Name: ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells at JoVE.com

Dette forskningsarbeidet ble delvis støttet av NIH Grants, K08CA252161(Q.L.), R01CA234162 og R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation og Friends of Urology Foundation. Vi takker Marisa Blask og Mila Pakhomova for korrekturlesing av manuskriptet.

Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY (1395M, Biosafety 180501 og 180502). MERK: Utfør trinn 1-3 på samme dag.
1. Disseksjon av museblære
<ol><li>Forberedelse til disseksjon<ol>
<li>Forbered alle sterile instrumenter, inkludert saks, tang, steril DPBS i 35 mm kulturretter, 70% etanol, steril gasbind og rene papirhåndklær. Rengjør alle overflater på disseksjon...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2021.">Cancer statistics, 2021.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+bladder+cancer+research.">Preclinical models for bladder cancer research.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).</li><li>DeGraff, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+preclinical+models+for+the+advancement+of+translational+bladder+cancer+research.">Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).</li><li>Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+treatment+landscape+of+advanced+urothelial+carcinoma.">The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma.</a> Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).</li><li>Mullenders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+human+urothelial+cancer+organoids:+A+tool+for+bladder+cancer+research.">Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).</li><li>Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+bladder+cancer+in+mice:+opportunities+and+challenges.">Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).</li><li>Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mouse+models+in+oncology+research+and+cancer+medicine.">Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Fujii, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+histopathological+evaluation+of+organoids.">A simple method for histopathological evaluation of organoids.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).</li><li>Georgas, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+illustrated+anatomical+ontology+of+the+developing+mouse+lower+urogenital+tract.">An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract.</a> Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).</li><li>Santos, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+organoids+originating+from+Cd49f(high)+mouse+stem+cells+display+Notch-dependent+differentiation+capacity.">Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity.</a> Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+defined+disease+model+reveals+that+urothelial+cells+can+initiate+divergent+bladder+cancer+phenotypes.">A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intertumoral+heterogeneity+in+SCLC+is+influenced+by+the+cell+type+of+origin.">Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin.</a> Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).</li><li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer:+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung.">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li><li>Bottger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+heterogeneity+underlies+differential+cisplatin+sensitivity+in+mouse+models+of+small-cell+lung+cancer.">Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer.</a> Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).</li><li>Puzio-Kuter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+p53+and+Pten+promotes+invasive+bladder+cancer.">Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer.</a> Genes &amp; Development. 23 (6), 675-680 (2009).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mouse+models+of+bladder+cancer+identify+a+prognostic+signature+associated+with+risk+of+disease+progression.">Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression.</a> Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).</li><li>Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+genetic+removal+of+signaling+molecules+in+cultured+primary+mouse+embryonic+fibroblasts.">Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).</li><li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+interrogation+of+cancer+cell+of+origin+through+CRISPR+editing.">Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).</li></ol>

GEMMs har vært gullstandardene for kreftmodellering initiert fra normale celler, slik at konsekvensene av potensielle onkogene perturbasjoner (oncogene aktivering og / eller tap av tumordempere) kan testes grundig. Her gis en rask og effektiv protokoll for å generere blærekreftorganoider via ex vivo genredigering av normale mus urothelialceller som bærer floxed alleler i gener av interesse. H&E- og IHC-farging viser at TKO-organoider viser histologi i samsvar med høyverdig urothelial urothelium, med squamou...

Blærekreft er den fjerde vanligste kreftformen hos menn og rammer mer enn 80.000 mennesker årlig i USA1. Platinabasert kjemoterapi har vært standarden for omsorg for pasienter med avansert blærekreft i mer enn tre tiår. Landskapet av blærekreft behandling har blitt revolusjonert av den nylige Food and Drug Administration (FDA) godkjenning av immunterapi (anti-PD-1 og anti-PD-L1 immun sjekkpunkthemmere), erdafitinib (en fibroblast vekstfaktor reseptor inhibitor) og enfortumab vedotin (en antistoff-narkotika konjugat)2,3,4. Imidlertid er ingen klinisk godkjente biomarkører tilgjengelige for å forutsi responsen på kjemoterapi eller immunterapi. Det er et kritisk behov for å generere informative prekliniske modeller som kan forbedre forståelsen av mekanismene som driver blærekreftprogresjonen og utvikle prediktive biomarkører for ulike behandlingsmodaliteter.
Et stort hinder i blæreoversettelsesforskning er mangelen på prekliniske modeller som rekapitulerer human blærekreftpatogenese og behandlingsresponser 5,6. Flere prekliniske modeller er utviklet, inkludert in vitro 2D-modeller (cellelinjer eller betinget omprogrammerte celler), in vitro 3D-modeller (organoider, 3D-utskrift) og in vivo-modeller (xenograft, kreftfremkallende, genetisk konstruerte modeller og pasientavledede xenograft)2,6. Genmodifiserte musemodeller (GEMMs) er nyttige for mange anvendelser innen blærekreftbiologi, inkludert analyser av tumorfenotyper, mekanistiske undersøkelser av kandidatgener og/eller signalveier, og den prekliniske evalueringen av terapeutiske responser 6,7. GEMMs kan bruke stedsspesifikke rekombininaer (Cre-loxP) for å kontrollere genetiske slettinger i ett eller flere tumordempergener. Prosessen med å generere ønskede GEMMs med flere genslettinger er tidkrevende, arbeidskrevende ogdyrt 5. Det overordnede målet med denne metoden er å utvikle en rask og effektiv metode for ex vivo Cre-levering for å etablere blære trippel knockout (TKO) modeller fra normale mus urothelialceller som bærer trippel floxed alleler (Trp53, Pten og Rb1)8. Den største fordelen med ex vivo-metoden er den raske arbeidsflyten (1-2 uker i stedet for år med museavl). Denne artikkelen beskriver protokollen for høsting av normale urotelceller med floxed alleler, ex vivo adenovirustransduksjon, organoide kulturer og in vitro og in vivo-karakterisering i immunokortogene C57 BL/6J-mus. Denne metoden kan videre brukes til å generere klinisk relevante blærekreftorganoider i immunompetente mus som skjuler enhver kombinasjon av floxed alleler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#956;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 1.5 inches needle</td>
			<td>EXELINT International</td>
			<td>26406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)</td>
			<td>UI Viral Vector Core</td>
			<td>VVC-U of Iowa-5-HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57 BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal-stripped FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine substitute (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mammary Epithelial Cell Growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix extracts from Engelbreth&#8211;Holm&#8211;Swarm mouse sarcomas (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M7019</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK7</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-23876</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab735</td>
			<td>IHC 1:100, IF 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Upk3</td>
			<td>Fitzgerald</td>
			<td>10R-U103A</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Vimentin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-6260</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal rat anti-CK8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-s</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell vios 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51033557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal chicken anti-CK5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td>IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signature benchtop shaking incubator Model 1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td>35962-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Processing Gel (HistoGel)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade size 10</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall T1 centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells

Blærekreft er et undervurdert område, spesielt i genmodifiserte musemodeller (GEMMs). Innavlede GEMMs med vevsspesifikke Cre- og loxP-nettsteder har vært gullstandardene for betinget eller inducible genmålretting. For å gi raskere og mer effektive eksperimentelle modeller, utvikles et ex vivo organoid kultursystem ved hjelp av adenovirus Cre og normale urothelialceller som bærer flere loxP-alleler av tumordemperne Trp53, Pten og Rb1. Normale urotelceller er enzymatisk disassosiert fra fire blærer med trippel floxed mus (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). De urotheliale cellene transduseres ex vivo med adenovirus-Cre drevet av en CMV-promotor (Ad5CMVCre). De transinduserte blæreorganoidene dyrkes, forplantes og karakteriseres in vitro og in vivo. PCR brukes til å bekrefte gensletting i Trp53, Pten og Rb1. Immunfluorescens (IF) farging av organoider viser positivt uttrykk for uroteliale avstamningsmarkører (CK5 og p63). Organoidene injiseres subkutant i vertsmus for tumorutvidelse og serielle passasjer. Immunhistokjemien (IHC) av xenografts viser positivt uttrykk for CK7, CK5 og p63 og negativt uttrykk for CK8 og Uroplakin 3. Oppsummert er adenovirusmediert gensletting fra mus urothelialceller konstruert med loxP-nettsteder en effektiv metode for raskt å teste det tumorigeniske potensialet til definerte genetiske endringer.

Arbeidsflyten av adenovirus-Cre medierte genslettinger i museretthelialceller er vist i figur 1A. Den medfølgende videoen viser hvordan de urotheliale cellene er disassosiert fra blærens fundus og hvordan de tredoble floxed cellene transduseres ex vivo med Ad5CMVCre. Figur 1A viste at minimale submucosa- og muskelceller ble fjernet etter enzym fordøyelse. For å bekrefte effektiviteten av adenovirus-Cre-levering, ble disassosierte urothelialceller fr...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells at JoVE.com

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Denne protokollen beskriver prosessen med generering og karakterisering av mus urothelial organoider som skjuler slettinger i gener av interesse. Metodene inkluderer høsting av mus urothelial celler, ex vivo transduksjon med adenovirus kjøring Cre uttrykk med en CMV promotør, og in vitro samt in vivo karakterisering.

Eks Vivo Organoid modell av Adenovirus-Cre medierte genslettinger i mus urotelceller

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Vi utviklet en rask og effektiv protokoll for å generere blærekreftorganoider via ex vivo genredigering av normale mus urothelialceller som bærer floxed alleler i gener av interesse. Denne ex vivo-metoden har en en-til-to-ukers arbeidsflyt i stedet for år med museavl, og den er svært effektiv i adenovirustransduksjon på Cre-medierte genslettinger. Til å begynne med, forberede alle sterile instrumenter og reagenser, inkludert saks, tang, DPBS i 35 milliliter kulturretter, 70% etanol, gasbind og rene papirhåndklær.Deretter rengjør alle overflater av disseksjonsområdet og dekk disseksjonsområdet med et rent papirhåndkle. Plasser den euthanized musen på gasbindet i disseksjonsområdet og spray 70% etanol på musens underliv, og bruk deretter steril disseksjonssaks, lag et lavere midtlinje abdominal snitt for å avsløre blæren. Bruk nå tangene til å gripe og forsiktig trekke opp blæren for å identifisere det bilaterale ureterovesiske krysset.Bruk saks, fjern blærefondet, følg grenselinjen mellom de to urinlederens åpninger og overfør blæren til en steril tallerken som inneholder 2 milliliter DPBS, fjern deretter fett- og bindevevet og legg blæren i en ny tallerken som inneholder 2 milliliter DPBS. Fjern også adenoviruset fra minus 80-graders Celsius-lagringen og hold det på is. For celledissosiasjon, lag alle sterile instrumenter og reagenser som beskrevet i manuskriptet, deretter i et biosikkerhetsskap, overfør blæren til en 35 millimeter tallerken og vask med 2 milliliter steril DPBS.Samle blærevev fra fire mus i en tallerken med en milliliter komplett kulturmedium uten kull-strippet FBS. Deretter, ved hjelp av et kirurgisk blad, hakk hver blære i fire like stykker, deretter ved hjelp av tang, brett blæren for å utsette urotheliumoverflaten til mediet. Overfør blærestykkene og mediet til et sentrifugerør på 15 milliliter.Vask parabolen to ganger med 2 milliliter komplett kulturmedium uten kull-strippet FBS og legg vasken til sentrifugerøret, og bringe det totale volumet til 5 milliliter. Deretter legger du til en kollagenase- og hyaluronidaseblanding og plasserer røret horisontalt i en 37-graders Celsius orbital shaker inkubator i 30 minutter ved 200 RPM. Etter vevsfordøyelse, legg til et likt volum på 10% kull-strippet FBS og DPBS i røret og sentrifuge ved 200 ganger g i 5 minutter.Etter å ha kastet supernatanten, tilsett 2 milliliter trypsin erstatning i cellepellet og bland godt, og inkuber deretter røret ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 4 minutter. Etter inkubasjon, pipette cellene opp og ned 10 ganger med en standard P1000 tips og legge til 5 milliliter av 10% kull-strippet FBS og DPBS. Sil de dissosierte cellene gjennom en 100-mikrometer steril cellesil og samle cellefjæringen i et 50 milliliterrør.Overfør cellefjæringen til et 15 milliliterrør og sentrifuger ved 200 ganger g i 5 minutter. Etter å ha fjernet supernatanten, resuspend pellet i 1 milliliter av komplett kulturmedium. Tell antall celler ved hjelp av et hemocytometer og plate 0,5 ganger 10 til de sjette cellene i hver brønn av en 24-brønns plate med 0,5 milliliter fersk komplett kulturmedium.Deretter tar du ut matriseekstraktene til Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkomceller fra minus 20-graders Celsius-lagring og tiner dem på is. Også, prewarm en 6-brønns plate i en 37-graders Celsius celle inkubator. For adenoviral transduksjon, tilsett 2 mikroliter adenovirus i 24-brønnsplaten og bland godt med de dissosierte urothelialcellene.For å forbedre transduksjonseffekten, utfør spinokulering ved å sentrifugere platen ved 300 ganger g i 30 minutter, og inkuber deretter platen ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 1 time. Overfør celler og medium fra brønnen til et 15 milliliterrør og sentrifuger ved 200 ganger g i 5 minutter. Etter å ha kastet supernatanten, legg til 50 mikroliter av komplett kulturmedium og bland godt med cellene nederst.Deretter legger du til 140 mikroliter matriseekstrakt og blander forsiktig godt for å unngå luftbobler, og lag deretter kupler for organoider ved raskt å legge til 50 mikroliter av løsningen per kuppel i den forhåndsvarmede 6-brønnsplaten. Inkuber platen og la kuplene størkne i 5 minutter. Etter 5 minutter snur du 6-brønnsplaten opp ned og fortsetter størkningen i ytterligere 25 minutter.Etter inkubasjon, tilsett 2,5 milliliter komplett kulturmedium til hver brønn og legg platen i en inkubator for organoidkultur. Det grønne fluorescerende proteinet ble påvist i nesten 100% av cellene, noe som tyder på høy effektivitet av adenovirustransduksjon. Hematoksylin og eosinfarging og immunhistokjemi av trippel knockout organoider svulster viste morfologien til høyverdig urothelialkarsinom med positivt proteinuttrykk av basale undertypemarkører av CK5 og p63.De ikke-rekombinerte floxed allelene ble oppdaget i urothelialceller, ubehandlet med adenovirus, mens de rekombinerte allelene ble observert i trippel knockout organoider. Generelt var det nødvendig med 2 til 3 uker for å danne en 2 centimeter subkutan svulst. Immunhiistokjemien til trippel knockout organoider, in vivo xenografts, viste positivt uttrykk for CK7, CK5 og p63 proteiner.Negativt uttrykk ble påvist for CK8- og uroplakinproteiner. Mesenchymemarkøren, vimentin, ble oppdaget bare i tumorkapselen eller stroma. Museblærens dissosiasjon må ikke overstige 30 minutter.En lengre dissosiasjonstid kan øke i prosentandelen av stromacellene, for eksempel endotelceller og fibroblaster Denne tilnærmingen kan kombineres med cellesortering eller celletype et bestemt adenovirus for å generere celletypen av spesifikke organoider, for eksempel lumen versus basale organoider.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantifisering av genekspresjon og Tumor Invasivitet Bruke Genetic Mosaikk

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolering av sirkulerende tumorceller i en ortotopisk musemodell av kolorektal kreft

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

I Vivo EPR vurdering av pH, pO2, Redox Status, og konsentrasjoner av fosfat og glutation i svulst Microenvironment

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

En prekliniske musemodell Osteosarcoma definere den ekstracellulære Vesicle-mediert kommunikasjonen mellom svulst og Mesenchymal stamceller

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses for svulst målrettede Immunomodulation: Design og evaluering Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Tredimensjonale bein ekstracellulær Matrix modell for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Vurderer differensiering kapasitet på Mouse prostata epitelceller bruke Organoid kultur

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

En Ex Vivo Brain Slice-modell for å studere og målrette brystkreft hjerne metastatisk tumorvekst

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Definere genfunksjoner i tumorigenese ved ex vivo ablasjon av floxede alleler i ondartede perifere nerveskjede tumorceller

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Opprettholde humant glioblastom cellulært mangfold ex vivo ved bruk av tredimensjonal organoidkultur

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...