Name: ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells at JoVE.com

Este trabajo de investigación fue apoyado en parte por NIH Grants, K08CA252161(Q.L.), R01CA234162 y R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation y Friends of Urology Foundation. Agradecemos a Marisa Blask y Mila Pakhomova por revisar el manuscrito.

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY (1395M, Biosafety 180501 y 180502). NOTA: Realice los pasos 1-3 el mismo día.
1. Disección de la vejiga del ratón
<ol><li>Preparación para la disección<ol>
<li>Prepare todos los instrumentos estériles, incluyendo tijeras, fórceps, DPBS estériles en platos de cultivo de 35 mm, etanol al 70%...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2021.">Cancer statistics, 2021.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+bladder+cancer+research.">Preclinical models for bladder cancer research.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).</li><li>DeGraff, D. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+treatment+landscape+of+advanced+urothelial+carcinoma.">The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma.</a> Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).</li><li>Mullenders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+human+urothelial+cancer+organoids:+A+tool+for+bladder+cancer+research.">Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).</li><li>Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+bladder+cancer+in+mice:+opportunities+and+challenges.">Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).</li><li>Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mouse+models+in+oncology+research+and+cancer+medicine.">Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Lee, S. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+illustrated+anatomical+ontology+of+the+developing+mouse+lower+urogenital+tract.">An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract.</a> Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).</li><li>Santos, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+organoids+originating+from+Cd49f(high)+mouse+stem+cells+display+Notch-dependent+differentiation+capacity.">Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity.</a> Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+defined+disease+model+reveals+that+urothelial+cells+can+initiate+divergent+bladder+cancer+phenotypes.">A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intertumoral+heterogeneity+in+SCLC+is+influenced+by+the+cell+type+of+origin.">Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin.</a> Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).</li><li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer:+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung.">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li><li>Bottger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+heterogeneity+underlies+differential+cisplatin+sensitivity+in+mouse+models+of+small-cell+lung+cancer.">Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer.</a> Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).</li><li>Puzio-Kuter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+p53+and+Pten+promotes+invasive+bladder+cancer.">Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer.</a> Genes &amp; Development. 23 (6), 675-680 (2009).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mouse+models+of+bladder+cancer+identify+a+prognostic+signature+associated+with+risk+of+disease+progression.">Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression.</a> Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).</li><li>Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+genetic+removal+of+signaling+molecules+in+cultured+primary+mouse+embryonic+fibroblasts.">Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).</li><li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+interrogation+of+cancer+cell+of+origin+through+CRISPR+editing.">Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).</li></ol>

Los GEMM han sido los estándares de oro para el modelado del cáncer iniciado a partir de células normales, lo que permite probar rigurosamente las consecuencias de posibles perturbaciones oncogénicas (activación del oncogén y / o pérdida de supresores de tumores). Aquí, se proporciona un protocolo rápido y eficiente para generar organoides de cáncer de vejiga a través de la edición de genes ex vivo de células uroteliales normales de ratón que transportan alelos floxados en genes de interés. La tin...

El cáncer de vejiga es el cuarto cáncer más común en los hombres y afecta a más de 80,000 personas anualmente en los Estados Unidos1. La quimioterapia basada en platino ha sido el estándar de atención para los pacientes con cáncer de vejiga avanzado durante más de tres décadas. El panorama del tratamiento del cáncer de vejiga ha sido revolucionado por la reciente aprobación de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de inmunoterapia (inhibidores del punto de control inmunitario anti-PD-1 y anti-PD-L1), erdafitinib (un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos) y enfortumab vedotin (un conjugado anticuerpo-fármaco)2,3,4. Sin embargo, no hay biomarcadores clínicamente aprobados disponibles para predecir las respuestas a la quimioterapia o la inmunoterapia. Existe una necesidad crítica de generar modelos preclínicos informativos que puedan mejorar la comprensión de los mecanismos que impulsan la progresión del cáncer de vejiga y desarrollar biomarcadores predictivos para diferentes modalidades de tratamiento.
Un obstáculo importante en la investigación traslacional de la vejiga es la falta de modelos preclínicos que recapitulen la patogénesis del cáncer de vejiga humana y las respuestas al tratamiento 5,6. Se han desarrollado múltiples modelos preclínicos, incluyendo modelos 2D in vitro (líneas celulares o células reprogramadas condicionalmente), modelos 3D in vitro (organoides, impresión 3D) y modelos in vivo (xenoinjerto, inducido por carcinógenos, modelos genéticamente modificados y xenoinjerto derivado del paciente)2,6. Los modelos de ratón genéticamente modificados (GEMM) son útiles para muchas aplicaciones en la biología del cáncer de vejiga, incluidos los análisis de fenotipos tumorales, las investigaciones mecanicistas de genes candidatos y / o vías de señalización, y la evaluación preclínica de respuestas terapéuticas 6,7. Los GEMM pueden utilizar recombinasas específicas del sitio (Cre-loxP) para controlar las deleciones genéticas en uno o más genes supresores de tumores. El proceso de generar GEMM deseados con múltiples deleciones de genes lleva mucho tiempo, es laborioso y costoso5. El objetivo general de este método es desarrollar un método rápido y eficiente de administración de Cre ex vivo para establecer modelos de triple knockout (TKO) de vejiga a partir de células uroteliales normales de ratón portadoras de alelos triples floxed (Trp53, Pten y Rb1)8. La principal ventaja del método ex vivo es el flujo de trabajo rápido (1-2 semanas en lugar de años de cría de ratones). Este artículo describe el protocolo para la recolección de células uroteliales normales con alelos floxados, transducción de adenovirus ex vivo, cultivos de organoides y caracterización in vitro e in vivo en ratones inmunocompetentes C57 BL/6J. Este método se puede utilizar además para generar organoides de cáncer de vejiga clínicamente relevantes en ratones inmunocompetentes que albergan cualquier combinación de alelos floxed.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#956;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 1.5 inches needle</td>
			<td>EXELINT International</td>
			<td>26406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)</td>
			<td>UI Viral Vector Core</td>
			<td>VVC-U of Iowa-5-HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57 BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal-stripped FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine substitute (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mammary Epithelial Cell Growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix extracts from Engelbreth&#8211;Holm&#8211;Swarm mouse sarcomas (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M7019</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK7</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-23876</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab735</td>
			<td>IHC 1:100, IF 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Upk3</td>
			<td>Fitzgerald</td>
			<td>10R-U103A</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Vimentin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-6260</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal rat anti-CK8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-s</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell vios 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51033557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal chicken anti-CK5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td>IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signature benchtop shaking incubator Model 1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td>35962-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Processing Gel (HistoGel)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade size 10</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall T1 centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells

El cáncer de vejiga es un área poco estudiada, particularmente en modelos de ratón genéticamente modificados (GEMM). Los GEMM endogámicos con sitios Cre y loxP específicos de tejidos han sido los estándares de oro para la orientación génica condicional o inducible. Para proporcionar modelos experimentales más rápidos y eficientes, se desarrolla un sistema de cultivo de organoides ex vivo utilizando adenovirus Cre y células uroteliales normales que transportan múltiples alelos loxP de los supresores tumorales Trp53, Pten y Rb1. Las células uroteliales normales se disocian enzimáticamente de cuatro vejigas de ratones triple floxed (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). Las células uroteliales se transducen ex vivo con adenovirus-Cre impulsado por un promotor del CMV (Ad5CMVCre). Los organoides vesicales transducidos se cultivan, propagan y caracterizan in vitro e in vivo. La PCR se utiliza para confirmar las deleciones de genes en Trp53, Pten y Rb1. La tinción de inmunofluorescencia (IF) de organoides demuestra una expresión positiva de los marcadores de linaje urotelial (CK5 y p63). Los organoides se inyectan por vía subcutánea en ratones huésped para la expansión del tumor y los pasajes en serie. La inmunohistoquímica (IHC) de los xenoinjertos exhibe expresión positiva de CK7, CK5 y p63 y expresión negativa de CK8 y Uroplakin 3. En resumen, la deleción de genes mediada por adenovirus de células uroteliales de ratón diseñadas con sitios loxP es un método eficiente para probar rápidamente el potencial tumorígeno de alteraciones genéticas definidas.

El flujo de trabajo de las deleciones de genes mediadas por adenovirus-Cre en células uroteliales de ratón se muestra en la Figura 1A. El video que lo acompaña demuestra cómo las células uroteliales se disocian del fondo de ojo de la vejiga y cómo las células triples floxadas se transducen ex vivo con Ad5CMVCre. La Figura 1A mostró que la submucosa mínima y las células musculares se disociaron después de la digestión enzimática. Para confir...

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Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Este protocolo describe el proceso de generación y caracterización de organoides uroteliales de ratón que albergan deleciones en genes de interés. Los métodos incluyen la recolección de células uroteliales de ratón, la transducción ex vivo con adenovirus que impulsa la expresión de Cre con un promotor de CMV y la caracterización in vitro e in vivo.

Ex Vivo Modelo organoide de deleciones genéticas mediadas por adenovirus-Cre en células uroteliales de ratón

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Desarrollamos un protocolo rápido y eficiente para generar organoides de cáncer de vejiga a través de la edición de genes ex vivo de células uroteliales normales de ratón portadoras de alelos floxados en genes de interés. Este método ex vivo tiene un flujo de trabajo de una a dos semanas en lugar de años de reproducción de ratones, y es altamente eficiente en la transducción de adenovirus en las deleciones de genes mediadas por Cre. Para comenzar, prepare todos los instrumentos y reactivos estériles, incluidas tijeras, fórceps, DPBS en platos de cultivo de 35 mililitros, etanol al 70%, gasas y toallas de papel limpias.A continuación, limpie todas las superficies del área de disección y cubra el área de disección con una toalla de papel limpia. Coloque el ratón sacrificado en la gasa en el área de disección y rocíe etanol al 70% en el abdomen del ratón, luego use tijeras de disección estériles, haga una incisión abdominal en la línea media inferior para exponer la vejiga. Ahora, use los fórceps para agarrar y tirar suavemente hacia arriba de la vejiga para identificar la unión ureterovesical bilateral.Usando tijeras, retire el fondo de ojo de la vejiga, siguiendo la línea límite entre las dos aberturas del uréter y transfiera la vejiga a un plato estéril que contenga 2 mililitros de DPBS, luego retire el tejido graso y conectivo y coloque la vejiga en un nuevo plato que contenga 2 mililitros de DPBS. También retire el adenovirus del almacenamiento de menos 80 grados centígrados y manténgalo en hielo. Para la disociación celular, prepare todos los instrumentos y reactivos estériles como se describe en el manuscrito, luego en un gabinete de bioseguridad, transfiera la vejiga a un plato de 35 milímetros y lávese con 2 mililitros de DPBS estéril.Recolecte los tejidos de la vejiga de cuatro ratones en un plato con un mililitro de medio de cultivo completo sin FBS despojado de carbón. A continuación, usando una cuchilla quirúrgica, picar cada vejiga en cuatro piezas iguales, luego usando fórceps, desplegar la vejiga para exponer la superficie del urotelio al medio. Transfiera las piezas de la vejiga y el medio a un tubo centrífugo de 15 mililitros.Lave el plato dos veces con 2 mililitros de medio de cultivo completo sin FBS despojado de carbón y agregue el lavado al tubo de la centrífuga, llevando el volumen total a 5 mililitros. A continuación, agregue una mezcla de colagenasa e hialuronidasa y coloque el tubo horizontalmente en una incubadora de agitador orbital de 37 grados Celsius durante 30 minutos a 200 RPM. Después de la digestión del tejido, agregue un volumen igual de FBS y DPBS con un 10% de brocha de carbón en el tubo y centrífuga a 200 veces g durante 5 minutos.Después de desechar el sobrenadante, agregue 2 mililitros de sustituto de tripsina en el pellet celular y mezcle bien, luego incube el tubo a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 4 minutos. Después de la incubación, pipetee las células hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una punta P1000 estándar y agregue 5 mililitros de FBS y DPBS con 10% de carbón. Colar las células disociadas a través de un colador de células estériles de 100 micrómetros y recoger la suspensión celular en un tubo de 50 mililitros.Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros y centrífuga a 200 veces g durante 5 minutos. Después de retirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 1 mililitro de medio de cultivo completo. Cuente el número de células usando un hemocitómetro y una placa de 0,5 veces 10 a la sexta célula en cada pocillo de una placa de 24 pocillos con 0,5 mililitros de medio de cultivo completo fresco.A continuación, saque los extractos de matriz de las células de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm del almacenamiento de menos 20 grados centígrados y descongele en hielo. Además, precaliente una placa de 6 pocillos en una incubadora de células Celsius de 37 grados. Para la transducción adenoviral, agregue 2 microlitros de adenovirus en la placa de 24 pocillos y mezcle bien con las células uroteliales disociadas.Para mejorar la eficacia de la transducción, realice la espinoculación centrifugando la placa a 300 veces g durante 30 minutos, luego incube la placa a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 1 hora. Transfiera las células y el medio del pozo a un tubo de 15 mililitros y centrífuga a 200 veces g durante 5 minutos. Después de desechar el sobrenadante, agregue 50 microlitros de medio de cultivo completo y mezcle bien con las células en la parte inferior.A continuación, agregue 140 microlitros de extracto de matriz y mezcle suavemente bien para evitar burbujas de aire, luego cree cúpulas para organoides agregando rápidamente 50 microlitros de la solución por cúpula en la placa de 6 pocillos precalentada. Incuba la placa y deja que las cúpulas se solidifiquen durante 5 minutos. Después de 5 minutos, voltee la placa de 6 pocillos boca abajo y continúe la solidificación durante 25 minutos adicionales.Después de la incubación, agregue 2.5 mililitros de medio de cultivo completo a cada pozo y coloque la placa en una incubadora para cultivo de organoides. La proteína verde fluorescente se detectó en casi el 100% de las células, lo que sugiere una alta eficiencia de la transducción de adenovirus. La tinción de hematoxilina y eosina y la inmunohistoquímica de tumores organoides de triple knockout mostraron la morfología del carcinoma urotelial de alto grado con expresión proteica positiva de marcadores de subtipo basal de CK5 y p63.Los alelos floxados no recombinados se detectaron en células uroteliales, no tratadas con adenovirus, mientras que los alelos recombinados se observaron en los organoides triple knockout. En general, se necesitaron de 2 a 3 semanas para formar un tumor subcutáneo de 2 centímetros. La inmunohistoquímica de organoides de triple knockout, xenoinjertos in vivo, mostró expresión positiva de las proteínas CK7, CK5 y p63.Se detectó expresión negativa para las proteínas CK8 y uroplaquina. El marcador mesénquima, la vimentina, se detectó solo en la cápsula tumoral o en el estroma. La disociación de la vejiga del ratón no debe exceder los 30 minutos.Un tiempo de disociación más largo puede aumentar en el porcentaje de las células del estroma, como las células endoteliales y los fibroblastos Este enfoque se puede combinar con la clasificación celular o el tipo celular de un adenovirus específico para generar el tipo celular de organoides específicos, como la luz frente a los organoides basales.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

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los<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal modelo de tumor de disco: visualización y cuantificación de la expresión génica y la invasividad tumoral Uso Genético Mosaicos

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

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Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses para inmunomodulación Tumor objetivo: diseño y evaluación Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Modelo de matriz extracelular ósea tridimensional para el Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Evaluación de la capacidad de diferenciación de las células epiteliales de próstata de ratón utilizando el cultivo organoide

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Un modelo de corte de cerebro ex vivo para estudiar y atacar el crecimiento del tumor metastásico cerebral con cáncer de mama

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Definición de las funciones genéticas en la tumorigénesis mediante la ablación ex vivo de alelos floxados en células tumorales malignas de la vaina del nervio periférico

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Mantenimiento de la diversidad celular del glioblastoma humano ex vivo mediante cultivo de organoides tridimensionales

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...