Name: ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells at JoVE.com

이 연구 작업은 NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 및 R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation 및 Friends of Urology Foundation이 부분적으로 지원했습니다. 원고를 교정해 주신 Marisa Blask와 Mila Pakhomova에게 감사드립니다.

모든 동물 절차는 뉴욕 버팔로의 Roswell Park Comprehensive Cancer Center의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (1395M, Biosafety 180501 및 180502)의 승인을 받았습니다. 참고: 같은 날에 1-3단계를 수행하십시오.
1. 마우스 방광의 해부
<ol><li>해부 준비<ol>
<li>가위, 포셉, 멸균 DPBS를 포함한 모든 멸균 기구를 35mm 배양 접시, 70% 에탄올, 멸균 거즈 및 깨끗한 종이 타월에 준비하...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2021.">Cancer statistics, 2021.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+bladder+cancer+research.">Preclinical models for bladder cancer research.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).</li><li>DeGraff, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+preclinical+models+for+the+advancement+of+translational+bladder+cancer+research.">Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).</li><li>Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+treatment+landscape+of+advanced+urothelial+carcinoma.">The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma.</a> Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).</li><li>Mullenders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+human+urothelial+cancer+organoids:+A+tool+for+bladder+cancer+research.">Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).</li><li>Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+bladder+cancer+in+mice:+opportunities+and+challenges.">Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).</li><li>Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mouse+models+in+oncology+research+and+cancer+medicine.">Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Fujii, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+histopathological+evaluation+of+organoids.">A simple method for histopathological evaluation of organoids.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).</li><li>Georgas, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+illustrated+anatomical+ontology+of+the+developing+mouse+lower+urogenital+tract.">An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract.</a> Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).</li><li>Santos, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+organoids+originating+from+Cd49f(high)+mouse+stem+cells+display+Notch-dependent+differentiation+capacity.">Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity.</a> Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+defined+disease+model+reveals+that+urothelial+cells+can+initiate+divergent+bladder+cancer+phenotypes.">A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intertumoral+heterogeneity+in+SCLC+is+influenced+by+the+cell+type+of+origin.">Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin.</a> Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).</li><li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer:+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung.">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li><li>Bottger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+heterogeneity+underlies+differential+cisplatin+sensitivity+in+mouse+models+of+small-cell+lung+cancer.">Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer.</a> Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).</li><li>Puzio-Kuter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+p53+and+Pten+promotes+invasive+bladder+cancer.">Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer.</a> Genes &amp; Development. 23 (6), 675-680 (2009).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mouse+models+of+bladder+cancer+identify+a+prognostic+signature+associated+with+risk+of+disease+progression.">Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression.</a> Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).</li><li>Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+genetic+removal+of+signaling+molecules+in+cultured+primary+mouse+embryonic+fibroblasts.">Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).</li><li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+interrogation+of+cancer+cell+of+origin+through+CRISPR+editing.">Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).</li></ol>

GEMM은 정상 세포에서 시작된 암 모델링의 황금 표준이었으며, 잠재적 인 종양원성 교란 (종양 유전자 활성화 및 / 또는 종양 억제제의 손실)의 결과를 엄격하게 테스트 할 수 있습니다. 여기서, 관심 유전자에 플록스된 대립유전자를 운반하는 정상 마우스 비뇨생식기 세포의 생체외 유전자 편집을 통해 방광암 오가노이드를 생성시키기 위한 신속하고 효율적인 프로토콜이 제공된다. H&E 및 IH...

방광암은 남성에서 네 번째로 흔한 암이며 미국에서 매년 80,000 명 이상의 사람들에게 영향을 미칩니다1. 백금 기반 화학 요법은 삼십 년 이상 진행성 방광암 환자를위한 치료의 표준이었습니다. 방광암 치료의 풍경은 최근 FDA (Food and Drug Administration)의 면역 요법 (항 PD-1 및 항 PD-L1 면역 체크포인트 억제제), 에르다 피티닙 (섬유 아세포 성장 인자 수용체 억제제) 및 엔포르투맙 베도틴 (항체 - 약물 접합체)2,3,4의 승인으로 혁명을 일으켰습니다. 그러나, 화학요법 또는 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위해 임상적으로 승인된 바이오마커는 이용가능하지 않다. 방광암 진행을 유도하는 메커니즘에 대한 이해를 향상시키고 다양한 치료 양식에 대한 예측 바이오마커를 개발할 수 있는 유익한 전임상 모델을 생성해야 할 절실한 필요성이 있습니다.
방광 번역 연구의 주요 장애물은 인간 방광암 발병기전과 치료 반응 5,6을 재검토하는 전임상 모델의 부족이다. 시험관내 2D 모델(세포주 또는 조건부로 재프로그램된 세포), 시험관내 3D 모델(오가노이드, 3D 프린팅) 및 생체내 모델(이종이식편, 발암물질-유도, 유전자 조작 모델 및 환자 유래 이종이식편)2,6을 포함하는 다수의 전임상 모델이 개발되었다. 유전자 조작된 마우스 모델(GEMMs)은 종양 표현형의 분석, 후보 유전자 및/또는 신호전달 경로의 기계론적 조사, 치료 반응의 전임상 평가6,7을 포함하여 방광암 생물학의 많은 응용에 유용하다. GEMMs는 하나 이상의 종양 억제 유전자에서 유전적 결실을 조절하기 위해 부위-특이적 재조합효소(Cre-loxP)를 이용할 수 있다. 여러 유전자 결실로 원하는 GEMM을 생성하는 과정은 시간이 많이 걸리고 힘들고 비용이 많이 듭니다5. 이 방법의 전반적인 목표는 삼중 플록스 대립 유전자 (Trp53, Pten, 및 Rb1)8을 운반하는 정상 마우스 비뇨 생식기 세포로부터 방광 삼중 녹아웃 (TKO) 모델을 확립하기위한 생체외 Cre 전달의 신속하고 효율적인 방법을 개발하는 것입니다. 생체 외 방법의 가장 큰 장점은 빠른 워크 플로 (수년간의 마우스 번식 대신 1-2 주)입니다. 이 글에서는 플록스 대립유전자, 생체외 아데노바이러스 형질도입, 오가노이드 배양, 면역적격 C57 BL/6J 마우스에서의 시험관내 및 생체내 특성화를 갖는 정상 비뇨생식기 세포를 수확하기 위한 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 플록스 대립 유전자의 임의의 조합을 보유하는 면역적격 마우스에서 임상적으로 관련된 방광암 오가노이드를 생성하는데 추가로 사용될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#956;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 1.5 inches needle</td>
			<td>EXELINT International</td>
			<td>26406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)</td>
			<td>UI Viral Vector Core</td>
			<td>VVC-U of Iowa-5-HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57 BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal-stripped FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine substitute (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mammary Epithelial Cell Growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix extracts from Engelbreth&#8211;Holm&#8211;Swarm mouse sarcomas (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M7019</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK7</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-23876</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab735</td>
			<td>IHC 1:100, IF 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Upk3</td>
			<td>Fitzgerald</td>
			<td>10R-U103A</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Vimentin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-6260</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal rat anti-CK8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-s</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell vios 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51033557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal chicken anti-CK5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td>IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signature benchtop shaking incubator Model 1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td>35962-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Processing Gel (HistoGel)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade size 10</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall T1 centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells

방광암은 특히 유전자 조작 마우스 모델 (GEMMs)에서 과소 연구 된 영역입니다. 조직 특이적 Cre 및 loxP 부위를 갖는 교배 GEMMs는 조건부 또는 유도성 유전자 표적화를 위한 황금 표준이었다. 보다 빠르고 효율적인 실험 모델을 제공하기 위해, 종양 억제제 Trp53, Pten 및 Rb1의 다중 loxP 대립 유전자를 운반하는 아데노바이러스 Cre 및 정상 비뇨생식기 세포를 사용하여 생체외 오가노이드 배양 시스템이 개발된다. 정상적인 비뇨생식기 세포는 삼중 플록스 마우스의 네 개의 방광으로부터 효소적으로 분리된다(Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f/f). 비뇨생식기 세포는 CMV 프로모터(Ad5CMVCre)에 의해 구동되는 아데노바이러스-Cre로 생체외로 형질도입된다. 형질도입된 방광 오가노이드는 배양되고, 전파되고, 시험관내 및 생체내에서 특성화된다. PCR은 Trp53, Pten 및 Rb1에서 유전자 결실을 확인하는 데 사용됩니다. 오가노이드의 면역형광(IF) 염색은 비뇨생식기 계통 마커(CK5 및 p63)의 양성 발현을 입증한다. 오가노이드는 종양 확장 및 연속 통과를 위해 숙주 마우스에 피하 주사된다. 이종이식편의 면역조직화학(IHC)은 CK7, CK5 및 p63의 양성 발현 및 CK8 및 우로플라킨 3의 음성 발현을 나타낸다. 요약하면, loxP 부위로 조작된 마우스 비뇨생식기 세포로부터의 아데노바이러스-매개 유전자 결실은 정의된 유전적 변경의 종양원성 잠재력을 신속하게 시험하는 효율적인 방법이다.

마우스 비뇨생식기 세포에서 아데노바이러스-Cre 매개 유전자 결실의 워크플로우를 도 1A에 나타내었다. 수반되는 비디오는 비뇨생식기 세포가 방광의 안저로부터 어떻게 분리되는지, 그리고 삼중 플록싱된 세포가 Ad5CMVCre로 생체외 에서 어떻게 형질도입되는지를 보여준다. 도 1A는 효소 소화 후 최소 점막하 및 근육 세포가 분리되었음을 보여주?...

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Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

이 프로토콜은 관심있는 유전자에 결실을 품고 있는 마우스 비뇨생식기 오가노이드의 생성 및 특성화의 과정을 기술한다. 상기 방법은 마우스 비뇨생식기 세포 수확, CMV 프로모터로 Cre 발현을 유도하는 아데노바이러스를 이용한 생체외 형질도입, 및 시험관내 및 생체외 특성화를 포함한다.

Ex Vivo 마우스 자궁 세포에서 아데노바이러스-Cre 매개 유전자 결실의 오가노이드 모델

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

우리는 관심있는 유전자에 플록스 대립 유전자를 운반하는 정상적인 마우스 비뇨 생식기 세포의 생체 외 유전자 편집을 통해 방광암 오가노이드를 생성하는 신속하고 효율적인 프로토콜을 개발했습니다. 이 생체외 방법은 수년간의 마우스 번식 대신 일주일에서 이주일의 워크플로우를 가지며, Cre 매개 유전자 결실에 대한 아데노바이러스 형질도입에 매우 효율적이다. 시작하려면 가위, 집게, DPBS를 포함한 모든 멸균 기기와 시약을 35 밀리리터 배양 접시, 70 % 에탄올, 거즈 및 깨끗한 종이 타월에 준비하십시오.다음으로, 해부 영역의 모든 표면을 청소하고 해부 영역을 깨끗한 종이 타월로 덮으십시오. 안락사 된 마우스를 해부 부위의 거즈에 놓고 마우스의 복부에 70 % 에탄올을 뿌린 다음 멸균 해부 가위를 사용하여 하부 중간 선 복부 절개를 만들어 방광을 노출시킵니다. 이제 포셉을 사용하여 방광을 잡고 부드럽게 당겨 양측 요관 접합부를 확인하십시오.가위를 사용하여 방광 안저 2 개 사이의 경계선을 따라 방광 안저부를 제거하고 방광을 DPBS 2 밀리리터가 들어있는 멸균 접시로 옮긴 다음 지방과 결합 조직을 제거하고 방광을 DPBS 2 밀리리터가 들어있는 새 접시에 넣으십시오. 또한 영하 80도 저장소에서 아데노 바이러스를 제거하고 얼음 위에 보관하십시오. 세포 해리를 위해 원고에 설명 된대로 모든 멸균 기기와 시약을 준비한 다음 생물 안전 캐비닛에서 방광을 35 밀리미터 접시로 옮기고 2 밀리리터의 멸균 DPBS로 씻으십시오.네 마리의 생쥐로부터 방광 조직을 숯을 벗긴 FBS가 없는 완전한 배양 배지 한 밀리리터가 있는 접시에 모으십시오. 다음으로, 외과 용 블레이드를 사용하여 각 방광을 네 개의 동일한 조각으로 다진 다음 포셉을 사용하여 방광을 펼쳐 요로 텔륨 표면을 매체에 노출시킵니다. 방광 조각과 배지를 15 밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다.숯을 벗긴 FBS없이 2 밀리리터의 완전한 배양 배지로 접시를 두 번 씻고 원심 분리 튜브에 세척을 추가하여 총 부피를 5 밀리리터로 가져옵니다. 다음으로, 콜라게나제와 히알루로니다아제 혼합물을 첨가하고, 튜브를 섭씨 37도 오비탈 진탕기 인큐베이터에 수평으로 놓고 200 RPM에서 30분 동안 인큐베이터에 놓는다. 조직 소화 후, 동일한 부피의 10% 숯을 벗긴 FBS와 DPBS를 튜브에 넣고 200배 g에서 5분 동안 원심분리한다.상청액을 버린 후, 2 밀리리터의 트립신 대체물을 세포 펠릿에 첨가하고 잘 섞은 다음, 튜브를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 4분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 세포를 표준 P1000 팁으로 10 번 위아래로 피펫하고 10 % 숯을 벗긴 FBS 및 DPBS 5 밀리리터를 첨가하십시오. 해리된 세포를 100-마이크로미터 멸균 세포 스트레이너를 통해 변형시키고, 세포 현탁액을 50-밀리리터 튜브에 수집한다.세포 현탁액을 15밀리리터 튜브로 옮기고 5분 동안 200배 g에서 원심분리한다. 상청액을 제거한 후, 펠렛을 1 밀리리터의 완전한 배양 배지에 재현탁시킨다. 혈구세포계 및 플레이트를 사용하여 0.5회 10회 내지 6번째 세포를 0.5 밀리리터의 신선한 완전 배양 배지와 함께 24-웰 플레이트의 각 웰에 넣고 세포 수를 계수한다.다음으로, Engelbreth-Holm-Swarm 마우스 육종 세포의 매트릭스 추출물을 영하 20도 저장에서 꺼내어 얼음 위에서 해동시킵니다. 또한 섭씨 37도 세포 배양기에서 6-웰 플레이트를 예열하십시오. 아데노바이러스 형질도입을 위해, 24웰 플레이트에 2마이크로리터의 아데노바이러스를 첨가하고, 해리된 비뇨생식기 세포와 잘 섞는다.형질도입 효능을 향상시키기 위해, 플레이트를 30분 동안 300배 g에서 원심분리하여 스핀오큘레이션을 수행한 다음, 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 5% 이산화탄소로 인큐베이션한다. 세포 및 배지를 웰로부터 15-밀리리터 튜브로 옮기고 5분 동안 200배 g에서 원심분리한다. 상청액을 버린 후, 50 마이크로리터의 완전한 배양 배지를 첨가하고 하단의 세포와 잘 섞는다.다음으로, 140 마이크로 리터의 매트릭스 추출물을 추가하고 기포를 피하기 위해 부드럽게 잘 섞은 다음 돔 당 50 마이크로 리터의 용액을 미리 데운 6 웰 플레이트에 신속하게 첨가하여 오가노이드 용 돔을 만듭니다. 플레이트를 인큐베이션하고 돔이 5 분 동안 응고되도록하십시오. 5분 후, 6-웰 플레이트를 거꾸로 뒤집고 추가로 25분 동안 응고를 계속한다.배양 후, 2.5 밀리리터의 완전한 배양 배지를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 오가노이드 배양을 위한 인큐베이터에 놓는다. 녹색 형광 단백질은 거의 100 %의 세포에서 검출되었으며, 이는 아데노 바이러스 형질도입의 높은 효율을 시사한다. 삼중 녹아웃 오가노이드 종양의 헤마톡실린 및 에오신 염색 및 면역조직화학은 CK5 및 p63의 기저 아형 마커의 양성 단백질 발현과 함께 고급 비뇨생식기 암종의 형태를 나타내었다.재조합되지 않은 플록스 대립유전자는 아데노바이러스로 처리되지 않은 비뇨생식기 세포에서 검출된 반면, 재조합된 대립유전자는 삼중 녹아웃 오가노이드에서 관찰되었다. 일반적으로, 2-센티미터 피하 종양을 형성하기 위해 2 내지 3주가 필요하였다. 생체내 이종이식편인 삼중 녹아웃 오가노이드의 면역조직화학은 CK7, CK5 및 p63 단백질의 양성 발현을 나타냈다.CK8 및 우로플라킨 단백질에 대해 음성 발현이 검출되었다. 중간엽 마커인 비멘틴은 종양 캡슐 또는 스트로마에서만 검출되었다. 마우스 방광 해리가 30분을 초과해서는 안 됩니다.더 긴 해리 시간은 내피 세포 및 섬유아세포와 같은 스트로마 세포의 백분율을 증가시킬 수 있으며, 이러한 접근법은 세포 분류 또는 세포형 특이적 아데노바이러스와 조합되어 루멘 대 기저 오가노이드와 같은 특정 오가노이드의 세포 유형을 생성할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

연구

암 연구학

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

대장 암 정위 마우스 모델에서의 순환 종양 세포의 분리

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Vivo에서 PH, pO2, 산화 환 원 상태, 고 농도의 인산 염 및 종양 Microenvironment에 티의 EPR 평가

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

종양 및 중간 엽 줄기 세포 사이의 세포 외 기 중재 통신을 정의 하는 다리의 전 임상 마우스 모델

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

종양 대상 Immunomodulation에 대 한 paramyxoviruses: 설계 및 평가 전 비보

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

다리에 대 한 3 차원 뼈 세포 외 매트릭스 모델

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

유기체 배양을 사용하여 마우스 전립선 상피 세포의 분화 능력 평가

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

유방암 뇌 전이성 종양 성장을 연구하고 표적으로 삼는 Ex Vivo 뇌 슬라이스 모델

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

악성 말초 신경 시스 종양 세포에서 Floxed 대립 유전자의 Ex vivo 절제에 의한 종양 발생에서 유전자 기능 정의

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

3차원 오가노이드 배양을 사용한 생체 외 인간 교모세포종 세포 다양성 유지

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...