Name: advancing high-resolution imaging of virus assemblies in liquid and ice
Uploaded: 2022-07-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice at JoVE.com

Forfatterne anerkender Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Department of Ophthalmology) for at levere renset AAV-3. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health og National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 til D.F.K.).

1. Lastning af prøveholderen til liquid-EM
<ol><li>Rengør siliciumnitrid (SiN) mikrochips ved at inkubere hver chip i 150 ml acetone i 2 minutter efterfulgt af inkubation i 150 ml methanol i 2 minutter. Lad chips tørre i laminær luftstrøm.</li>
	<li>Plasmarenser de tørrede chips ved hjælp af et glødeudladningsinstrument, der fungerer under standardbetingelser på 30 W, 15 mA i 45 s ved hjælp af Argon-gas.</li>
	<li>Læg en tør basismikrochip i spidsen af prøveholderen. Der tilsættes ~0,2 μ...

<ol>
	<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+structure,+function+and+regulation+of+type+III+secretion+systems.">Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).</li><li>Oikonomou, C. M., Chang, Y. -. W., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+view+into+prokaryotic+cell+biology+from+electron+cryotomography.">A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).</li><li>Murata, K., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+for+structural+analysis+of+dynamic+biological+macromolecules.">Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules.</a> Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).</li><li>DiMaio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+accuracy+models+from+4.5+&#197;+cryo-electron+microscopy+data+with+density-guided+iterative+local+refinement.">Atomic accuracy models from 4.5 &#197; cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement.</a> Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).</li><li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+protein+synthesis+based+on+cryo-electron+microscopy+of+the+E.+coli+ribosome.">A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome.</a> Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).</li><li>Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+TEM+of+biological+assemblies+in+liquid.">In situ TEM of biological assemblies in liquid.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).</li><li>Dearnaley, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-cell+electron+tomography+of+biological+systems.">Liquid-cell electron tomography of biological systems.</a> Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+wet+biological+samples+by+graphene+liquid+cell+transmission+electron+microscopy.">Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy.</a> Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Motion+of+DNA-Au+nanoconjugates+in+graphene+liquid+cell+electron+microscopy.">3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy.</a> Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).</li><li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells.">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336 (6077), 61-64 (2012).</li><li>Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+of+calcium+phosphate+revealed+by+in+situ+liquid-phase+electron+microscopy.">Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy.</a> Communications Chemistry. 1, 80 (2018).</li><li>Jonaid, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+human+viruses+in+liquid+droplets.">High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets.</a> Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).</li><li>Pohlmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+nanoparticles+interacting+with+glioblastoma+stem+cells.">Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells.</a> Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).</li><li>Jonaid, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tools+to+advance+high-resolution+imaging+in+liquid.">Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid.</a> Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).</li><li>Varano, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customizable+cryo-EM+chips+improve+3D+analysis+of+macromolecules.">Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules.</a> Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).</li><li>Alden, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM-on-a-chip:+Custom-designed+substrates+for+the+3D+analysis+of+macromolecules.">Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules.</a> Small. 15 (21), 1900918 (2019).</li><li>Tanner, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-SiN+&#8211;+An+alternative+substrate+to+visualize+active+viral+assemblies.">Cryo-SiN &#8211; An alternative substrate to visualize active viral assemblies.</a> Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).</li><li>Solares, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchip-based+structure+determination+of+disease-relevant+p53.">Microchip-based structure determination of disease-relevant p53.</a> Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).</li><li>Casasanta, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchip-based+structure+determination+of+low-molecular+weight+proteins+using+cryo-electron+microscopy.">Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy.</a> Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+data+acquisition+from+electron+microscopes+with+SerialEM.">Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM.</a> Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera&#8212;A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera&#8212;A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera.">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).</li><li>Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+adeno-associated+virus+serotype+3B+(AAV-3B):+Insights+into+receptor+binding+and+immune+evasion.">The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion.</a> Virology. 403 (1), 26-36 (2010).</li><li>Sharma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+grid-based+cryo-EM+of+PKC+binding+to+RACK1+on+the+ribosome.">Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome.</a> Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).</li><li>Kiss, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+enveloped+viruses+on+affinity+grids+for+downstream+cryo-electron+microscopy+applications.">Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).</li><li>Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+affinity+capture+devices&#8212;a+nanoscale+purification+platform+for+biological+in+situ+transmission+electron+microscopy.">The development of affinity capture devices&#8212;a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy.</a> Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).</li><li>Hui, S. W., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+biological+membranes.">Electron diffraction of wet biological membranes.</a> Science. 184 (4132), 77-78 (1974).</li><li>Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+phospholipid+bilayers.">Electron diffraction of wet phospholipid bilayers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).</li><li>Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+and+diffraction+of+wet+unstained+and+unfixed+biological+object.">Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object.</a> Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).</li><li>Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+wet+specimens+in+electron+microscopy.+Improved+environmental+chambers+make+it+possible+to+examine+wet+specimens+easily.">Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily.</a> Science. 186 (4162), 407-414 (1974).</li><li>Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+proteins:+Catalase.">Electron diffraction of wet proteins: Catalase.</a> Science. 177 (4045), 268-270 (1972).</li></ol>

Der præsenteres nye muligheder for at strømline nuværende liquid-EM-arbejdsgange ved hjælp af nye automatiserede værktøjer og teknologier tilpasset cryo-EM-feltet. Anvendelser, der involverer den nye mikrochipsandwichteknik, er vigtige i forhold til andre metoder, fordi de muliggør billeddannelsesanalyse i høj opløsning i flydende eller glasagtig is. Et af de mest kritiske trin i protokollen er at producere prøver med den ideelle væsketykkelse til at visualisere udsøgte detaljer på nanoskalaniveau. Ideelle o...

Biomedicinsk forskning forbedrer vores forståelse af menneskers sundhed og sygdom gennem udvikling af nye teknologier. Billeddannelse i høj opløsning ændrer vores syn på nanoverdenen - hvilket gør det muligt for os at studere celler og molekyler i udsøgte detaljer 1,2,3,4,5. Statisk information om dynamiske komponenter såsom bløde polymerer, proteinsamlinger eller humane vira afslører kun et begrænset øjebliksbillede af deres komplekse fortælling. For bedre at forstå, hvordan molekylære enheder fungerer, skal deres struktur og funktion undersøges i fællesskab.
Nylige fremskridt inden for produktion af materialer som atomtynd grafen eller siliciumbaserede mikrochips giver nye muligheder for strukturfunktionsanalyse i realtid ved hjælp af transmissionselektronmikroskoper (TEM'er). Disse materialer kan skabe hermetisk lukkede kamre til levende EM-billeddannelse 6,7,8,9,10,11. Det nye felt af væske-EM, stuetemperaturen korrelerer med cryo-EM, giver hidtil usete visninger af hårde eller bløde materialer i opløsning, så forskere samtidig kan studere strukturen og dynamikken i deres prøve. Liquid-EM-applikationer inkluderer realtidsoptagelser af terapeutiske nanopartikler, der interagerer med kræftstamceller samt ændringer i de molekylære forviklinger af virale patogener12,13,14.
Ligesom metodologiske fremskridt ansporede opløsningsrevolutionen inden for cryo-EM-feltet, er der behov for nye teknikker og metoder for at udvide brugen af væske-EM som et værktøj med høj kapacitet for det videnskabelige samfund. Det overordnede mål med de metoder, der præsenteres her, er at strømline protokoller til forberedelse af flydende EM-prøver. Rationalet bag de udviklede teknikker er at anvende nye mikrochipdesign og autoloader-enheder, der er egnede til både væske- og cryo-EM-dataindsamling (figur 1)7,14,15,16,17. Samlingerne forsegles mekanisk ved hjælp af standardgitterklip til automatiserede instrumenter, såsom Krios, som kan rumme flere prøver pr. session eller en F200C TEM (figur 2). Denne metode udvider brugen af billeddannelse i høj opløsning ud over standard cryo-EM-applikationer, der demonstrerer bredere formål til materialeanalyse i realtid.
I den aktuelle videoartikel præsenteres protokoller til fremstilling af virussamlinger i væske med og uden kommercielt tilgængelige prøveholdere. Ved hjælp af den specialiserede prøveholder til væske-EM kan tynde væskeprøver give strukturelle oplysninger, der kan sammenlignes med cryo-EM-prøver, samt dynamisk indsigt i prøverne. Også demonstreret er metoder til forberedelse af flydende prøver ved hjælp af autoloaderværktøjer til rutiner med høj kapacitet. Den største fordel i forhold til andre teknikker er, at automatiseret prøveproduktion giver brugeren mulighed for hurtigt at vurdere deres prøver for optimal tykkelse og elektrondosering inden dataindsamling. Denne screeningsteknik identificerer hurtigt ideelle områder til realtidsoptagelser i væske eller is12,14,18,19. Med henblik på bestemmelse af 3D-struktur kan liquid-EM supplere de veletablerede cryo-EM-metoder, der er implementeret i cryo-EM. Læsere, der anvender konventionelle TEM- eller cryo-EM-teknologier, kan overveje at bruge flydende EM-arbejdsgange til at give nye, dynamiske observationer af deres prøver på en måde, der supplerer deres nuværende strategier.
Virusprøver, der anvendes i denne protokol, omfatter oprenset adeno-associeret virussubtype 3 (AAV) opnået som gave og dyrket under standardbetingelser12. Der blev også anvendt ikke-infektiøse SARS CoV-2 subvirale samlinger afledt af serum fra COVID-19-patienter12 og opnået fra en kommerciel kilde. Endelig blev oprensede simian rotavirus (SA11 stamme) dobbeltlagspartikler (DLP'er) opnået fra laboratoriet af Dr. Sarah M. McDonald Esstman ved Wake Forest University og dyrket ved hjælp af standardbetingelser 6,17. Softwarepakker, der er beskrevet her, er frit tilgængelige, og linkene er angivet i afsnittet Materialetabel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A11-1</td>
			<td>1 Liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoloader clipping tool</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Also SubAngstrom supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoloader grid clips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>top and bottom clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon-coated gold EM grids</td>
			<td>Electron Microcopy Sciences</td>
			<td>CF400-AU-50</td>
			<td>400-mesh, 5-nm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVID-19 patient serum</td>
			<td>RayBiotech</td>
			<td>CoV-Pos-S-500</td>
			<td>500 microliters of PCR+ serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A412-1</td>
			<td>1 Liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwell-integrad microchips</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>EPB-42A1-10</td>
			<td>10x10-mm window arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMWindows microchips</td>
			<td>Simpore Inc.</td>
			<td>SN100-A10Q33B</td>
			<td>9 large windows, 10-nn thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMWindows microchips</td>
			<td>Simpore, Inc.&#160;</td>
			<td>SN100-A05Q33A</td>
			<td>9 small windows, 5-nm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top microchips</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>EPT-50W</td>
			<td>500 mm x 100 mm window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #1 filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001 090</td>
			<td>100 pieces, 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectView direct electron detector</td>
			<td>Direct Electron</td>
			<td></td>
			<td>6-micron pixel spacing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 3 EC direct electron detector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>14-micron pixel spacing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 655 Dry pump station</td>
			<td>Gatan, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Pump holder tip to 10-6 range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark IV Vitrobot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>state-of-the-art specimen preparation unit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow, glow discharge unit</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Negative polarity mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poseidon Select specimen holder</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;FEI compatible;specimen holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos F200C TEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>200 kV; Liquid-TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios G3</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>300 kV; Cryo-TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freely available software</td>
			<td>Website link</td>
			<td></td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryoSPARC</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
			<td>other image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND4</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
			<td>CTF finding program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
			<td>molecular structure analysis software package</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advancing high-resolution imaging of virus assemblies in liquid and ice

Interessen for flydende elektronmikroskopi (liquid-EM) er steget kraftigt i de senere år, da forskere nu kan observere realtidsprocesser på nanoskala. Det er yderst ønskeligt at parre højopløselig cryo-EM-information med dynamiske observationer, da mange begivenheder forekommer på hurtige tidsskalaer - i millisekundområdet eller hurtigere. Forbedret viden om fleksible strukturer kan også hjælpe med at designe nye reagenser til bekæmpelse af nye patogener, såsom SARS-CoV-2. Endnu vigtigere er det, at se biologiske materialer i et flydende miljø giver et unikt glimt af deres præstationer i menneskekroppen. Her præsenteres nyudviklede metoder til at undersøge nanoskalaegenskaberne af virussamlinger i flydende og glasagtig is. For at nå dette mål blev veldefinerede prøver brugt som modelsystemer. Side om side sammenligninger af prøveforberedelsesmetoder og repræsentative strukturelle oplysninger præsenteres. Sub-nanometer funktioner er vist for strukturer løst i området ~ 3,5-Å-10 Å. Andre nylige resultater, der understøtter denne komplementære ramme, omfatter dynamisk indsigt i vaccinekandidater og antistofbaserede terapier, der er afbildet i væske. Samlet set fremmer disse korrelative applikationer vores evne til at visualisere molekylær dynamik, hvilket giver en unik kontekst for deres anvendelse i menneskers sundhed og sygdom.

En væske-TEM, der opererede ved 200 kV, blev brugt til alle væske-EM-billeddannelseseksperimenter, og en cryo-TEM, der opererede ved 300 kV, blev brugt til al cryo-EM-dataindsamling. Repræsentative billeder og strukturer af flere vira præsenteres for at demonstrere nytten af metoderne på tværs af forskellige forsøgspersoner. Disse omfatter rekombinant adeno-associeret virus subtype 3 (AAV), SARS-CoV-2 subvirale samlinger afledt af patientserumet og simian rotavirus dobbeltlagspartikler (DLP'er), SA11 stamme. For d...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice at JoVE.com

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Her beskrives protokoller til fremstilling af virussamlinger, der er egnede til væske-EM- og kryo-EM-analyse på nanoskala ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi.

Fremme af højopløsningsbilleddannelse af virussamlinger i væske og is

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...

Interessen for flydende elektronmikroskopi er steget kraftigt i de senere år, da vi nu kan visualisere ved nanoskala realtidsprocesser. Forbedret viden om disse fleksible strukturer kan hjælpe os med at udvikle nye reagenser til bekæmpelse af nye patogener såsom SARS-CoV-2. At se proteiner i et flydende miljø hjælper med at efterligne biologiske systemer og giver os mulighed for at se på proteinerne på en mere dynamisk måde.Og dette eksperiment vil vise dig nye teknikker til, hvordan du bruger og visualiserer proteiner i både glasagtige is og flydende miljøer. Nylige resultater omfatter dynamisk indsigt i vaccinekandidater i antistofbaserede terapier afbildet i væske. Korrelative væske- og cryo-EM-applikationer fremmer vores evne til at visualisere molekylær dynamik, hvilket giver en unik kontekst for menneskers sundhed og sygdom.Læsere, der anvender konventionelle TEM- eller cryo-EM-teknologier, kan overveje at implementere flydende EM-arbejdsgange for at give nye dynamiske observationer af deres prøver på en måde, der supplerer deres nuværende strategier. Kommercielt tilgængelige væske-EM-systemer kan levere flow, blanding, elektrokemiske stimuli og temperaturregulering, som er afgørende for mange realtidsbilleddannelsesapplikationer. Mikrochipsandwichmetoden, der præsenteres her, beskriver en simpel indgangsniveau måde at først se prøver i væske, før man tager springet til et mere komplekst kommercielt system til in situ-eksperimenter.Til at begynde med skal du rense siliciumnitridmikrochips ved at inkubere hver chip i 150 ml acetone i to minutter efterfulgt af inkubation i 150 ml methanol i to minutter. Lad chips tørre i en laminær luftstrøm. Plasmarengør de tørrede chips ved hjælp af et glødudladningsinstrument, der fungerer under standardbetingelser i 45 sekunder ved hjælp af argongas.Læg derefter en tør basemikrochip i spidsen af prøveholderen, og tilsæt ca. 0,2 mikroliter af prøven til basischippen. Efter inkubation i et til to minutter placeres den øverste chip på den våde basechip, der indeholder prøven. Plant samlingen sammen for at danne et hermetisk forseglet kabinet, der holdes på plads mekanisk af tre messingskruer.Pump spidsen til 10 til minus seks torr ved hjælp af en turbopumpet tør pumpestation. Indehaveren er nu klar til at blive indsat i TEM. Plasma rengør mikrochips og kulstofgitter ved hjælp af et glødudladningsinstrument i 45 sekunder.Og tilsæt omkring to mikroliter prøve til en glødudledt mikrochip placeret på en gelpakke. Fjern den overskydende opløsning ved hjælp af filterpapir eller en pipette, og inkuberes i et til to minutter. Tilsæt derefter det glødudledte kulstofgitter til den våde mikrochip, der indeholder prøven.Plant samlingen sammen ved hjælp af en enkelt vippeprøveholder ved stuetemperatur for at danne et hermetisk forseglet kabinet. Alternativt kan du bruge gitterclips til autolæssere og placere sandwichenheden på det nederste C-klip. Placer den øverste klemme oven på samlingen, og brug standardfastspændingsværktøjet til at forsegle samlingen sammen.Prøven er nu klar til at blive indsat i TEM. Prøver, der er anbragt i autolæssere, undersøges under kryoforhold eller ved stuetemperatur. Til væske-EM-billeddannelse skal du indlæse prøveholderen i TEM udstyret med en feltemissionspistol og operere ved 200 kilovolt.Tænd pistolen og juster mikroskoptrinnets eucentriske højde i forhold til prøven ved hjælp af woblerfunktionen, vippe prøven fra minus 15 grader til plus 15 grader i søjlen. Denne procedure justerer trinnet i Z-retningen for at imødekomme prøvetykkelsen og hjælper med at sikre en nøjagtig forstørrelse under billedoptagelse. Optag billeder som lange indrammede film eller individuelle billeder ved hjælp af softwarepakken til seriel dataindsamling, og implementer automatiserede billedbehandlingsrutiner.Anskaf billeder under lavdosisforhold ved forstørrelser fra 28.000X til 92.000X og 40 billeder i sekundet. Juster eksponeringstiderne for at minimere stråleskader på prøven, og brug et defokuseringsområde på minus en til fire mikrometer ved den specificerede forstørrelse. Hvis der opstår en tyk løsning, skal du bruge højere defokuseringsværdier eller vælge et andet interesseområde.Sørg for, at opløsningen er til stede i prøverne under hele billeddannelsessessionen ved at fokusere elektronstrålen på et offerområde, der ikke bruges til dataindsamling, før bobler er dannet. Analyser film for SARS-CoV-2-partikler ved hjælp af RELION-3.0.8-programmet eller anden billedbehandlingssoftware. Udfør bevægelseskorrektion ved hjælp af MotionCor2-programmet.Når det er korrigeret, udtrækkes partikler ved hjælp af autoplukningsværktøjet i programsoftwarepakken. Typiske boksstørrelser er 330 pixels for flydende prøver og 350 pixels for isprøver. Beregn de indledende rekonstruktioner ved hjælp af C1-symmetri med programmets 3D-indledende modelrutine og ab initio-modelindstillingerne i databehandlingssoftwarepakken.Udfør derefter forfiningsprotokoller i databehandlingssoftwaren. Undersøg resultaterne ved hjælp af en softwarepakke til molekylær strukturanalyse, mens du vurderer dynamiske ændringer. En sammenligning af væske-EM og cryo-EM strukturer i adeno-associeret virus subtype tre eller AAV er vist her.De repræsentative billeder viser strukturen af AAV i opløsningen og i is. De roterende visninger af AAV VP1-underenheden ekstraheret fra væske- og isstrukturerne er vist her. Disse billeder repræsenterer de dynamiske værdier i de flydende strukturer, der genereres ved hjælp af morph-kortfunktionen i molekylærstrukturanalysesoftwaren.De gennemsnitlige strukturer fra flere virussamlinger viser konformationsændringer med en ændring på næsten 5% diameter målt ved hjælp af EM-data. Et billede af SARS-CoV-2 subvirale samlinger isoleret fra serumfraktioner fra COVID-19-patienter er vist her. Disse hvide bobler indikerer tilstedeværelsen af væske i prøven.En EM-rekonstruktion af disse subvirale samlinger er vist her med farvede radiale tætheder ved fem nanometer skiver gennem kortet. Det repræsentative billede beskriver analysen af rotavirus dobbeltlagspartikler fremstillet i glasagtig is ved hjælp af mikrochipsandwichteknikken. Brug af vaskemidler, glycerol, polyethylen, glycoler og høje niveauer af sukker bør minimeres eller undgås til væske-EM-billeddannelse.Disse reagenser kan introducere artefakter, skabe overdreven boblende, hydrolyseprodukter og frie radikaler på grund af stråleskader. Brugen af disse protokoller vil gøre det muligt for forskere at kunne studere dynamiske processer ved atomdetaljer. Og dette spænder over flere videnskabsområder, herunder medicin, biovidenskab og materialeforskning.De protokoller, der præsenteres her, beskriver, hvordan state-of-the-art værktøjer kan give et spændende middel til at visualisere biologiske makromolekyler gennem nye øjne. Det flydende elektronmikroskopifelt kan hæve, hvordan vi studerer disse nye vira, der udgør en trussel mod menneskers sundhed, måske endda bidrage til vores pandemiske beredskabsforanstaltninger.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifikation af Plant Ice-bindende Proteiner Gennem Vurdering af Ice-omkrystallisation inhibering og isolering ved hjælp af is-affinitet Oprensning

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

High-resolution single particle analyse fra elektronkryo-mikroskopi billeder ved hjælp af SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomar skala strukturelle undersøgelser af makromolekylære forsamlinger af Solid-state Kernemagnetisk resonans-spektroskopi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Complexome-profilering med høj opløsning ved Cryoslicing BN-MS-analyse

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flydende kromatografi-massespektrometri-baserede metabolomiske analyse af hvedekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semikvantitativ analyse af peptidoglycan ved væskekromatografi, massespektrometri og bioinformatik

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

Generering og samling af virusspecifikke nukleocapsider af respiratorisk syncytial virus

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Förster Resonans Energioverførsel Målinger i Levende PlanteCeller

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...