Name: advancing high-resolution imaging of virus assemblies in liquid and ice
Uploaded: 2022-07-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice at JoVE.com

De auteurs erkennen Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Department of Ophthalmology) voor het verstrekken van gezuiverde AAV-3. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health en het National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 tot D.F.K.).

1. Laden van de monsterhouder voor liquid-EM
<ol><li>Reinig de siliciumnitride (SiN) microchips door elke chip gedurende 2 minuten in 150 ml aceton te incuberen, gevolgd door incubatie in 150 ml methanol gedurende 2 minuten. Laat chips drogen in laminaire luchtstroom.</li>
	<li>Plasma reinigt de gedroogde chips met behulp van een gloeid-ontladingsinstrument dat werkt onder standaardomstandigheden van 30 W, 15 mA gedurende 45 s met behulp van Argon-gas.</li>
	<li>Laad een droge basismicrochip in de punt...

<ol>
	<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+structure,+function+and+regulation+of+type+III+secretion+systems.">Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).</li><li>Oikonomou, C. M., Chang, Y. -. W., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+view+into+prokaryotic+cell+biology+from+electron+cryotomography.">A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).</li><li>Murata, K., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+for+structural+analysis+of+dynamic+biological+macromolecules.">Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules.</a> Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).</li><li>DiMaio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+accuracy+models+from+4.5+&#197;+cryo-electron+microscopy+data+with+density-guided+iterative+local+refinement.">Atomic accuracy models from 4.5 &#197; cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement.</a> Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).</li><li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+protein+synthesis+based+on+cryo-electron+microscopy+of+the+E.+coli+ribosome.">A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome.</a> Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).</li><li>Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+TEM+of+biological+assemblies+in+liquid.">In situ TEM of biological assemblies in liquid.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).</li><li>Dearnaley, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-cell+electron+tomography+of+biological+systems.">Liquid-cell electron tomography of biological systems.</a> Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+wet+biological+samples+by+graphene+liquid+cell+transmission+electron+microscopy.">Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy.</a> Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Motion+of+DNA-Au+nanoconjugates+in+graphene+liquid+cell+electron+microscopy.">3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy.</a> Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).</li><li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells.">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336 (6077), 61-64 (2012).</li><li>Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+of+calcium+phosphate+revealed+by+in+situ+liquid-phase+electron+microscopy.">Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy.</a> Communications Chemistry. 1, 80 (2018).</li><li>Jonaid, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+human+viruses+in+liquid+droplets.">High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets.</a> Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).</li><li>Pohlmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+nanoparticles+interacting+with+glioblastoma+stem+cells.">Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells.</a> Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).</li><li>Jonaid, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tools+to+advance+high-resolution+imaging+in+liquid.">Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid.</a> Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).</li><li>Varano, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customizable+cryo-EM+chips+improve+3D+analysis+of+macromolecules.">Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules.</a> Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).</li><li>Alden, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM-on-a-chip:+Custom-designed+substrates+for+the+3D+analysis+of+macromolecules.">Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules.</a> Small. 15 (21), 1900918 (2019).</li><li>Tanner, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-SiN+&#8211;+An+alternative+substrate+to+visualize+active+viral+assemblies.">Cryo-SiN &#8211; An alternative substrate to visualize active viral assemblies.</a> Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).</li><li>Solares, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchip-based+structure+determination+of+disease-relevant+p53.">Microchip-based structure determination of disease-relevant p53.</a> Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).</li><li>Casasanta, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchip-based+structure+determination+of+low-molecular+weight+proteins+using+cryo-electron+microscopy.">Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy.</a> Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+data+acquisition+from+electron+microscopes+with+SerialEM.">Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM.</a> Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera&#8212;A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera&#8212;A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera.">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).</li><li>Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+adeno-associated+virus+serotype+3B+(AAV-3B):+Insights+into+receptor+binding+and+immune+evasion.">The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion.</a> Virology. 403 (1), 26-36 (2010).</li><li>Sharma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+grid-based+cryo-EM+of+PKC+binding+to+RACK1+on+the+ribosome.">Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome.</a> Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).</li><li>Kiss, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+enveloped+viruses+on+affinity+grids+for+downstream+cryo-electron+microscopy+applications.">Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).</li><li>Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+affinity+capture+devices&#8212;a+nanoscale+purification+platform+for+biological+in+situ+transmission+electron+microscopy.">The development of affinity capture devices&#8212;a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy.</a> Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).</li><li>Hui, S. W., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+biological+membranes.">Electron diffraction of wet biological membranes.</a> Science. 184 (4132), 77-78 (1974).</li><li>Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+phospholipid+bilayers.">Electron diffraction of wet phospholipid bilayers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).</li><li>Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+and+diffraction+of+wet+unstained+and+unfixed+biological+object.">Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object.</a> Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).</li><li>Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+wet+specimens+in+electron+microscopy.+Improved+environmental+chambers+make+it+possible+to+examine+wet+specimens+easily.">Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily.</a> Science. 186 (4162), 407-414 (1974).</li><li>Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+proteins:+Catalase.">Electron diffraction of wet proteins: Catalase.</a> Science. 177 (4045), 268-270 (1972).</li></ol>

Er worden nieuwe mogelijkheden geboden om de huidige liquid-EM-workflows te stroomlijnen door gebruik te maken van nieuwe geautomatiseerde tools en technologieën die zijn aangepast aan het cryo-EM-veld. Toepassingen met betrekking tot de nieuwe microchip sandwichtechniek zijn belangrijk met betrekking tot andere methoden omdat ze beeldvormingsanalyse met hoge resolutie in vloeibaar of glasachtig ijs mogelijk maken. Een van de meest kritieke stappen in het protocol is het produceren van monsters met de ideale vloeistofdi...

Biomedisch onderzoek verbetert ons begrip van de menselijke gezondheid en ziekte door de ontwikkeling van nieuwe technologieën. Beeldvorming met hoge resolutie transformeert ons beeld van de nanowereld - waardoor we cellen en moleculen in prachtig detailkunnen bestuderen 1,2,3,4,5. Statische informatie van dynamische componenten zoals zachte polymeren, eiwitassemblages of menselijke virussen onthult slechts een beperkte momentopname van hun complexe verhaal. Om beter te begrijpen hoe moleculaire entiteiten werken, moeten hun structuur en functie gezamenlijk worden onderzocht.
Recente ontwikkelingen in de productie van materialen zoals atomair dun grafeen of op silicium gebaseerde microchips bieden nieuwe mogelijkheden voor real-time structuurfunctieanalyse met behulp van transmissie-elektronenmicroscopen (TEMs). Deze materialen kunnen hermetisch afgesloten kamers creëren voor live EM-beeldvorming 6,7,8,9,10,11. Het nieuwe veld van liquid-EM, de kamertemperatuurcorrelecorrel met cryo-EM, biedt ongekende weergaven van harde of zachte materialen in oplossing, waardoor wetenschappers tegelijkertijd de structuur en dynamiek van hun monster kunnen bestuderen. Liquid-EM-toepassingen omvatten real-time opnames van therapeutische nanodeeltjes die interageren met kankerstamcellen en veranderingen in de moleculaire fijne kneepjes van virale pathogenen 12,13,14.
Net zoals methodologische vooruitgang de resolutierevolutie op het gebied van cryo-EM heeft gestimuleerd, zijn nieuwe technieken en methoden nodig om het gebruik van liquid-EM als een high-throughput tool voor de wetenschappelijke gemeenschap uit te breiden. Het algemene doel van de hier gepresenteerde methoden is om de protocollen voor de voorbereiding van vloeibare EM-monsters te stroomlijnen. De reden achter de ontwikkelde technieken is om nieuwe microchipontwerpen en autoloader-apparaten te gebruiken, geschikt voor zowel vloeistof- als cryo-EM-gegevensverzameling (figuur 1) 7,14,15,16,17. De assemblages worden mechanisch afgedicht met behulp van standaard rasterclips voor geautomatiseerde instrumenten, zoals de Krios, die plaats biedt aan meerdere monsters per sessie of een F200C TEM (figuur 2). Deze methodologie breidt het gebruik van beeldvorming met hoge resolutie verder uit dan standaard cryo-EM-toepassingen die bredere doeleinden voor real-time materiaalanalyse demonstreren.
In het huidige videoartikel worden protocollen gepresenteerd voor het bereiden van virusassemblages in vloeistof met en zonder in de handel verkrijgbare monsterhouders. Met behulp van de gespecialiseerde monsterhouder voor liquid-EM kunnen dunne vloeibare monsters structurele informatie bieden die vergelijkbaar is met cryo-EM-monsters, evenals dynamische inzichten van de monsters. Ook worden methoden gedemonstreerd voor het voorbereiden van vloeibare monsters met behulp van autoloader-gereedschappen voor routines met hoge doorvoer. Het grote voordeel ten opzichte van andere technieken is dat geautomatiseerde monsterproductie de gebruiker in staat stelt om zijn monsters snel te beoordelen op optimale dikte en elektronendosering voorafgaand aan het verzamelen van gegevens. Deze screeningstechniek identificeert snel ideale gebieden voor real-time opnames in vloeistof of ijs 12,14,18,19. Met het oog op de bepaling van de 3D-structuur kan liquid-EM een aanvulling vormen op de reeds lang bestaande cryo-EM-methoden die in cryo-EM zijn geïmplementeerd. Lezers die conventionele TEM- of cryo-EM-technologieën gebruiken, kunnen overwegen om liquid-EM-workflows te gebruiken om nieuwe, dynamische observaties van hun monsters te bieden op een manier die hun huidige strategieën aanvult.
Virusmonsters die in dit protocol worden gebruikt, omvatten gezuiverde adeno-geassocieerde virussubtype 3 (AAV) verkregen als een geschenk en gekweekt onder standaardomstandigheden12. Ook werden niet-infectieuze SARS CoV-2 subvirale assemblages gebruikt die zijn afgeleid van het serum van COVID-19-patiënten12 en verkregen uit een commerciële bron. Ten slotte werden gezuiverde simian rotavirus (SA11-stam) dubbellaagse deeltjes (DLPs) verkregen uit het laboratorium van Dr. Sarah M. McDonald Esstman aan de Wake Forest University en gekweekt met behulp van standaardomstandigheden 6,17. Softwarepakketten die hier worden beschreven, zijn vrij beschikbaar en de koppelingen zijn beschikbaar in de sectie Materiaaltabel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A11-1</td>
			<td>1 Liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoloader clipping tool</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Also SubAngstrom supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoloader grid clips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>top and bottom clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon-coated gold EM grids</td>
			<td>Electron Microcopy Sciences</td>
			<td>CF400-AU-50</td>
			<td>400-mesh, 5-nm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVID-19 patient serum</td>
			<td>RayBiotech</td>
			<td>CoV-Pos-S-500</td>
			<td>500 microliters of PCR+ serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A412-1</td>
			<td>1 Liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwell-integrad microchips</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>EPB-42A1-10</td>
			<td>10x10-mm window arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMWindows microchips</td>
			<td>Simpore Inc.</td>
			<td>SN100-A10Q33B</td>
			<td>9 large windows, 10-nn thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMWindows microchips</td>
			<td>Simpore, Inc.&#160;</td>
			<td>SN100-A05Q33A</td>
			<td>9 small windows, 5-nm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top microchips</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>EPT-50W</td>
			<td>500 mm x 100 mm window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #1 filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001 090</td>
			<td>100 pieces, 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectView direct electron detector</td>
			<td>Direct Electron</td>
			<td></td>
			<td>6-micron pixel spacing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 3 EC direct electron detector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>14-micron pixel spacing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 655 Dry pump station</td>
			<td>Gatan, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Pump holder tip to 10-6 range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark IV Vitrobot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>state-of-the-art specimen preparation unit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow, glow discharge unit</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Negative polarity mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poseidon Select specimen holder</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;FEI compatible;specimen holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos F200C TEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>200 kV; Liquid-TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios G3</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>300 kV; Cryo-TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freely available software</td>
			<td>Website link</td>
			<td></td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryoSPARC</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
			<td>other image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND4</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
			<td>CTF finding program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
			<td>molecular structure analysis software package</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advancing high-resolution imaging of virus assemblies in liquid and ice

De interesse in vloeistof-elektronenmicroscopie (liquid-EM) is de afgelopen jaren omhooggeschoten omdat wetenschappers nu real-time processen op nanoschaal kunnen observeren. Het is uiterst wenselijk om cryo-EM-informatie met hoge resolutie te koppelen aan dynamische waarnemingen, omdat veel gebeurtenissen zich op snelle tijdschalen voordoen - in het millisecondebereik of sneller. Verbeterde kennis van flexibele structuren kan ook helpen bij het ontwerpen van nieuwe reagentia om opkomende pathogenen, zoals SARS-CoV-2, te bestrijden. Wat nog belangrijker is, het bekijken van biologische materialen in een vloeibare omgeving biedt een unieke glimp van hun prestaties in het menselijk lichaam. Hier worden nieuw ontwikkelde methoden gepresenteerd om de nanoschaaleigenschappen van virusassemblages in vloeibaar en glasachtig ijs te onderzoeken. Om dit doel te bereiken, werden goed gedefinieerde monsters gebruikt als modelsystemen. Vergelijkingen van monstervoorbereidingsmethoden en representatieve structurele informatie worden naast elkaar gepresenteerd. Sub-nanometerkenmerken worden weergegeven voor structuren die zijn opgelost in het bereik van ~ 3,5-Å-10 Å. Andere recente resultaten die dit complementaire kader ondersteunen, omvatten dynamische inzichten van vaccinkandidaten en op antilichamen gebaseerde therapieën afgebeeld in vloeistof. Over het algemeen bevorderen deze correlatieve toepassingen ons vermogen om moleculaire dynamica te visualiseren en bieden ze een unieke context voor hun gebruik in de menselijke gezondheid en ziekte.

Een vloeistof-TEM die op 200 kV werkte, werd gebruikt voor alle vloeistof-EM-beeldvormingsexperimenten en een cryo-TEM die op 300 kV werkte, werd gebruikt voor alle cryo-EM-gegevensverzameling. Representatieve afbeeldingen en structuren van meerdere virussen worden gepresenteerd om het nut van de methoden bij verschillende proefpersonen aan te tonen. Deze omvatten recombinante adeno-geassocieerde virussubtype 3 (AAV), SARS-CoV-2 subvirale assemblages afgeleid van het serum van de patiënt en simian rotavirus dubbellaagse...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice at JoVE.com

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Hier worden protocollen beschreven om virusassemblages voor te bereiden die geschikt zijn voor vloeistof-EM- en cryo-EM-analyse op nanoschaal met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie.

Geavanceerde beeldvorming met hoge resolutie van virusassemblages in vloeistof en ijs

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...

De belangstelling voor vloeibare elektronenmicroscopie is de afgelopen jaren omhooggeschoten, omdat we nu realtime processen op nanoschaal kunnen visualiseren. Verbeterde kennis over deze flexibele structuren kan ons helpen bij het ontwikkelen van nieuwe reagentia om opkomende pathogenen zoals SARS-CoV-2 te bestrijden. Het bekijken van eiwitten in een vloeibare omgeving helpt om biologische systemen na te bootsen en geeft ons de mogelijkheid om op een meer dynamische manier naar de eiwitten te kijken.En dit experiment laat je nieuwe technieken zien over het gebruik en de visualisatie van eiwitten in zowel glasachtig ijs als vloeibare omgevingen. Recente resultaten omvatten dynamische inzichten van vaccinkandidaten in op antilichamen gebaseerde therapieën afgebeeld in vloeistof. Correlatieve vloeibare en cryo-EM-toepassingen bevorderen ons vermogen om moleculaire dynamica te visualiseren en bieden een unieke context voor menselijke gezondheid en ziekte.Lezers die conventionele TEM- of cryo-EM-technologieën gebruiken, kunnen overwegen vloeibare EM-workflows te implementeren om nieuwe dynamische observaties van hun monsters te bieden op een manier die hun huidige strategieën aanvult. In de handel verkrijgbare liquid-EM-systemen kunnen flow, mixing, elektrochemische stimuli en temperatuurregeling bieden, die essentieel zijn voor veel realtime beeldvormingstoepassingen. De hier gepresenteerde microchip sandwichmethode beschrijft een eenvoudige manier om eerst monsters in vloeistof te bekijken voordat de sprong wordt gemaakt naar een complexer commercieel systeem voor in situ experimenten.Reinig om te beginnen de siliciumnitride-microchips door elke chip gedurende twee minuten in 150 milliliter aceton te incuberen, gevolgd door incubatie in 150 milliliter methanol gedurende twee minuten. Laat chips drogen in een laminaire luchtstroom. Plasma reinigt de gedroogde chips met behulp van een gloeiontladingsinstrument dat gedurende 45 seconden onder standaardomstandigheden werkt met behulp van argongas.Laad vervolgens een droge basismicrochip in de punt van de monsterhouder en voeg ongeveer 0,2 microliter van het monster toe aan de basischip. Na één tot twee minuten incuberen, plaatst u de bovenste chip op de natte basischip met het monster. Plant de assemblage samen om een hermetisch afgesloten behuizing te vormen die mechanisch op zijn plaats wordt gehouden door drie messing schroeven.Pomp de punt tot 10 tot de min zes torr met behulp van een turbogepompt droog pompstation. De houder is nu klaar om in de TEM te worden gestoken. Plasma reinigt de microchips en koolstofroosters met behulp van een gloeiontladingsinstrument gedurende 45 seconden.En voeg ongeveer twee microliter monster toe aan een gloeiende microchip die op een gelverpakking is geplaatst. Verwijder de overtollige oplossing met filterpapier of een pipet en incubeer gedurende één tot twee minuten. Voeg vervolgens het gloeiende koolstofrooster toe aan de natte microchip die het monster bevat.Plant de assemblage samen met behulp van een enkele kantelbare monsterhouder bij kamertemperatuur om een hermetisch afgesloten behuizing te vormen. U kunt ook rasterclips voor automatisch laden gebruiken en de sandwichassemblage op de onderste C-clip plaatsen. Plaats de bovenste clip bovenop de montage en gebruik het standaard klemgereedschap om de montage samen te dichten.Het exemplaar is nu klaar om in de TEM te worden geplaatst. Onderzoek monsters die in autoladers zijn geplaatst onder cryo-omstandigheden of bij kamertemperatuur. Voor liquid-EM-beeldvorming laadt u de monsterhouder in de TEM die is uitgerust met een veldemissiepistool en werkt u op 200 kilovolt.Schakel het pistool in en pas de eucentrische hoogte van het microscoopstadium aan ten opzichte van het monster met behulp van de wobbler-functie, waarbij het monster wordt gekanteld van min 15 graden naar plus 15 graden in de kolom. Deze procedure past het podium in de Z-richting aan de monsterdikte aan en helpt een nauwkeurige vergroting tijdens het opnemen van het beeld te garanderen. Neem afbeeldingen op als lang ingelijste films of individuele afbeeldingen met behulp van het softwarepakket voor seriële gegevensverzameling, waarbij geautomatiseerde beeldroutines worden geïmplementeerd.Verkrijg beelden onder omstandigheden met een lage dosis bij vergrotingen variërend van 28.000x tot 92.000x en 40 frames per seconde. Pas de belichtingstijden aan om stralingsschade aan het monster te minimaliseren en gebruik een onscherptebereik van min één tot vier micrometer bij de opgegeven vergroting. Als er een dikke oplossing wordt aangetroffen, gebruikt u hogere onscherptewaarden of selecteert u een ander interessegebied.Zorg ervoor dat de oplossing aanwezig is in de monsters tijdens de beeldvormingssessie door de elektronenbundel te richten op een opofferingsgebied dat niet wordt gebruikt voor gegevensverzameling totdat bellen zijn gevormd. Analyseer films op SARS-CoV-2-deeltjes met behulp van het RELION-3.0.8-programma of andere beeldverwerkingssoftware. Voer bewegingscorrectie uit met behulp van het MotionCor2-programma.Eenmaal gecorrigeerd, extraheer deeltjes met behulp van de auto-picking tool in het programma softwarepakket. Typische doosformaten zijn 330 pixels voor vloeibare exemplaren en 350 pixels voor ijsmonsters. Bereken de initiële reconstructies met behulp van C1-symmetrie met de 3D-initiële modelroutine van het programma en de ab initio-modelopties in het softwarepakket voor gegevensverwerking.Voer vervolgens verfijningsprotocollen uit in de gegevensverwerkingssoftware. Onderzoek de resultaten met behulp van een softwarepakket voor moleculaire structuuranalyse terwijl u dynamische veranderingen beoordeelt. Een vergelijking van liquid-EM en cryo-EM structuren in adeno-geassocieerd virus subtype drie of AAV wordt hier getoond.De representatieve beelden tonen de structuur van AAV in de oplossing en in ijs. De rotatieweergaven van de AAV VP1-subeenheid die uit de vloeistof- en ijsstructuren wordt geëxtraheerd, worden hier weergegeven. Deze afbeeldingen vertegenwoordigen de dynamische waarden in de vloeibare structuren die worden gegenereerd met behulp van de morph map-functie in de moleculaire structuuranalysesoftware.De gemiddelde structuren van meerdere virusassemblages vertonen conformatieveranderingen met een diameterverandering van bijna 5%, gemeten met behulp van EM-gegevens. Een afbeelding van SARS-CoV-2 subvirale assemblages geïsoleerd uit serumfracties van COVID-19-patiënten wordt hier getoond. Deze witte bubbels duiden op de aanwezigheid van vloeistof in het monster.Een EM-reconstructie van deze subvirale assemblages wordt hier getoond met gekleurde radiale dichtheden op vijf nanometer plakjes door de kaart. De representatieve afbeelding beschrijft de analyse van rotavirus dubbellaagse deeltjes bereid in glasachtig ijs met behulp van de microchip sandwich techniek. Het gebruik van detergentia, glycerol, polyethyleen, glycolen en hoge niveaus van suikers moet worden geminimaliseerd of vermeden voor liquid-EM-beeldvorming.Deze reagentia kunnen artefacten introduceren, overmatig borrelen, hydrolyseproducten en vrije radicalen veroorzaken als gevolg van stralingsschade. Het gebruik van deze protocollen zal wetenschappers in staat stellen om dynamische processen tot in de kleinste details te bestuderen. En dit strekt zich uit over meerdere wetenschapsgebieden, waaronder geneeskunde, levenswetenschappen en materiaalonderzoek.De hier gepresenteerde protocollen beschrijven hoe state-of-the-art tools een opwindend middel kunnen bieden om biologische macromoleculen door nieuwe ogen te visualiseren. Het veld van vloeibare elektronenmicroscopie kan de manier waarop we deze nieuwe virussen bestuderen die een bedreiging vormen voor de menselijke gezondheid, verheffen en misschien zelfs bijdragen aan onze pandemieparaatheidsmaatregelen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identificatie van Plant Ice-bindende eiwitten Through Beoordeling van Ice-herkristallisatie inhibitie en isolatie met behulp van Ice-affiniteitszuivering

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Hoge-resolutie Complexome profilering door Cryoslicing BN-MS analyse

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Ongerichte vloeibare chromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde metabolomics analyse van tarwekorrel

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semi-kwantitatieve analyse van peptidoglycaan door vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

Generatie en assemblage van virusspecifieke nucleocapsiden van het respiratoire syncytiële virus

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Förster Resonantie EnergieOverdracht Metingen in Levende Plantencellen

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...