translational+bladder+cancer+research.">Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).</li><li>Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+treatment+landscape+of+advanced+urothelial+carcinoma.">The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma.</a> Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).</li><li>Mullenders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+human+urothelial+cancer+organoids:+A+tool+for+bladder+cancer+research.">Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).</li><li>Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+bladder+cancer+in+mice:+opportunities+and+challenges.">Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).</li><li>Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mouse+models+in+oncology+research+and+cancer+medicine.">Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Fujii, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+histopathological+evaluation+of+organoids.">A simple method for histopathological evaluation of organoids.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).</li><li>Georgas, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+illustrated+anatomical+ontology+of+the+developing+mouse+lower+urogenital+tract.">An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract.</a> Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).</li><li>Santos, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+organoids+originating+from+Cd49f(high)+mouse+stem+cells+display+Notch-dependent+differentiation+capacity.">Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity.</a> Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+defined+disease+model+reveals+that+urothelial+cells+can+initiate+divergent+bladder+cancer+phenotypes.">A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intertumoral+heterogeneity+in+SCLC+is+influenced+by+the+cell+type+of+origin.">Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin.</a> Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).</li><li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer:+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung.">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li><li>Bottger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+heterogeneity+underlies+differential+cisplatin+sensitivity+in+mouse+models+of+small-cell+lung+cancer.">Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer.</a> Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).</li><li>Puzio-Kuter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+p53+and+Pten+promotes+invasive+bladder+cancer.">Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer.</a> Genes &amp; Development. 23 (6), 675-680 (2009).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mouse+models+of+bladder+cancer+identify+a+prognostic+signature+associated+with+risk+of+disease+progression.">Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression.</a> Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).</li><li>Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+genetic+removal+of+signaling+molecules+in+cultured+primary+mouse+embryonic+fibroblasts.">Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).</li><li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+interrogation+of+cancer+cell+of+origin+through+CRISPR+editing.">Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).</li></ol>

GEMMは、正常細胞から開始されたがんモデリングのゴールドスタンダードであり、潜在的な発癌性摂動(がん遺伝子の活性化および/または腫瘍抑制因子の喪失)の結果を厳密に試験することを可能にする。ここでは、目的の遺伝子にフロックス化対立遺伝子を担持する正常マウス尿路上皮細胞のエクスビボ遺伝子編集を介して膀胱癌オルガノイドを生成するための迅速かつ効率的なプロト...

膀胱がんは男性で4番目に多いがんであり、米国では毎年8万人以上が罹患しています1。プラチナベースの化学療法は、30年以上にわたり進行膀胱がん患者の標準的な治療となってきました。膀胱がん治療の展望は、免疫療法(抗PD-1および抗PD-L1免疫チェックポイント阻害剤)、エルダフィチニブ(線維芽細胞増殖因子受容体阻害剤)、およびエンフォルツマブベドチン(抗体薬物複合体)の最近の食品医薬品局(FDA)の承認によって革命をもたらしました2,3,4。しかし、化学療法または免疫療法に対する応答を予測するために臨床的に承認されたバイオマーカーは利用できない。膀胱がんの進行を駆動するメカニズムの理解を改善し、さまざまな治療モダリティの予測バイオマーカーを開発できる有益な前臨床モデルを生成することが非常に重要です。
膀胱トランスレーショナル研究における大きな障害は、ヒト膀胱癌の病因と治療応答を再現する前臨床モデルの欠如である5,6。インビトロ2Dモデル(細胞株または条件付きリプログラム細胞)、インビトロ3Dモデル(オルガノイド、3Dプリンティング)、インビボモデル(異種移植片、発がん性物質誘導モデル、遺伝子操作モデル、および患者由来異種移植片)を含む複数の前臨床モデルが開発されている2,6。遺伝子操作マウスモデル(GEMM)は、腫瘍表現型の解析、候補遺伝子および/またはシグナル伝達経路の機構的調査、および治療応答の前臨床評価など、膀胱癌生物学における多くの用途に有用である6,7。GEMMは、部位特異的リコンビナーゼ(Cre-loxP)を利用して、1つ以上の腫瘍抑制遺伝子における遺伝子欠失を制御することができる。複数の遺伝子欠失を伴う所望のGEMMを生成するプロセスは、時間がかかり、面倒で、高価である5。この方法の全体的な目標は、トリプルフロックス対立遺伝子(Trp53、Pten、およびRb1)を有する正常マウス尿路上皮細胞から膀胱トリプルノックアウト(TKO)モデルを確立するためのエクスビボCre送達の迅速かつ効率的な方法を開発することである8。エクスビボ法の主な利点は、迅速なワークフロー(マウスの繁殖の年の代わりに1〜2週間)です。この記事では、免疫適格C57 BL/6Jマウスにおいて、フロックス化対立遺伝子、エキソビボアデノウイルス形質導入、オルガノイド培養、およびインビトロおよびインビボ特性評価を有する正常な尿路上皮細胞を採取するためのプロトコルについて説明します。この方法はさらに、フロックス対立遺伝子の任意の組み合わせを保有する免疫適格マウスにおいて臨床的に関連する膀胱癌オルガノイドを生成するために使用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#956;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 1.5 inches needle</td>
			<td>EXELINT International</td>
			<td>26406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)</td>
			<td>UI Viral Vector Core</td>
			<td>VVC-U of Iowa-5-HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57 BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal-stripped FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine substitute (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mammary Epithelial Cell Growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix extracts from Engelbreth&#8211;Holm&#8211;Swarm mouse sarcomas (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M7019</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK7</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-23876</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab735</td>
			<td>IHC 1:100, IF 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Upk3</td>
			<td>Fitzgerald</td>
			<td>10R-U103A</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Vimentin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-6260</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal rat anti-CK8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-s</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell vios 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51033557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal chicken anti-CK5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td>IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signature benchtop shaking incubator Model 1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td>35962-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Processing Gel (HistoGel)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade size 10</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall T1 centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells

膀胱がんは、特に遺伝子組み換えマウスモデル(GEMM)において、研究が不十分な領域である。組織特異的なCreおよびloxP部位を有する近交系GEMMは、条件付きまたは誘導性遺伝子標的化のゴールドスタンダードとなっています。より迅速で効率的な実験モデルを提供するために、アデノウイルスCreおよび腫瘍抑制因子Trp53、Pten、およびRb1の複数のloxP対立遺伝子を有する正常な尿路上皮細胞を用いたエクスビボオルガノイド培養系が開発されている。正常な尿路上皮細胞は、トリプルフロックスマウスの4つの膀胱から酵素的に切断される(Trp53 f/f:Pten f/f:Rb1 f/f)。尿路上皮細胞は、CMVプロモーター(Ad5CMVCre)によって駆動されるアデノウイルス-Creを用いてエクスビボで形質導入される。形質導入された膀胱オルガノイドは、培養され、増殖され、インビトロおよびインビボで特徴付けられる。PCRは、Trp53、Pten、およびRb1における遺伝子欠失を確認するために使用されます。オルガノイドの免疫蛍光(IF)染色は、尿路上皮系譜マーカー(CK5およびp63)の陽性発現を実証する。オルガノイドは、腫瘍拡大および連続継代のために宿主マウスに皮下注射される。異種移植片の免疫組織化学(IHC)は、CK7、CK5、およびp63の陽性発現およびCK8およびウロプラキン3の陰性発現を示す。要約すると、loxP部位で操作されたマウス尿路上皮細胞からのアデノウイルス媒介遺伝子欠失は、定義された遺伝子改変の腫瘍形成能を迅速に試験するための効率的な方法である。

マウス尿路上皮細胞におけるアデノウイルス-Cre媒介遺伝子欠失のワークフローを 図1Aに示す。添付のビデオは、尿路上皮細胞が膀胱の眼底からどのように切り離されるか、および三重フロックス細胞がAd5CMVCreを用いて エクスビボ でどのように形質導入されるかを示す。 図1Aは 、最小限の粘膜下および筋肉細胞が酵素消化後に切断されたこ...

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Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

このプロトコルは、目的の遺伝子に欠失を保有するマウス尿路上皮オルガノイドの生成および特徴付けのプロセスを記載する。この方法には、マウス尿路上皮細胞の採取、CMVプロモーターによるCre発現を駆動するアデノウイルスによるエキソビボ形質導入、およびインビトロおよびインビボ特性評価が含まれる。

エクスビボ マウス尿路上皮細胞におけるアデノウイルス-Cre媒介遺伝子欠失のオルガノイドモデル

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

我々は、目的の遺伝子にフロックス化対立遺伝子を有する正常マウス尿路上皮細胞のエクスビボ遺伝子編集を介して、膀胱癌オルガノイドを生成するための迅速かつ効率的なプロトコルを開発しました。このエクスビボ法は、何年ものマウス育種ではなく1〜2週間のワークフローを有し、Cre媒介遺伝子欠失に対するアデノウイルス形質導入において非常に効率的である。まず、はさみ、鉗子、DPBSを含むすべての滅菌器具および試薬を35ミリリットルの培養皿、70%エタノール、ガーゼ、および清潔なペーパータオルに調製する。次に、解剖領域のすべての表面を清掃し、清浄なペーパータオルで解剖領域を覆う。安楽死させたマウスを解剖領域のガーゼの上に置き、マウスの腹部に70%エタノールを噴霧し、次いで滅菌解剖ハサミを用いて、下正中線腹部切開を行い、膀胱を露出させる。次に、鉗子を使用して膀胱をつかみ、静かに引き上げて、両側尿管腫接合部を特定します。はさみを使用して、2つの尿管開口部の間の境界線に従って膀胱眼底を除去し、膀胱を2ミリリットルのDPBSを含む滅菌皿に移し、次いで脂肪および結合組織を除去し、膀胱を2ミリリットルのDPBSを含む新しい皿に入れる。また、マイナス80°Cの貯蔵庫からアデノウイルスを取り除き、氷の上に保管してください。細胞解離のために、原稿に記載されているようにすべての滅菌器具および試薬を準備し、次いでバイオセーフティキャビネット内で、膀胱を35ミリメートルの皿に移し、2ミリリットルの滅菌DPBSで洗浄する。4匹のマウスから膀胱組織を、木炭を剥ぎ取ったFBSを含まない1ミリリットルの完全培養培地を含む皿に集める。次に、外科用ブレードを用いて、各膀胱を4つの等しい部分に細かく刻み込み、次いで鉗子を用いて、膀胱を広げて尿路上皮表面を媒体に露出させる。膀胱片および培地を15ミリリットルの遠沈管に移す。木炭を剥ぎ取ったFBSを含まない2ミリリットルの完全培養液で皿を2回洗い、洗浄物を遠沈管に加え、総容量を5ミリリットルにする。次に、コラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼ混合物を添加し、チューブを37°Cの眼窩シェーカーインキュベーターに水平に置き、200RPMで30分間培養した。組織消化後、等量の10%木炭剥離FBSおよびDPBSをチューブに加え、200倍gで5分間遠心分離する。上清を捨てた後、2ミリリットルのトリプシン代替物を細胞ペレットに加え、よく混合し、次いでチューブを摂氏37度および5%二酸化炭素で4分間インキュベートする。インキュベーション後、標準のP1000チップで細胞を10回上下にピペットし、5ミリリットルの10%木炭ストリップFBSおよびDPBSを加えます。解離した細胞を100マイクロメートルの滅菌セルストレーナーを通してひずみ、細胞懸濁液を50ミリリットルのチューブに集める。細胞懸濁液を15ミリリットルチューブに移し、200倍gで5分間遠心分離する。上清を除去した後、ペレットを1ミリリットルの完全培養液に再懸濁する。血球計数器を用いて細胞数を計数し、プレートを0.5ミリリットルの新鮮な完全培養液で24ウェルプレートの各ウェルに10~6番目の細胞を10回加えた。次に、マイナス20°Cの保存からエンゲルブレス・ホルム・スウォームマウス肉腫細胞のマトリックス抽出物を取り出し、氷上で解凍する。また、6ウェルプレートを摂氏37度の細胞培養器で予備加温する。アデノウイルス形質導入のために、2マイクロリットルのアデノウイルスを24ウェルプレートに加え、解離した尿路上皮細胞とよく混合する。形質導入効果を高めるために、プレートを300倍gで30分間遠心分離し、次いでプレートを摂氏37度および5%二酸化炭素で1時間インキュベートすることによってスピノキュレーションを行う。細胞および培地をウェルから15ミリリットルのチューブに移し、200倍gで5分間遠心分離する。上清を捨てた後、50マイクロリットルの完全培養培地を加え、底部の細胞とよく混ぜる。次に、140マイクロリットルのマトリックス抽出物を加え、気泡を避けるためによく穏やかに混合し、ドームあたり50マイクロリットルの溶液を予め温めた6ウェルプレートに素早く加えることによってオルガノイドのドームを作成する。プレートをインキュベートし、ドームを5分間固化させる。5分後、6ウェルプレートを裏返し、さらに25分間固化を続けます。インキュベーション後、各ウェルに2.5ミリリットルの完全培養培地を加え、プレートをオルガノイド培養用のインキュベーターに入れます。緑色蛍光タンパク質はほぼ100%の細胞で検出され、アデノウイルスの形質導入の効率が高いことが示唆された。トリプルノックアウトオルガノイド腫瘍のヘマトキシリンおよびエオジン染色および免疫組織化学は、CK5およびp63の基底サブタイプマーカーの陽性タンパク質発現を有する高悪性度尿路上皮癌の形態を示した。非組換えフロックス対立遺伝子は、アデノウイルスで未処理の尿路上皮細胞で検出されたが、組換え対立遺伝子はトリプルノックアウトオルガノイドで観察された。一般に、2センチメートルの皮下腫瘍を形成するのに2〜3週間が必要であった。トリプルノックアウトオルガノイドの免疫組織化学は、インビボ異種移植片、CK7、CK5、およびp63タンパク質の陽性発現を示した。CK8およびウロプラキンタンパク質について陰性発現が検出された。間葉マーカーであるビメンチンは、腫瘍嚢または間質においてのみ検出された。マウス膀胱解離は30分を超えてはなりません。より長い解離時間は、内皮細胞および線維芽細胞などの間質細胞の割合において増加し得るこのアプローチは、細胞選別または細胞型特異的アデノウイルスと組み合わせて、内腔対基底オルガノイドなどの細胞型の特定のオルガノイドを生成することができる。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

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Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

オルガノイド培養を用いたマウス前立腺上皮細胞の分化能力の評価

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

乳がん脳転移性腫瘍増殖を研究し、標的とする Ex Vivo 脳スライスモデル

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

悪性末梢神経鞘腫瘍細胞におけるフロックス対立遺伝子の Ex vivo アブレーションによる腫瘍形成における遺伝子機能の定義

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

三次元オルガノイド 培養を用いたヒト 膠芽腫細胞の多様性の維持

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

エクスビボ マウス尿路上皮細胞におけるアデノウイルス-Cre媒介遺伝子欠失のオルガノイドモデル

エクスビボマウス尿路上皮細胞におけるアデノウイルス-Cre媒介遺伝子欠失のオルガノイドモデル