Name: ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells at JoVE.com

Este trabalho de pesquisa foi apoiado em parte por NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 e R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), a Roswell Park Alliance Foundation e a Friends of Urology Foundation. Agradecemos a Marisa Blask e Mila Pakhomova pela revisão do manuscrito.

Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY (1395M, Biosafety 180501 e 180502). NOTA: Realize as etapas 1-3 no mesmo dia.
1. Dissecção da bexiga do rato
<ol><li>Preparação para dissecção<ol>
<li>Prepare todos os instrumentos estéreis, incluindo tesouras, fórceps, DPBS estéreis em pratos de cultura de 35 mm, 70% de etanol, gaze estéril e toa...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2021.">Cancer statistics, 2021.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+bladder+cancer+research.">Preclinical models for bladder cancer research.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).</li><li>DeGraff, D. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+treatment+landscape+of+advanced+urothelial+carcinoma.">The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma.</a> Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).</li><li>Mullenders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+human+urothelial+cancer+organoids:+A+tool+for+bladder+cancer+research.">Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).</li><li>Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Fujii, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+histopathological+evaluation+of+organoids.">A simple method for histopathological evaluation of organoids.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).</li><li>Georgas, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+illustrated+anatomical+ontology+of+the+developing+mouse+lower+urogenital+tract.">An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract.</a> Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).</li><li>Santos, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+organoids+originating+from+Cd49f(high)+mouse+stem+cells+display+Notch-dependent+differentiation+capacity.">Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity.</a> Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+defined+disease+model+reveals+that+urothelial+cells+can+initiate+divergent+bladder+cancer+phenotypes.">A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intertumoral+heterogeneity+in+SCLC+is+influenced+by+the+cell+type+of+origin.">Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin.</a> Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).</li><li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer:+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung.">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li><li>Bottger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+heterogeneity+underlies+differential+cisplatin+sensitivity+in+mouse+models+of+small-cell+lung+cancer.">Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer.</a> Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).</li><li>Puzio-Kuter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+p53+and+Pten+promotes+invasive+bladder+cancer.">Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer.</a> Genes &amp; Development. 23 (6), 675-680 (2009).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mouse+models+of+bladder+cancer+identify+a+prognostic+signature+associated+with+risk+of+disease+progression.">Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression.</a> Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).</li><li>Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+genetic+removal+of+signaling+molecules+in+cultured+primary+mouse+embryonic+fibroblasts.">Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).</li><li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+interrogation+of+cancer+cell+of+origin+through+CRISPR+editing.">Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).</li></ol>

Gemms têm sido os padrões de ouro para a modelagem do câncer iniciada a partir de células normais, permitindo que as consequências de potenciais perturbações oncogênicas (ativação oncogênica e/ou perda de supressores tumorais) sejam testadas rigorosamente. Aqui, um protocolo rápido e eficiente é fornecido para gerar organoides de câncer de bexiga através da edição de genes ex vivo de células uroteliais normais do camundongo carregando alelos floxados em genes de interesse. As manchas de H&E e I...

O câncer de bexiga é o quarto câncer mais comum em homens e afeta mais de 80.000 pessoas anualmente nos Estados Unidos1. A quimioterapia à base de platina tem sido o padrão de cuidado para pacientes com câncer avançado de bexiga há mais de três décadas. A paisagem do tratamento do câncer de bexiga foi revolucionada pela recente aprovação da Food and Drug Administration (FDA) da imunoterapia (anti-PD-1 e inibidores de ponto de verificação imunológica anti-PD-L1), erdafitinib (um inibidor receptor de fator de crescimento do fibroblasto) e enfortumab vedotin (um conjugado de anticorpos)2,3,4. No entanto, não há biomarcadores clinicamente aprovados para prever as respostas à quimioterapia ou à imunoterapia. Há uma necessidade crítica de gerar modelos pré-clínicos informativos que possam melhorar a compreensão dos mecanismos que impulsionam a progressão do câncer de bexiga e desenvolver biomarcadores preditivos para diferentes modalidades de tratamento.
Um grande obstáculo na pesquisa translacional da bexiga é a falta de modelos preclínicos que recapitulem a patogênese do câncer de bexiga humano e as respostasao tratamento 5,6. Vários modelos pré-clínicos foram desenvolvidos, incluindo modelos in vitro 2D (linhas celulares ou células reprogramadas condicionalmente), modelos in vitro 3D (organoides, impressão 3D) e modelos in vivo (xenoenxerto, modelos induzidos pelo carcinogênio, geneticamente modificados e xenot de enxerto derivado do paciente)2,6. Modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs) são úteis para muitas aplicações na biologia do câncer de bexiga, incluindo análises de fenótipos tumorais, investigações mecanicistas de genes candidatos e/ou caminhos de sinalização, e a avaliação pré-clínica das respostas terapêuticas 6,7. Os GEMMs podem utilizar recombinases específicas do local (Cre-loxP) para controlar exclusões genéticas em um ou mais genes supressores de tumores. O processo de geração de GEMMs desejados com múltiplas exclusões genéticas é demorado, trabalhoso e caro5. O objetivo geral deste método é desenvolver um método rápido e eficiente de entrega ex vivo Cre para estabelecer modelos de nocaute triplo de bexiga (TKO) a partir de células uroteliais normais do rato carregando alelos floxados triplos (Trp53, Pten e Rb1)8. A maior vantagem do método ex vivo é o fluxo de trabalho rápido (1-2 semanas em vez de anos de criação de camundongos). Este artigo descreve o protocolo de colheita de células uroteliais normais com alelos floxados, transdução ex vivo adenovírus, culturas organoides e caracterização in vitro e in vivo em camundongos imunocompetuntes C57 BL/6J. Este método pode ser usado para gerar organoides clinicamente relevantes para o câncer de bexiga em camundongos imunocompetuntes que abrigam qualquer combinação de alelos floxados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#956;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 1.5 inches needle</td>
			<td>EXELINT International</td>
			<td>26406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)</td>
			<td>UI Viral Vector Core</td>
			<td>VVC-U of Iowa-5-HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57 BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal-stripped FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine substitute (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mammary Epithelial Cell Growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix extracts from Engelbreth&#8211;Holm&#8211;Swarm mouse sarcomas (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M7019</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK7</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-23876</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab735</td>
			<td>IHC 1:100, IF 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Upk3</td>
			<td>Fitzgerald</td>
			<td>10R-U103A</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Vimentin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-6260</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal rat anti-CK8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-s</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell vios 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51033557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal chicken anti-CK5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td>IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signature benchtop shaking incubator Model 1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td>35962-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Processing Gel (HistoGel)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade size 10</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall T1 centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells

O câncer de bexiga é uma área pouco estudada, particularmente em modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs). Gemm inbred com locais cre e loxP específicos de tecido têm sido os padrões de ouro para direcionamento genético condicional ou indutível. Para fornecer modelos experimentais mais rápidos e eficientes, um sistema de cultura organoide ex vivo é desenvolvido usando adenovírus Cre e células uroteliais normais carregando múltiplos alelos loxP dos supressores tumorais Trp53, Pten e Rb1. As células uroteliais normais são enzimáticamente dissociadas de quatro bexigas de camundongos floxados triplos (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). As células urotelial são transduzidas ex vivo com adenovírus-Cre impulsionado por um promotor do CMV (Ad5CMVCre). Os organoides da bexiga transduzidas são cultivados, propagados e caracterizados in vitro e in vivo. O PCR é usado para confirmar exclusões genéticas em Trp53, Pten e Rb1. A coloração de imunofluorescência (IF) de organoides demonstra expressão positiva dos marcadores de linhagem urotelial (CK5 e p63). Os organoides são injetados subcutâneamente em camundongos hospedeiros para expansão tumoral e passagens seriais. A imunohistoquímica (IHC) de xenoenxertos exibe expressão positiva de CK7, CK5 e p63 e expressão negativa de CK8 e Uroplakin 3. Em resumo, a exclusão genética mediada por adenovírus de células uroteliais de camundongos projetadas com locais loxP é um método eficiente para testar rapidamente o potencial tumorigênico de alterações genéticas definidas.

O fluxo de trabalho de deleções genéticas mediadas por adenovírus-Cre em células urteliais do camundongo é mostrado na Figura 1A. O vídeo que acompanha demonstra como as células uroteliais são dissociadas do fundus da bexiga e como as células floxadas triplas são transduzidas ex vivo com Ad5CMVCre. A Figura 1A mostrou que as células mínimas de submucosa e muscular foram dissociadas após a digestão enzimática. Para confirmar a eficiência...

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Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Este protocolo descreve o processo de geração e caracterização de organoides uroteliais de camundongos que abrigam exclusões em genes de interesse. Os métodos incluem a colheita de células uroteliais de camundongos, transdução ex vivo com expressão de Adenovírus conduzindo Cre com um promotor de CMV, e caracterização in vitro , bem como caracterização in vivo .

Ex Vivo Modelo organoide de deleções genéticas mediadas por Adenovírus-Cre em células uroteliais de camundongos

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Desenvolvemos um protocolo rápido e eficiente para gerar organoides de câncer de bexiga através da edição de genes ex vivo de células uroteliais normais do rato carregando alelos floxados em genes de interesse. Este método ex vivo tem um fluxo de trabalho de uma a duas semanas em vez de anos de reprodução de camundongos, e é altamente eficiente na transdução de adenovírus nas exclusões genéticas mediadas por Cre. Para começar, prepare todos os instrumentos estéreis e reagentes, incluindo tesoura, fórceps, DPBS em pratos de cultura de 35 mililitros, 70% de etanol, gaze e toalhas de papel limpas.Em seguida, limpe todas as superfícies da área de dissecção e cubra a área de dissecção com uma toalha de papel limpa. Coloque o rato eutanizado sobre a gaze na área de dissecção e pulverize 70% de etanol no abdômen do camundongo, em seguida, usando uma tesoura de dissecção estéril, faça uma incisão abdominal média inferior para expor a bexiga. Agora, use os fórceps para agarrar e puxar suavemente a bexiga para identificar a junção ureterovesical bilateral.Usando uma tesoura, remova o fundus da bexiga, seguindo a linha de fronteira entre as duas aberturas de ureter e transfira a bexiga para um prato estéril contendo 2 mililitros de DPBS, em seguida, remova o tecido gorduroso e conjuntivo e coloque a bexiga em um novo prato contendo 2 mililitros de DPBS. Remova também o adenovírus do armazenamento Celsius de menos 80 graus e mantenha-o no gelo. Para dissociação celular, prepare todos os instrumentos e reagentes estéreis como descrito no manuscrito, em seguida, em um armário de biossegurança, transfira a bexiga para um prato de 35 milímetros e lave com 2 mililitros de DPBS estéreis.Colete tecidos da bexiga de quatro ratos em um prato com um mililitro de meio de cultura completa sem FBS despojados de carvão. Em seguida, usando uma lâmina cirúrgica, pique cada bexiga em quatro pedaços iguais, em seguida, usando fórceps, desdobre a bexiga para expor a superfície do urotélio ao meio. Transfira as peças da bexiga e o meio em um tubo de centrífuga de 15 mililitros.Lave o prato duas vezes com 2 mililitros de meio de cultura completa sem FBS despojados de carvão e adicione a lavagem ao tubo de centrífuga, elevando o volume total para 5 mililitros. Em seguida, adicione uma mistura de colagem e hialuronidase e coloque o tubo horizontalmente em uma incubadora de shaker orbital de 37 graus Celsius por 30 minutos a 200 RPM. Após a digestão do tecido, adicione um volume igual de FBS e DPBS descascados de carvão de 10% no tubo e centrífuga a 200 vezes g por 5 minutos.Depois de descartar o supernasce, adicione 2 mililitros de trippsina substitua a pelota celular e misture bem, depois incubar o tubo a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 4 minutos. Após a incubação, pipete as células para cima e para baixo 10 vezes com uma ponta P1000 padrão e adicione 5 mililitros de FBS e DPBS 10% de carvão. Coe as células dissociadas através de um coador de células estéreis de 100 micrômetros e colete a suspensão celular em um tubo de 50 mililitros.Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros e centrífuga a 200 vezes g durante 5 minutos. Depois de remover o supernasce, resuspense a pelota em 1 mililitro de meio de cultura completa. Conte o número de células usando um hemótmetro e placa 0,5 vezes 10 a 6ª células em cada poço de uma placa de 24 poços com 0,5 mililitros de meio de cultura completa fresco.Em seguida, retire os extratos matriciais de células de sarcoma de rato Engelbreth-Holm-Swarm de menos 20 graus Celsius e descongele-as no gelo. Além disso, pré-aquecimento uma placa de 6 poços em uma incubadora de células Celsius de 37 graus. Para transdução adenoviral, adicione 2 microliters de adenovírus na placa de 24 poços e misture bem com as células dissociadas da urotelia.Para melhorar a eficácia da transdução, realize a spinoculação centrifugando a placa a 300 vezes g por 30 minutos, em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 1 hora. Transfira células e médias do poço para um tubo de 15 mililitros e centrífuga a 200 vezes g por 5 minutos. Depois de descartar o supernascer, adicione 50 microliters de meio de cultura completa e misture bem com as células na parte inferior.Em seguida, adicione 140 microliters de extrato de matriz e misture suavemente bem para evitar bolhas de ar, em seguida, crie cúpulas para organoides adicionando rapidamente 50 microliters da solução por cúpula na placa pré-ensacado de 6 poços. Incubar a placa e permitir que as cúpulas se solidifiquem por 5 minutos. Após 5 minutos, vire a placa de 6 poços de cabeça para baixo e continue a solidificação por mais 25 minutos.Após a incubação, adicione 2,5 mililitros de cultura completa a cada poço e coloque a placa em uma incubadora para cultura organoide. A proteína fluorescente verde foi detectada em quase 100% das células, sugerindo alta eficiência da transdução do adenovírus. A coloração de hematoxilina e eosina e a imunohistoquímica de tumores organoides triplos eliminar mostraram a morfologia do carcinoma urotelial de alto grau com expressão proteica positiva de marcadores de subtipos basais de CK5 e p63.Os alelos floxados não recombinados foram detectados em células uroteliais, não tratadas com adenovírus, enquanto os alelos recombinados foram observados nos organoides triplos nocauteados. Em geral, 2 a 3 semanas foram necessárias para formar um tumor subcutâneo de 2 centímetros. A imunohistoquímica de organoides triplos nocautes, in vivo xenoenxertos, exibiu expressão positiva das proteínas CK7, CK5 e p63.A expressão negativa foi detectada para proteínas CK8 e uroplakin. O marcador de mesenquime, vimentina, foi detectado apenas na cápsula do tumor ou estroma. A dissociação da bexiga do rato não deve exceder 30 minutos.Um tempo de dissociação mais longo pode aumentar na porcentagem das células estroma, como células endoteliais e os fibroblastos Essa abordagem pode ser combinada com a classificação celular ou o tipo celular de um adenovírus específico para gerar o tipo celular de organoides específicos, como lúmen versus organoides basais.

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This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Um modelo de Mouse pré-clínicos de osteossarcoma para definir a comunicação mediada por vesículas extracelular entre Tumor e as células-tronco mesenquimais

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses para imunomodulação Tumor-alvo: Design e avaliação Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Modelo de matriz extracelular óssea tridimensional para osteossarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Avaliando a capacidade de diferenciação das células epitelias da próstata do camundongo usando a cultura organóide

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Um modelo de fatia cerebral ex vivo para estudar e direcionar o crescimento do tumor metastático do câncer de mama

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Definindo funções genéticas em Tumorigênese por Ex vivo Ablaation of Floxed Alleles in Maligna Periférico Nerve Hemato Tumor Cells

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Manutenção da Diversidade Celular Glioblastoma Humano Ex vivo usando cultura organoide tridimensional

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...