Name: ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells at JoVE.com

Detta forskningsarbete stöddes delvis av NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 och R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation och Friends of Urology Foundation. Vi tackar Marisa Blask och Mila Pakhomova för korrekturläsningen av manuskriptet.

Alla djurprocedurer godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY (1395M, Biosafety 180501 and 180502). OBS: Utför steg 1-3 samma dag.
1. Dissektion av musblåsan
<ol><li>Förberedelse för dissektion<ol>
<li>Förbered alla sterila instrument inklusive sax, pincett, steril DPBS i 35 mm odlingsfat, 70% etanol, steril gasväv och rena pappershanddukar. Rengör alla ytor på dissektionsområdet. G...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2021.">Cancer statistics, 2021.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+bladder+cancer+research.">Preclinical models for bladder cancer research.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).</li><li>DeGraff, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+preclinical+models+for+the+advancement+of+translational+bladder+cancer+research.">Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).</li><li>Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+treatment+landscape+of+advanced+urothelial+carcinoma.">The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma.</a> Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).</li><li>Mullenders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+human+urothelial+cancer+organoids:+A+tool+for+bladder+cancer+research.">Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).</li><li>Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+bladder+cancer+in+mice:+opportunities+and+challenges.">Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).</li><li>Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mouse+models+in+oncology+research+and+cancer+medicine.">Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Fujii, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+histopathological+evaluation+of+organoids.">A simple method for histopathological evaluation of organoids.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).</li><li>Georgas, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+illustrated+anatomical+ontology+of+the+developing+mouse+lower+urogenital+tract.">An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract.</a> Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).</li><li>Santos, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+organoids+originating+from+Cd49f(high)+mouse+stem+cells+display+Notch-dependent+differentiation+capacity.">Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity.</a> Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+defined+disease+model+reveals+that+urothelial+cells+can+initiate+divergent+bladder+cancer+phenotypes.">A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intertumoral+heterogeneity+in+SCLC+is+influenced+by+the+cell+type+of+origin.">Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin.</a> Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).</li><li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer:+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung.">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li><li>Bottger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+heterogeneity+underlies+differential+cisplatin+sensitivity+in+mouse+models+of+small-cell+lung+cancer.">Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer.</a> Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).</li><li>Puzio-Kuter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+p53+and+Pten+promotes+invasive+bladder+cancer.">Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer.</a> Genes &amp; Development. 23 (6), 675-680 (2009).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mouse+models+of+bladder+cancer+identify+a+prognostic+signature+associated+with+risk+of+disease+progression.">Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression.</a> Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).</li><li>Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+genetic+removal+of+signaling+molecules+in+cultured+primary+mouse+embryonic+fibroblasts.">Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).</li><li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+interrogation+of+cancer+cell+of+origin+through+CRISPR+editing.">Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).</li></ol>

GEMM har varit guldstandarderna för cancermodellering initierad från normala celler, vilket gör att konsekvenserna av potentiella onkogena störningar (onkogen aktivering och / eller förlust av tumörsuppressorer) kan testas noggrant. Här tillhandahålls ett snabbt och effektivt protokoll för att generera organoider av blåscancer via ex vivo-genredigering av normala musuroteliala celler som bär floxerade alleler i gener av intresse. H&E- och IHC-färgning visar att TKO-organoider uppvisar histologi som ?...

Blåscancer är den fjärde vanligaste cancerformen hos män och drabbar mer än 80 000 personer årligen i USA1. Platinabaserad kemoterapi har varit vårdstandarden för patienter med avancerad blåscancer i mer än tre decennier. Landskapet för behandling av blåscancer har revolutionerats av det senaste Godkännandet av Food and Drug Administration (FDA) av immunterapi (anti-PD-1 och anti-PD-L1 immunkontrollpunktshämmare), erdafitinib (en fibroblasttillväxtfaktorreceptorhämmare) och enfortumab vedotin (ett antikropps-läkemedelskonjugat)2,3,4. Det finns dock inga kliniskt godkända biomarkörer tillgängliga för att förutsäga svaren på kemoterapi eller immunterapi. Det finns ett kritiskt behov av att generera informativa prekliniska modeller som kan förbättra förståelsen för de mekanismer som driver utvecklingen av urinblåsecancer och utveckla prediktiva biomarkörer för olika behandlingsmetoder.
Ett stort hinder i blåstranslationsforskning är bristen på prekliniska modeller som rekapitulerar human blåscancerpatogenes och behandlingssvar 5,6. Flera prekliniska modeller har utvecklats, inklusive in vitro 2D-modeller (cellinjer eller villkorligt omprogrammerade celler), in vitro 3D-modeller (organoider, 3D-utskrift) och in vivo-modeller (xenograft, cancerframkallande, genetiskt modifierade modeller och patient-härledd xenograft)2,6. Genetiskt modifierade musmodeller (GEMM) är användbara för många tillämpningar inom blåscancerbiologi, inklusive analyser av tumörfenotyper, mekanistiska undersökningar av kandidatgener och / eller signalvägar och preklinisk utvärdering av terapeutiska svar 6,7. GEMM kan använda platsspecifika rekombinaser (Cre-loxP) för att kontrollera genetiska deletioner i en eller flera tumörsuppressorgener. Processen att generera önskade GEMM med flera genraderingar är tidskrävande, mödosam och dyr5. Det övergripande målet med denna metod är att utveckla en snabb och effektiv metod för ex vivo Cre-leverans för att etablera TKO-modeller (bladder triple knockout) från normala mus-urotelceller som bär trippel floxerade alleler (Trp53, Pten och Rb1)8. Den stora fördelen med ex vivo-metoden är det snabba arbetsflödet (1-2 veckor istället för år av musavel). Denna artikel beskriver protokollet för skörd av normala urotelceller med floxerade alleler, ex vivo adenovirustransduktion, organoidkulturer och in vitro- och in vivo-karakterisering hos immunkompetenta C57 BL / 6J-möss. Denna metod kan vidare användas för att generera kliniskt relevanta organoider av blåscancer hos immunkompetenta möss som hyser någon kombination av floxerade alleler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#956;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 1.5 inches needle</td>
			<td>EXELINT International</td>
			<td>26406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)</td>
			<td>UI Viral Vector Core</td>
			<td>VVC-U of Iowa-5-HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57 BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal-stripped FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine substitute (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mammary Epithelial Cell Growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix extracts from Engelbreth&#8211;Holm&#8211;Swarm mouse sarcomas (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M7019</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK7</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-23876</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab735</td>
			<td>IHC 1:100, IF 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Upk3</td>
			<td>Fitzgerald</td>
			<td>10R-U103A</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Vimentin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-6260</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal rat anti-CK8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-s</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell vios 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51033557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal chicken anti-CK5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td>IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signature benchtop shaking incubator Model 1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td>35962-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Processing Gel (HistoGel)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade size 10</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall T1 centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells

Blåscancer är ett understuderat område, särskilt i genetiskt modifierade musmodeller (GEMM). Inavlade GEMM med vävnadsspecifika Cre- och loxP-platser har varit guldstandarden för villkorlig eller inducerbar geninriktning. För att ge snabbare och effektivare experimentella modeller utvecklas ett ex vivo organoidodlingssystem med adenovirus Cre och normala urotelceller som bär flera loxP-alleler av tumörsuppressorerna Trp53, Pten och Rb1. Normala urotelceller avlägsnas enzymatiskt från fyra blåsor av trippel floxerade möss (Trp53f / f: Ptenf / f: Rb1f / f). De uroteliala cellerna transduceras ex vivo med adenovirus-Cre som drivs av en CMV-promotor (Ad5CMVCre). De transducerade blåsorganoiderna odlas, förökas och karakteriseras in vitro och in vivo. PCR används för att bekräfta genraderingar i Trp53, Pten och Rb1. Immunofluorescens (IF) färgning av organoider visar positivt uttryck av uroteliala härstamningsmarkörer (CK5 och p63). Organoiderna injiceras subkutant i värdmöss för tumörutvidgning och seriella passager. Immunohistokemin (IHC) hos xenografter uppvisar positivt uttryck av CK7, CK5 och p63 och negativt uttryck av CK8 och Uroplakin 3. Sammanfattningsvis är adenovirusmedierad genradering från musurotelceller konstruerade med loxP-platser en effektiv metod för att snabbt testa den tumörogena potentialen hos definierade genetiska förändringar.

Arbetsflödet för adenovirus-Kre-medierade genraderingar i musurotelceller visas i figur 1A. Den medföljande videon visar hur de uroteliala cellerna avlägsnas från urinblåsans fundus och hur de tredubbla floxerade cellerna transduceras ex vivo med Ad5CMVCre. Figur 1A visade att minimal submukosa och muskelceller avlägsnades efter enzymsmältning. För att bekräfta effektiviteten av adenovirus-Cre-leverans transducerades disassocierade urotelcelle...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells at JoVE.com

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Detta protokoll beskriver processen för generering och karakterisering av musuroteliala organoider som hyser deletioner i gener av intresse. Metoderna inkluderar skörd av musurotelceller, ex vivo-transduktion med adenovirus som driver Cre-uttryck med en CMV-promotor och in vitro såväl som in vivo-karakterisering .

Ex Vivo Organoidmodell av adenovirus-kreiterade genraderingar i musurotelceller

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Vi utvecklade ett snabbt och effektivt protokoll för att generera organoider av urinblåsecancer via ex vivo-genredigering av normala musurotelceller som bär floxerade alleler i gener av intresse. Denna ex vivo-metod har ett arbetsflöde på en till två veckor istället för år av musavel, och den är mycket effektiv vid adenovirustransduktion på de Cre-medierade genraderingarna. Börja med att förbereda alla sterila instrument och reagenser, inklusive sax, pincett, DPBS i 35-milliliter odlingsrätter, 70% etanol, gasväv och rena pappershanddukar.Rengör sedan alla ytor på dissektionsområdet och täck dissektionsområdet med en ren pappershandduk. Placera den avlivade musen på gasbindningen i dissektionsområdet och spraya 70% etanol på musens buk, använd sedan steril dissektionssax, gör ett nedre mittlinje buksnitt för att exponera blåsan. Använd nu tången för att ta tag i och dra försiktigt upp blåsan för att identifiera den bilaterala ureterovesiska korsningen.Använd sax, ta bort blåsans fundus, följ gränslinjen mellan de två urinledaröppningarna och överför blåsan till en steril skål innehållande 2 ml DPBS, ta sedan bort fett- och bindväven och sätt blåsan i en ny skål som innehåller 2 ml DPBS. Ta också bort adenoviruset från minus 80 grader Celsius-lagringen och håll det på is. För celldissociation, förbered alla sterila instrument och reagenser som beskrivs i manuskriptet, överför sedan blåsan i ett biosäkerhetsskåp till en 35-millimeters skål och tvätta med 2 ml steril DPBS.Samla blåsvävnader från fyra möss i en skål med en milliliter komplett odlingsmedium utan kolavskalad FBS. Därefter, med hjälp av ett kirurgiskt blad, haka varje urinblåsa i fyra lika stora bitar, använd sedan pincett, vik ut blåsan för att utsätta urotelytan för mediet. Överför blåsbitarna och mediet till ett centrifugrör på 15 milliliter.Tvätta skålen två gånger med 2 ml komplett odlingsmedium utan kolavskalad FBS och tillsätt tvätten till centrifugröret, vilket ger den totala volymen till 5 ml. Tillsätt sedan en kollagenas- och hyaluronidasblandning och placera röret horisontellt i en 37-graders Celsius orbital shaker-inkubator i 30 minuter vid 200 RPM. Efter vävnadssmältning, tillsätt en lika stor volym 10% kolavskalad FBS och DPBS i röret och centrifugera vid 200 gånger g i 5 minuter.Efter att ha kasserat supernatanten, tillsätt 2 ml trypsinsubstitut i cellpelleten och blanda väl, inkubera sedan röret vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 4 minuter. Efter inkubation, pipettera cellerna upp och ner 10 gånger med en standard P1000-spets och tillsätt 5 ml 10% kolavskalad FBS och DPBS. Sila de dissocierade cellerna genom en 100 mikrometer steril cellsil och samla cellsuspensionen i ett 50-milliliter rör.Överför cellsuspensionen till ett 15 ml rör och centrifugera vid 200 gånger g i 5 minuter. Efter avlägsnande av supernatanten, återsuspendera pelleten i 1 milliliter komplett odlingsmedium. Räkna antalet celler med hjälp av en hemocytometer och platta 0,5 gånger 10 till de 6: e cellerna i varje brunn på en 24-brunnsplatta med 0,5 ml färskt komplett odlingsmedium.Ta sedan ut matrisextrakten från Engelbreth-Holm-Swarm mussarkomceller från minus 20 grader Celsius lagring och tina dem på is. Förvarda också en 6-brunnsplatta i en 37-graders Celsius-cellinkubator. För adenoviral transduktion, tillsätt 2 mikroliter adenovirus i 24-brunnsplattan och blanda väl med de dissocierade urotelcellerna.För att förbättra transduktionseffekten, utför spinokulering genom att centrifugera plattan vid 300 gånger g i 30 minuter, inkubera sedan plattan vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 1 timme. Överför celler och medium från brunnen till ett 15-milliliter rör och centrifugera vid 200 gånger g i 5 minuter. Efter att ha kasserat supernatanten, tillsätt 50 mikroliter av komplett odlingsmedium och blanda väl med cellerna längst ner.Tillsätt sedan 140 mikroliter matrisextrakt och blanda försiktigt väl för att undvika luftbubblor, skapa sedan kupoler för organoider genom att snabbt tillsätta 50 mikroliter av lösningen per kupol i den förvärmda 6-brunnsplattan. Inkubera plattan och låt kupolerna stelna i 5 minuter. Efter 5 minuter, vänd 6-brunnsplattan upp och ner och fortsätt stelningen i ytterligare 25 minuter.Efter inkubation tillsätt 2,5 ml komplett odlingsmedium till varje brunn och placera plattan i en inkubator för organoidkultur. Det gröna fluorescerande proteinet detekterades i nästan 100% av cellerna, vilket tyder på hög effektivitet av adenovirustransduktion. Hematoxylin- och eosinfärgning och immunohistokemi av trippel knockout organoider tumörer visade morfologin hos högkvalitativt urotelcancer med positivt proteinuttryck av basala subtypmarkörer av CK5 och p63.De icke-rekombinerade floxerade allelerna detekterades i urotelceller, obehandlade med adenovirus, medan de rekombinerade allelerna observerades i de tredubbla knockoutorganoiderna. I allmänhet behövdes 2 till 3 veckor för att bilda en 2-centimeter subkutan tumör. Immunohistokemin hos trippel knockout-organoider, in vivo xenografter, visade positivt uttryck av CK7-, CK5- och p63-proteiner.Negativt uttryck detekterades för CK8- och uroplakinproteiner. Mesenkymmarkören, vimentin, detekterades endast i tumörkapseln eller stroma. Musblåsans dissociation får inte överstiga 30 minuter.En längre dissociationstid kan öka i andelen stromaceller, såsom endotelceller och fibroblasterna Detta tillvägagångssätt kan kombineras med cellsortering eller celltyp ett specifikt adenovirus för att generera celltypen av specifika organoider, såsom lumen kontra basala organoider.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal skiva Tumör Modell: Visualisering och kvantifiering av genuttryck och tumör invasiv använda genetiska mosaiker

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolering av cirkulerande tumörceller i en ortotopisk musmodell av kolorektal cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR bedömning av pH, pO2, Redox Status, och koncentrationer av fosfat och glutation i den tumör mikromiljö

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

En preklinisk musmodell av osteosarkom att definiera den extracellulära vesikler-medierad kommunikationen mellan tumör och mesenkymala stamceller

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirus för tumör-riktade immunmodulering: Design och utvärdering Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Tredimensionella ben extracellulärmatrix modell för osteosarkom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Utvärdering av differentierings kapacitet av mus prostata epitelceller med Organoid kultur

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

En Ex Vivo Brain Slice-modell för att studera och rikta bröstcancer Hjärnans metastatiska tumörtillväxt

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Definiera genfunktioner i tumorigenes genom ex vivo-ablation av floxerade alleler i maligna perifera nervhöljestumörceller

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Upprätthålla humant glioblastom cellulär mångfald ex vivo med hjälp av tredimensionell organoidkultur

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...