Name: ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells at JoVE.com

Bu araştırma çalışması kısmen NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 ve R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Kanser Merkezi Çekirdek Destek Hibesi), Roswell Park Alliance Vakfı ve Üroloji Dostları Vakfı tarafından desteklenmiştir. Marisa Blask ve Mila Pakhomova'ya makaleyi düzelttikleri için teşekkür ederiz.

Tüm hayvan prosedürleri, Roswell Park Kapsamlı Kanser Merkezi, Buffalo, NY'deki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (1395M, Biyogüvenlik 180501 ve 180502). NOT: Adım 1-3'ü aynı gün gerçekleştirin.
1. Fare mesanesinin diseksiyonu
<ol><li>Diseksiyon için hazırlık<ol>
<li>Makas, forseps, steril DPBS dahil olmak üzere tüm steril aletleri 35 mm kültür tabaklarda, %70 etanol, steril gazlı bez ve temiz kağıt hav...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2021.">Cancer statistics, 2021.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+bladder+cancer+research.">Preclinical models for bladder cancer research.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).</li><li>DeGraff, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+preclinical+models+for+the+advancement+of+translational+bladder+cancer+research.">Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).</li><li>Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+treatment+landscape+of+advanced+urothelial+carcinoma.">The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma.</a> Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).</li><li>Mullenders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+human+urothelial+cancer+organoids:+A+tool+for+bladder+cancer+research.">Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).</li><li>Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+bladder+cancer+in+mice:+opportunities+and+challenges.">Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).</li><li>Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mouse+models+in+oncology+research+and+cancer+medicine.">Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).</li><li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity,+metastasis,+and+antiandrogen+resistance.">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Fujii, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+histopathological+evaluation+of+organoids.">A simple method for histopathological evaluation of organoids.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).</li><li>Georgas, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+illustrated+anatomical+ontology+of+the+developing+mouse+lower+urogenital+tract.">An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract.</a> Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).</li><li>Santos, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+organoids+originating+from+Cd49f(high)+mouse+stem+cells+display+Notch-dependent+differentiation+capacity.">Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity.</a> Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+defined+disease+model+reveals+that+urothelial+cells+can+initiate+divergent+bladder+cancer+phenotypes.">A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intertumoral+heterogeneity+in+SCLC+is+influenced+by+the+cell+type+of+origin.">Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin.</a> Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).</li><li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer:+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung.">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li><li>Bottger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+heterogeneity+underlies+differential+cisplatin+sensitivity+in+mouse+models+of+small-cell+lung+cancer.">Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer.</a> Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).</li><li>Puzio-Kuter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+p53+and+Pten+promotes+invasive+bladder+cancer.">Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer.</a> Genes &amp; Development. 23 (6), 675-680 (2009).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mouse+models+of+bladder+cancer+identify+a+prognostic+signature+associated+with+risk+of+disease+progression.">Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression.</a> Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).</li><li>Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+genetic+removal+of+signaling+molecules+in+cultured+primary+mouse+embryonic+fibroblasts.">Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).</li><li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+interrogation+of+cancer+cell+of+origin+through+CRISPR+editing.">Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).</li></ol>

GEMM'ler, normal hücrelerden başlatılan kanser modellemesi için altın standartlar olmuştur ve potansiyel onkojenik pertürbasyonların (onkogen aktivasyonu ve / veya tümör baskılayıcıların kaybı) sonuçlarının titizlikle test edilmesini sağlar. Burada, ilgilenilen genlerde floksed aleller taşıyan normal fare ürotelyal hücrelerinin ex vivo gen düzenlemesi yoluyla mesane kanseri organoidlerinin üretilmesi için hızlı ve etkili bir protokol sağlanmaktadır. H&E ve IHC boyaması, TKO organoi...

Mesane kanseri erkeklerde dördüncü en sık görülen kanserdir ve Amerika Birleşik Devletleri'nde yılda 80.000'den fazla insanı etkilemektedir1. Platin bazlı kemoterapi, otuz yıldan fazla bir süredir ilerlemiş mesane kanseri olan hastalar için standart bakım olmuştur. Mesane kanseri tedavisinin manzarası, immünoterapi (anti-PD-1 ve anti-PD-L1 immün kontrol noktası inhibitörleri), erdafitinib (bir fibroblast büyüme faktörü reseptör inhibitörü) ve enfortumab vedotin (bir antikor-ilaç konjugat) 2,3,4'ün son Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) onayı ile devrim yaratmıştır. Bununla birlikte, kemoterapi veya immünoterapiye yanıtları tahmin etmek için klinik olarak onaylanmış biyobelirteçler mevcut değildir. Mesane kanseri progresyonunu yönlendiren mekanizmaların anlaşılmasını geliştirebilecek ve farklı tedavi modaliteleri için prediktif biyobelirteçler geliştirebilecek bilgilendirici preklinik modeller üretmek için kritik bir ihtiyaç vardır.
Mesane translasyonel araştırmalarında önemli bir engel, insan mesane kanseri patogenezini ve tedavi yanıtlarını özetleyen preklinik modellerin bulunmamasıdır 5,6. İn vitro 2D modeller (hücre hatları veya şartlı olarak yeniden programlanmış hücreler), in vitro 3D modeller (organoidler, 3D baskı) ve in vivo modeller (ksenogreft, kanserojen kaynaklı, genetik olarak tasarlanmış modeller ve hasta kaynaklı ksenograft) dahil olmak üzere çoklu klinik öncesi modeller geliştirilmiştir2,6. Genetiği değiştirilmiş fare modelleri (GEMM'ler), tümör fenotiplerinin analizleri, aday genlerin ve / veya sinyal yolaklarının mekanik araştırmaları ve terapötik yanıtların klinik öncesi değerlendirilmesi dahil olmak üzere mesane kanseri biyolojisindeki birçok uygulama için yararlıdır 6,7. GEMM'ler, bir veya daha fazla tümör baskılayıcı gendeki genetik delesyonları kontrol etmek için bölgeye özgü rekombinazları (Cre-loxP) kullanabilir. Çoklu gen delesyonları ile istenen GEM'leri üretme süreci zaman alıcı, zahmetli ve pahalıdır5. Bu yöntemin genel amacı, üçlü flokslu aleller (Trp53, Pten ve Rb1)8 taşıyan normal fare ürotelyal hücrelerinden mesane üçlü nakavt (TKO) modellerinin oluşturulması için hızlı ve etkili bir ex vivo Cre dağıtım yöntemi geliştirmektir. Exvivo yönteminin en büyük avantajı hızlı iş akışıdır (yıllarca fare yetiştiriciliği yerine 1-2 hafta). Bu makalede, immünkompetan C57 BL/6J farelerde floksed aleller, ex vivo adenovirüs transdüksiyonu, organoid kültürler ve in vitro ve in vivo karakterizasyon ile normal ürotelyal hücrelerin toplanması için protokol anlatılmaktadır. Bu yöntem, floksed alellerin herhangi bir kombinasyonunu barındıran immünkompetan farelerde klinik olarak ilgili mesane kanseri organoidleri üretmek için de kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#956;m sterile cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 1.5 inches needle</td>
			<td>EXELINT International</td>
			<td>26406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)</td>
			<td>UI Viral Vector Core</td>
			<td>VVC-U of Iowa-5-HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57 BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal-stripped FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine substitute (GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mammary Epithelial Cell Growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix extracts from Engelbreth&#8211;Holm&#8211;Swarm mouse sarcomas (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK20</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M7019</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-CK7</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-23876</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-p63</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab735</td>
			<td>IHC 1:100, IF 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Upk3</td>
			<td>Fitzgerald</td>
			<td>10R-U103A</td>
			<td>IHC 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-Vimentin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-6260</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal rat anti-CK8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I-s</td>
			<td>IF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell vios 160i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51033557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal chicken anti-CK5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td>IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signature benchtop shaking incubator Model 1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td>35962-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Processing Gel (HistoGel)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade size 10</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall T1 centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo organoid model of adenovirus-cre mediated gene deletions in mouse urothelial cells

Mesane kanseri, özellikle genetiği değiştirilmiş fare modellerinde (GEMM'ler) az çalışılmış bir alandır. Dokuya özgü Cre ve loxP bölgelerine sahip inbred GEMM'ler, koşullu veya indüklenebilir gen hedeflemesi için altın standartlar olmuştur. Daha hızlı ve daha verimli deneysel modeller sağlamak için, adenovirüs Cre ve tümör baskılayıcıları Trp53, Pten ve Rb1'in çoklu loxP alellerini taşıyan normal ürotelyal hücreler kullanılarak bir ex vivo organoid kültür sistemi geliştirilmiştir. Normal ürotelyal hücreler, üçlü flokslu farelerin dört mesanesinden enzimatik olarak ayrılır (Trp53 f / f: Pten f / f: Rb1 f / f). Ürotelyal hücreler, bir CMV promotörü (Ad5CMVCre) tarafından tahrik edilen adenovirüs-Cre ile ex vivo olarak dönüştürülür. Transdüke mesane organoidleri kültürlenir, yayılır ve in vitro ve in vivo olarak karakterize edilir. PCR, Trp53, Pten ve Rb1'deki gen delesyonlarını doğrulamak için kullanılır. Organoidlerin immünofloresan (IF) boyanması, ürotelyal soy belirteçlerinin (CK5 ve p63) pozitif ekspresyonunu gösterir. Organoidler, tümör genişlemesi ve seri pasajlar için konakçı farelere deri altından enjekte edilir. Ksenogreftlerin immünohistokimyası (IHC), CK7, CK5 ve p63'ün pozitif ekspresyonunu ve CK8 ve Uroplakin 3'ün negatif ekspresyonunu sergiler. Özetle, loxP bölgeleri ile tasarlanmış fare ürotelyal hücrelerinden adenovirüs aracılı gen delesyonu, tanımlanmış genetik değişikliklerin tümörojenik potansiyelini hızlı bir şekilde test etmek için etkili bir yöntemdir.

Fare ürotelyal hücrelerinde adenovirüs-Cre aracılı gen delesyonlarının iş akışı Şekil 1A'da gösterilmiştir. Eşlik eden video, ürotelyal hücrelerin mesanenin fundusundan nasıl ayrıldığını ve üçlü floksed hücrelerin Ad5CMVCre ile ex vivo olarak nasıl dönüştürüldüğünü göstermektedir. Şekil 1A , minimal submukoza ve kas hücrelerinin enzim sindiriminden sonra ilişkisinin kesildiğini göstermiştir. Adenovirüs-Cre da...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells at JoVE.com

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Bu protokol, ilgilenilen genlerde delesyon barındıran fare ürotelyal organoidlerinin üretilmesi ve karakterizasyonu sürecini açıklar. Yöntemler arasında fare ürotelyal hücrelerinin toplanması, bir CMV promotörü ile Cre ekspresyonunu yönlendiren adenovirüs ile ex vivo transdüksiyon ve in vitro ve in vivo karakterizasyon bulunmaktadır.

Eski Vivo Fare Ürotelyal Hücrelerinde Adenovirüs-Cre Aracılı Gen Delesyonlarının Organoid Modeli

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

İlgilenilen genlerde floksed aleller taşıyan normal fare ürotelyal hücrelerinin ex vivo gen düzenlemesi yoluyla mesane kanseri organoidleri üretmek için hızlı ve etkili bir protokol geliştirdik. Bu ex vivo yöntem, yıllarca fare yetiştiriciliği yerine bir ila iki haftalık bir iş akışına sahiptir ve Cre-mediated gen delesyonlarında adenovirüs transdüksiyonunda oldukça etkilidir. Başlamak için, makas, forseps, DPBS dahil olmak üzere tüm steril aletleri ve reaktifleri 35 mililitrelik kültür tabaklarında,% 70 etanol, gazlı bez ve temiz kağıt havlularda hazırlayın.Ardından, diseksiyon alanının tüm yüzeylerini temizleyin ve diseksiyon alanını temiz bir kağıt havlu ile örtün. Ötenazi fareyi diseksiyon bölgesindeki gazlı bezin üzerine yerleştirin ve farenin karnına% 70 etanol püskürtün, ardından steril diseksiyon makası kullanarak, mesaneyi açığa çıkarmak için daha düşük bir orta hat karın kesisi yapın. Şimdi, forsepsleri kullanarak iki taraflı üreterovezik kavşağı tanımlamak için mesaneyi yavaşça yukarı çekin.Makas kullanarak, iki üreter açıklığı arasındaki sınır çizgisini izleyerek mesane fundusunu çıkarın ve mesaneyi 2 mililitre DPBS içeren steril bir kaba aktarın, ardından yağ ve bağ dokusunu çıkarın ve mesaneyi 2 mililitre DPBS içeren yeni bir kaba koyun. Ayrıca adenovirüsü eksi 80 santigrat derece depodan çıkarın ve buz üzerinde tutun. Hücre ayrışması için, tüm steril aletleri ve reaktifleri makalede açıklandığı gibi hazırlayın, daha sonra bir biyogüvenlik kabininde, mesaneyi 35 milimetrelik bir kaba aktarın ve 2 mililitre steril DPBS ile yıkayın.Mesane dokularını dört fareden odun kömürü soyulmuş FBS olmadan bir mililitre tam kültür ortamına sahip bir kaba toplayın. Daha sonra, cerrahi bir bıçak kullanarak, her bir mesaneyi dört eşit parçaya bölün, ardından forseps kullanarak, ürotelyum yüzeyini ortama maruz bırakmak için mesaneyi açın. Mesane parçalarını ve ortamını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.Çanağı, kömürden arındırılmış FBS olmadan 2 mililitre tam kültür ortamı ile iki kez yıkayın ve yıkamayı santrifüj tüpüne ekleyerek toplam hacmi 5 mililitreye getirin. Daha sonra, bir kollajenaz ve hyaluronidaz karışımı ekleyin ve tüpü yatay olarak 200 RPM'de 30 dakika boyunca 37 derecelik bir santigrat derece orbital çalkalayıcı inkübatöre yerleştirin. Doku sindiriminden sonra, tüpe eşit hacimde% 10 odun kömürü soyulmuş FBS ve DPBS ekleyin ve 5 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj yapın.Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletine 2 mililitre tripsin ikamesi ekleyin ve iyice karıştırın, ardından tüpü 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 4 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, hücreleri standart bir P1000 ucuyla 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve 5 mililitre% 10 odun kömürü soyulmuş FBS ve DPBS ekleyin. Ayrışmış hücreleri 100 mikrometrelik steril bir hücre süzgeci ile süzün ve hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir tüpte toplayın.Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj yapın. Süpernatanı çıkardıktan sonra, peleti 1 mililitre tam kültür ortamında yeniden askıya alın. Bir hemositometre ve plaka kullanarak hücre sayısını 0,5 mililitre taze tam kültür ortamı içeren 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 6. hücrelere 0,5 çarpı 10 olarak sayın.Daha sonra, eksi 20 santigrat derece depolamadan Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom hücrelerinin matris özlerini çıkarın ve buz üzerinde çözün. Ayrıca, 37 derecelik bir santigrat hücre inkübatöründe 6 kuyucuklu bir plakayı önceden ısıtın. Adenoviral transdüksiyon için, 24 delikli plakaya 2 mikrolitre adenovirüs ekleyin ve ayrışmış ürotelyal hücrelerle iyice karıştırın.Transdüksiyon etkinliğini arttırmak için, plakayı 30 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj ederek spinokülasyon yapın, ardından plakayı 1 saat boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Hücreleri ve ortamı kuyudan 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj yapın. Süpernatanı attıktan sonra, 50 mikrolitre tam kültür ortamı ekleyin ve alttaki hücrelerle iyice karıştırın.Daha sonra, 140 mikrolitre matris özü ekleyin ve hava kabarcıklarını önlemek için yavaşça iyice karıştırın, ardından önceden ısıtılmış 6 delikli plakaya kubbe başına 50 mikrolitre çözelti ekleyerek organoidler için kubbeler oluşturun. Plakayı inkübe edin ve kubbelerin 5 dakika boyunca katılaşmasına izin verin. 5 dakika sonra, 6 delikli plakayı baş aşağı çevirin ve 25 dakika daha katılaşmaya devam edin.Kuluçkadan sonra, her bir kuyucuğa 2,5 mililitre tam kültür ortamı ekleyin ve plakayı organoid kültür için bir inkübatöre yerleştirin. Yeşil floresan protein, hücrelerin yaklaşık% 100'ünde tespit edildi ve bu da adenovirüs transdüksiyonunun yüksek verimliliğini düşündürdü. Üçlü nakavt organoid tümörlerinin hematoksilin ve eozin boyama ve immünohistokimyası, CK5 ve p63'ün bazal alt tip belirteçlerinin pozitif protein ekspresyonu ile yüksek dereceli ürotelyal karsinomun morfolojisini gösterdi.Rekombine edilmemiş floksed aleller, adenovirüs ile tedavi edilmemiş ürotelyal hücrelerde tespit edilirken, rekombine aleller üçlü nakavt organoidlerinde gözlendi. Genel olarak, 2 santimetre subkutan tümör oluşturmak için 2 ila 3 hafta gerekiyordu. Üçlü nakavt organoidlerinin immünohistokimyası, in vivo ksenogreftler, CK7, CK5 ve p63 proteinlerinin pozitif ekspresyonunu gösterdi.CK8 ve üroplakin proteinleri için negatif ekspresyon tespit edildi. Mezenkim belirteci vimentin, sadece tümör kapsülünde veya stromada tespit edildi. Fare mesane ayrışması 30 dakikayı geçmemelidir.Endotel hücreleri ve fibroblastlar gibi stroma hücrelerinin yüzdesinde daha uzun bir ayrışma süresi artabilir Bu yaklaşım, bazal organoidlere karşı lümen gibi spesifik organoidlerin hücre tipini üretmek için hücre sıralaması veya hücre tipi spesifik bir adenovirüs ile birleştirilebilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Kolorektal kanserli bir Ortotopik Fare Modelinde Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Vivo EPR pH, pO2, Redox durumu ve fosfat konsantrasyonları ve glutatyon tümör Microenvironment olarak değerlendirilmesi

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Tümör ve Mezenkimal Kök hücreler arasında ekstrasellüler vezikül aracılı iletişim tanımlamak için osteosarkom preklinik fare modeli

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirusler Immunomodulation tümör hedefli için: tasarım ve değerlendirme Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Üç boyutlu kemik hücre dışı matriks modeli osteosarkom için

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Organoid Kültürü Kullanarak Fare Prostat Epitel Hücrelerinin Ayırt Etme Kapasitesinin Değerlendirilmesi

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Meme Kanseri Beyin Metastatik Tümör Büyümesini İncelemek ve Hedeflemek için Ex Vivo Beyin Dilimi Modeli

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümör Hücrelerinde Floks Alellerinin Ex vivo Ablasyonu ile Tümörigenezde Gen Fonksiyonlarının Tanımlanması

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Üç Boyutlu Organoid Kültür Kullanarak İnsan Glioblastoma Hücresel Çeşitliliğinin Ex vivo Korunması

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...