Name: ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells at JoVE.com

Эта исследовательская работа была частично поддержана грантами NIH, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 и R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation и Friends of Urology Foundation. Благодарим Марису Бласк и Милу Пахомову за корректуру рукописи.

Все процедуры для животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Комплексном онкологическом центре Розуэлл-Парка, Буффало, штат Нью-Йорк (1395M, 180501 и 180502). ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 1–3 в тот же день.
1. Рассечение моче...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2021.">Cancer statistics, 2021.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+bladder+cancer+research.">Preclinical models for bladder cancer research.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).</li><li>DeGraff, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+preclinical+models+for+the+advancement+of+translational+bladder+cancer+research.">Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).</li><li>Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+treatment+landscape+of+advanced+urothelial+carcinoma.">The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma.</a> Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).</li><li>Mullenders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+human+urothelial+cancer+organoids:+A+tool+for+bladder+cancer+research.">Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).</li><li>Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+bladder+cancer+in+mice:+opportunities+and+challenges.">Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).</li><li>Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mouse+models+in+oncology+research+and+cancer+medicine.">Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Fujii, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+histopathological+evaluation+of+organoids.">A simple method for histopathological evaluation of organoids.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).</li><li>Georgas, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+illustrated+anatomical+ontology+of+the+developing+mouse+lower+urogenital+tract.">An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract.</a> Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).</li><li>Santos, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+organoids+originating+from+Cd49f(high)+mouse+stem+cells+display+Notch-dependent+differentiation+capacity.">Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity.</a> Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+defined+disease+model+reveals+that+urothelial+cells+can+initiate+divergent+bladder+cancer+phenotypes.">A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intertumoral+heterogeneity+in+SCLC+is+influenced+by+the+cell+type+of+origin.">Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin.</a> Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).</li><li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer:+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung.">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li><li>Bottger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+heterogeneity+underlies+differential+cisplatin+sensitivity+in+mouse+models+of+small-cell+lung+cancer.">Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer.</a> Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).</li><li>Puzio-Kuter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+p53+and+Pten+promotes+invasive+bladder+cancer.">Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer.</a> Genes &amp; Development. 23 (6), 675-680 (2009).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mouse+models+of+bladder+cancer+identify+a+prognostic+signature+associated+with+risk+of+disease+progression.">Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression.</a> Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).</li><li>Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+genetic+removal+of+signaling+molecules+in+cultured+primary+mouse+embryonic+fibroblasts.">Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).</li><li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+interrogation+of+cancer+cell+of+origin+through+CRISPR+editing.">Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).</li></ol>

GEMM были золотыми стандартами для моделирования рака, инициированного из нормальных клеток, что позволяет тщательно тестировать последствия потенциальных онкогенных возмущений (активация онкогенов и / или потеря супрессоров опухоли). Здесь предоставляется быстрый и эффективный прото...

Рак мочевого пузыря является четвертым наиболее распространенным раком у мужчин и ежегодно поражает более 80 000 человек в Соединенных Штатах1. Химиотерапия на основе платины была стандартом ухода за пациентами с прогрессирующим раком мочевого пузыря на протяжении более трех десятилетий. Ландшафт лечения рака мочевого пузыря был революционизирован недавним одобрением Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) иммунотерапии (ингибиторы иммунной контрольной точки анти-PD-1 и анти-PD-L1), эрдафитиниба (ингибитор рецептора фактора роста фибробластов) и энфортумаба ведотина (конъюгат антитело-лекарство)2,3,4. Тем не менее, клинически одобренные биомаркеры недоступны для прогнозирования ответов на химиотерапию или иммунотерапию. Существует острая необходимость в создании информативных доклинических моделей, которые могут улучшить понимание механизмов, приводящих к прогрессированию рака мочевого пузыря, и разработать прогностические биомаркеры для различных методов лечения.
Основным препятствием в трансляционных исследованиях мочевого пузыря является отсутствие доклинических моделей, которые резюмируют патогенез рака мочевого пузыря человека и ответы на лечение 5,6. Было разработано несколько доклинических моделей, включая 2D-модели in vitro (клеточные линии или условно перепрограммированные клетки), 3D-модели in vitro (органоиды, 3D-печать) и модели in vivo (ксенотрансплантат, канцероген-индуцированные, генно-инженерные модели и ксенотрансплантат, полученные от пациента)2,6. Генетически модифицированные мышиные модели (GEMM) полезны для многих применений в биологии рака мочевого пузыря, включая анализ фенотипов опухолей, механистические исследования генов-кандидатов и / или сигнальных путей и доклиническую оценку терапевтических ответов 6,7. GEMM могут использовать сайт-специфические рекомбиназы (Cre-loxP) для контроля генетических делеций в одном или нескольких генах-супрессорах опухолей. Процесс генерации желаемых GEMM с множественными делециями генов является трудоемким, трудоемким и дорогостоящим5. Общей целью этого метода является разработка быстрого и эффективного метода доставки ex vivo Cre для создания моделей тройного нокаута мочевого пузыря (TKO) из нормальных уротелиальных клеток мыши, несущих тройные флоксированные аллели (Trp53, Pten и Rb1)8. Основным преимуществом метода ex vivo является быстрый рабочий процесс (1-2 недели вместо лет разведения мышей). В этой статье описывается протокол сбора нормальных уротелиальных клеток с флокированными аллелями, трансдукцией аденовируса ex vivo, органоидными культурами, а также характеристикой in vitro и in vivo у иммунокомпетентных мышей C57 BL/6J. Этот метод может быть дополнительно использован для получения клинически значимых органоидов рака мочевого пузыря у иммунокомпетентных мышей, имеющих любую комбинацию флоксированных аллелей.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#956;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 1.5 inches needle</td>
			<td>EXELINT International</td>
			<td>26406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)</td>
			<td>UI Viral Vector Core</td>
			<td>VVC-U of Iowa-5-HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57 BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal-stripped FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine substitute (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mammary Epithelial Cell Growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix extracts from Engelbreth&#8211;Holm&#8211;Swarm mouse sarcomas (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M7019</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK7</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-23876</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab735</td>
			<td>IHC 1:100, IF 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Upk3</td>
			<td>Fitzgerald</td>
			<td>10R-U103A</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Vimentin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-6260</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal rat anti-CK8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-s</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell vios 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51033557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal chicken anti-CK5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td>IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signature benchtop shaking incubator Model 1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td>35962-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Processing Gel (HistoGel)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade size 10</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall T1 centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells

Рак мочевого пузыря является недостаточно изученной областью, особенно в генетически модифицированных моделях мышей (GEMM). Инбредные GEMM с тканеспецифическими сайтами Cre и loxP были золотыми стандартами для условного или индуцируемого нацеливания генов. Для обеспечения более быстрых и эффективных экспериментальных моделей разработана система культуры органоидов ex vivo с использованием аденовируса Cre и нормальных уротелиальных клеток, несущих множественные аллели loxP супрессоров опухоли Trp53, Pten и Rb1. Нормальные уротелиальные клетки ферментативно отделены от четырех мочевых пузырей мышей с тройным флоксом (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). Уротелиальные клетки трансдуцируются ex vivo с аденовирусом-Cre, приводимым в действие промотором ЦМВ (Ad5CMVCre). Трансдуцированные органоиды мочевого пузыря культивируются, размножаются и характеризуются in vitro и in vivo. ПЦР используется для подтверждения делеций генов в Trp53, Pten и Rb1. Иммунофлуоресцентное (ИФ) окрашивание органоидов демонстрирует положительную экспрессию маркеров уротелиальной линии (CK5 и p63). Органоиды вводятся подкожно мышам-хозяевам для расширения опухоли и последовательных проходов. Иммуногистохимия (IHC) ксенотрансплантатов демонстрирует положительную экспрессию CK7, CK5 и p63 и отрицательную экспрессию CK8 и Uroplakin 3. Таким образом, опосредованная аденовирусом делеция генов из уротелиальных клеток мыши, спроектированных с сайтами loxP, является эффективным методом быстрой проверки опухолевого потенциала определенных генетических изменений.

Рабочий процесс опосредованных аденовирусом кре делеций генов в уротелиальных клетках мышей показан на рисунке 1А. Сопроводительное видео демонстрирует, как уротелиальные клетки диссоциируются с глазным дном мочевого пузыря и как тройные флоксированные клетки транс?...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells at JoVE.com

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Этот протокол описывает процесс генерации и характеристики уротелиальных органоидов мыши, содержащих делеции в генах, представляющих интерес. Методы включают сбор уротелиальных клеток мыши, трансдукцию ex vivo с аденовирусом, стимулирующим экспрессию Cre с помощью промотора ЦМВ, и характеристику in vitro , а также in vivo .

Ex Vivo Органоидная модель аденовирусно-cre опосредованных делеций генов в уротелиальных клетках мышей

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Мы разработали быстрый и эффективный протокол для генерации органоидов рака мочевого пузыря с помощью редактирования генов ex vivo нормальных уротелиальных клеток мыши, несущих флоксированные аллели в генах, представляющих интерес. Этот метод ex vivo имеет одно-двухнедельный рабочий процесс вместо многолетнего разведения мышей, и он очень эффективен в трансдукции аденовируса на cre-опосредованных генных делециях. Для начала подготовьте все стерильные инструменты и реагенты, включая ножницы, щипцы, DPBS в 35-миллилитровых культуральных блюдах, 70% этанол, марлю и чистые бумажные полотенца.Далее очистите все поверхности области рассечения и накройте область рассечения чистым бумажным полотенцем. Поместите усыпленную мышь на марлю в области рассечения и распылите 70% этанола на брюшко мыши, затем, используя стерильные ножницы для рассечения, сделайте нижний средний разрез брюшной полости, чтобы обнажить мочевой пузырь. Теперь используйте щипцы, чтобы схватить и осторожно подтянуть мочевой пузырь, чтобы определить двустороннее мочеточниковое соединение.С помощью ножниц удалите глазное дно мочевого пузыря, следуя пограничной линии между двумя отверстиями мочеточника и переместите мочевой пузырь в стерильную посуду, содержащую 2 миллилитра DPBS, затем удалите жировую и соединительную ткань и поместите мочевой пузырь в новую посуду, содержащую 2 миллилитра DPBS. Также удалите аденовирус из минус 80-градусного хранения по Цельсию и держите его на льду. Для диссоциации клеток подготовьте все стерильные инструменты и реагенты, как описано в рукописи, затем в шкафу биобезопасности перенесите мочевой пузырь в 35-миллиметровую посуду и вымойте 2 миллилитрами стерильного DPBS.Соберите ткани мочевого пузыря от четырех мышей в чашку с одним миллилитром полной питательной среды без удаления древесного угля FBS. Затем, используя хирургический клинок, измельчите каждый мочевой пузырь на четыре равные части, затем, используя щипцы, разверните мочевой пузырь, чтобы обнажить поверхность уротелия для среды. Переместите кусочки мочевого пузыря и среду в 15-миллилитровую центрифужную трубку.Дважды вымойте посуду 2 миллилитрами полной питательной среды без очищенного от древесного угля FBS и добавьте промывку в трубку центрифуги, доведя общий объем до 5 миллилитров. Затем добавьте смесь коллагеназы и гиалуронидазы и поместите трубку горизонтально в орбитальный шейкер-инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия в течение 30 минут при 200 оборотах в минуту. После переваривания тканей добавьте равный объем 10% очищенных от древесного угля FBS и DPBS в пробирку и центрифугу по 200 раз в г в течение 5 минут.После выброса супернатанта добавьте 2 миллилитра заменителя трипсина в ячейку гранулы и хорошо перемешайте, затем инкубируйте трубку при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 4 минут. После инкубации пипеткой клетки вверх и вниз 10 раз с помощью стандартного наконечника P1000 и добавьте 5 миллилитров 10% очищенных от древесного угля FBS и DPBS. Процедите диссоциированные клетки через 100-микрометровый стерильный клеточный сетчатый фильтр и соберите клеточную суспензию в 50-миллилитровую трубку.Переложите клеточную суспензию в 15-миллилитровую трубку и центрифугу по 200 раз в г в течение 5 минут. После удаления супернатанта повторно суспендируют гранулу в 1 миллилитре полной питательной среды. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра и пластины 0,5 раза 10 до 6-й клетки в каждую лунку из 24-луночной пластины с 0,5 миллилитрами свежей полной питательной среды.Далее вынимаем матричные экстракты клеток саркомы мыши Энгельбрета-Холма-Роя из хранилища минус 20 градусов Цельсия и размораживаем их на льду. Также предваряют 6-луночную пластину в клеточном инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия. Для аденовирусной трансдукции добавьте 2 микролитра аденовируса в 24-луночную пластину и хорошо перемешайте с диссоциированными уротелиальными клетками.Для повышения эффективности трансдукции выполняют спинокуляцию путем центрифугирования пластины в 300 раз в г в течение 30 минут, затем инкубируют пластину при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 1 часа. Перенесите ячейки и среду из скважины в 15-миллилитровую трубку и центрифугу по 200 раз в г в течение 5 минут. После выбрасывания надосадочного вещества добавляют 50 микролитров полной питательной среды и хорошо перемешивают с клетками на дне.Затем добавьте 140 микролитров экстракта матрицы и аккуратно хорошо перемешайте, чтобы избежать пузырьков воздуха, затем создайте купола для органоидов, быстро добавив 50 микролитров раствора на купол в предварительно расплавленную 6-луночную пластину. Инкубируйте плиту и дайте куполам затвердеть в течение 5 минут. Через 5 минут переверните 6-луночную пластину вверх дном и продолжайте затвердевание в течение дополнительных 25 минут.После инкубации добавляют в каждую лунку по 2,5 миллилитра полной питательной среды и помещают пластинку в инкубатор для органоидной культуры. Зеленый флуоресцентный белок был обнаружен почти в 100% клеток, что свидетельствует о высокой эффективности трансдукции аденовируса. Окрашивание гематоксилина и эозина и иммуногистохимия опухолей тройных нокаутных органоидов показали морфологию полноценной уротелиальной карциномы с положительной экспрессией белка маркеров базального подтипа CK5 и p63.Нерекомбинированные флокированные аллели были обнаружены в уротелиальных клетках, не обработанных аденовирусом, тогда как рекомбинированные аллели наблюдались в тройных нокаутных органоидах. В целом, для формирования 2-сантиметровой подкожной опухоли требовалось от 2 до 3 недель. Иммуногистохимия тройных нокаутных органоидов, in vivo ксенотрансплантатов, показала положительную экспрессию белков CK7, CK5 и p63.Обнаружена отрицательная экспрессия белков CK8 и уроплакина. Маркер мезенхимы, виментин, был обнаружен только в опухолевой капсуле или строме. Диссоциация мочевого пузыря мыши не должна превышать 30 минут.Более длительное время диссоциации может увеличить процент клеток стромы, таких как эндотелиальные клетки и фибробласты Этот подход может быть объединен с сортировкой клеток или клеточным типом специфического аденовируса для генерации клеточного типа специфических органоидов, таких как просвет по сравнению с базальными органоидами.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Имаджинальное Disc Опухоль Модель: Визуализация и Количественная экспрессии генов и опухолевой инвазии с использованием генетических Мозаики

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Выделение циркулирующих опухолевых клеток в модели ортотопической мыши колоректального рака

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

В естественных условиях ЭПР Оценка рН, pO2, окислительно-восстановительного состояния и концентрации фосфатов и глутатиона в микроокружения опухоли

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Доклинические мыши модель остеосаркома определить внеклеточного везикул опосредованной коммуникации между опухоли и мезенхимальных стволовых клеток

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Парамиксовирусы для ориентированных на опухоль иммуномодуляция: дизайн и оценке Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Внеклеточная матрица модель трехмерных костей для остеосаркомы

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Оценка дифференциации потенциала мыши простаты эпителиальных клеток с использованием органоидной культуры

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Модель среза мозга Ex Vivo для изучения и нацеливания на метастатический рост опухоли головного мозга рака молочной железы

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Определение функций генов в опухолевом генезе путем абляции Ex vivo флоксированных аллелей в злокачественных опухолевых клетках оболочки периферических нервов

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Поддержание клеточного разнообразия глиобластомы человека Ex vivo с использованием трехмерной органоидной культуры

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...